Bu protokol önemlidir, çünkü organoidlerle başarılı bir şekilde çalışmak ayrıntılarda yatmaktadır ve alan, başkalarının oluşturabileceği net ayrıntılı protokollerden yoksundur. Bu tekniğin en büyük avantajı zaman çizelgesi, düşük biyokütle gereksinimleri ve düşük maliyetli ölçeklenebilirliktir. Çok daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulurken, bu teknik, klinik olarak çevrilebilecek daha kesin bireysel veya kombinasyon tedavilerinin test edilmesine izin vererek akciğer kanseri tedavisinin iyileştirilmesine yardımcı olabilir.
En büyük zorluk, yaygın olarak Matrigel olarak bilinen BME2'nin taşınmasıdır. Değerli organoidlerinizi tanıtmadan önce pipetleme ve sıvı BME2 ile işlem yapmanızı şiddetle tavsiye ederim. Batık BME2 organoid kültürünü, medyayı kültüre dokunmaktan kaçınarak kültür plakalarından dikkatlice aspire ederek ayrıştırarak başlayın.
Altı kuyucuklu bir plakaya kuyu başına iki mililitre rekombinant enzim ekleyerek batık BME2 organoid kültürünü uygun bir rekombinant enzim ile tripsinize edin. BME2'yi tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyerek, hücre kültürü inkübatöründe beş dakika boyunca 37 santigrat derecede plakaları inkübe ederek mekanik olarak kırın. Kuluçkanın sonunda, süspansiyonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 kez G'de santrifüj yapın.
Rekombinant enzim süpernatantını organoid pelet dokunmadan dikkatlice aspire edin ve organoid peleti büyüme ortamında yeniden askıya alın. DNaz 1'i ekledikten sonra, süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 600 kez G'de santrifüj yapın. Organoid pelete dokunmadan ortamı dikkatlice atın ve peleti taze bir büyüme ortamında yeniden askıya alın.
Hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede yeni bir siyah şeffaf alt 96 kuyucuk plakasını 10 dakika boyunca önceden ısıtın, ardından bir hücre analizörü kullanarak hücreleri saymak için PBS'de bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Deney için gereken hücre süspansiyon hacmini hesapladıktan sonra, hücreleri tek hücreli süspansiyondan alikote edin ve daha önce gösterildiği gibi santrifüjleme ile pelet atın. Medya atıldıktan sonra, BME2'de yeniden askıya alınmadan önce hücreleri yaklaşık bir dakika buz üzerinde tutun.
Önceden ısıtılmış siyah berrak alt 96 kuyu plakasını gövdeye doğru eğin ve kuyu başına beş mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlayın, ardından hücre kubbelerini kuyunun saat altı pozisyonunda tohumlayın. 96 kuyu plakasının kenarındaki dış kuyucukları PBS ile doldurun ve hücre kubbelerini kalan iç kuyucuklara tohumlayın. Hücre kültürü laminer akış davlumbazındaki taze tohumlanmış hücre kubbelerini, plakayı hareket ettirmeden beş dakika boyunca inkübe edin, ardından plakayı 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübasyon için hücre kültürü inkübatörüne aktarın.
Organoid içeren tüm kuyucuklara kuyucuk başına 100 mikrolitre büyüme ortamı ve plakanın kenarındaki dış kuyucuklara 100 mikrolitre PBS dikkatlice ekleyin. Organoidleri yedi gün boyunca 37 santigrat derecede kültüre alın, metin yazısında belirtilen yönlere göre ortam değiştirin, organoidlerin büyümesini ışık mikroskobu altında düzenli olarak inceleyin. EGFR mutant küçük hücreli dışı akciğer kanseri organoidlerini tedavi etmek için osimertinib için düşük büyüme faktörü ortamında seri ilaç seyreltmesi hazırlayın.
Düşük büyüme faktörlü medya ve% 0.1 DMSO ekleyerek negatif bir kontrol ekleyin. Organoid plakayı saat yönünde 180 derece döndürün, böylece organoidler artık saat 12 konumunda olacak ve tercihen çok kanallı bir aparat kullanarak büyüme ortamını dikkatlice aspire edin. Kuyu başına 100 mikrolitre kontrol veya ilaç çözeltisi ekleyin.
Tedavi edilen organoidleri beş gün boyunca hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede tekrar inkübe edin. Reaktifi gece boyunca dört santigrat derecede çözerek hayatta kalma tahlilini yapmaya başlayın. Reaktifi kullanımdan önce oda sıcaklığında bir su banyosunda 30 dakika dengeleyin ve ters çevirerek karıştırın.
Her bir oyuğa 100 mikrolitre reaktif ekleyin ve pipet ucu organoid kubbe konumuna yerleştirilerek yukarı ve aşağı pipetle iyice karıştırın. Karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, lizatın yaklaşık 150 mikrolitresini yeni bir beyaz opak alt 96 kuyu plakasına aktarın ve ardından plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 25 dakika daha inkübe edin.
Bir ELISA plaka okuyucu kullanarak ışıltıyı kaydedin. Verileri, plaka düzeninin ve kullanılan ilaçların tüm ham okumalarını ve kayıtlarını içeren uygun bir veri tablosu biçiminde kaydedin. EGFR-mutant pozitif TH107 organoidleri, 56 nanomolar'lık yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu ile osimertinib tedavisine duyarlılık gösterirken, EGFR-mutant pozitif TH116 organoidleri, bir mikromolar'dan daha büyük bir yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu ile osimertinib tedavisine dirençliydi.
EGFR-pozitif TH107 küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücrelerinin duyarlılığına, hücre döngüsü ile ilişkili gen imzalarının ekspresyonunda bir azalma ve apoptoz ile ilişkili gen imzasının ekspresyonunda bir artış da dahil olmak üzere önemli transkripsiyonel değişiklikler eşlik etti. Hassas EGFR-mutant pozitif TH330'un hedeflenen inhibitörlere yanıtı, düşük büyüme faktörü ortamına kıyasla büyüme ortamlarında önemli ölçüde etkilenir. EGFR-mutant pozitif TH330'da kombinatoryal tedaviler tedavi yanıtında artışa neden olmuştur.
Bu yaklaşım, moleküler terapi veya kombinatoryal tedavi rejimleri için kişiselleştirilmiş stratejileri geliştirir. İkincisi, klinik yanıtı derinleştirmek ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için ilaç toleransını ve direnç mekanizmalarını erken hedeflemeye yardımcı olur.
