Reaktif oksijen türlerinin veya ROS'un ölçümü oldukça sorunludur. Bu videoda, fc-gama reseptör çapraz floresan problar ve akış sitometri kullanarak yanıt olarak ROS tekrarlanabilir ölçüm gösterecektir. Bu tekniğin başlıca avantajları, sadece mitojenler veya bilinen ROS indükleyicileri değil, bu yöntemin spesifik antijenik uyaranlarla kullanılması ve titrenin tekrarlanabilirliğidir.
Disregulated ros üretimi kronik granülomatöz hastalık veya CGD gibi birçok hastalığın gelişiminde merkezi bir yerdir. ROS'un doğru bir şekilde ölçülmesi CGD'nin moleküler tanısının bir parçasını oluşturabilir. FC aracılı ROS üretiminin incelenmesi, CGD gibi immün yetmezliklerin incelenmesinde önemlidir, aynı zamanda oto-immün hastalıkların veya çok fazla ROS'un oksidatif stres ve inflamasyona yol açtığı nörodejeneratif hastalıkların incelenmesinde de önemlidir.
Tazbın zamanlaması çok önemli. Ben iyice hazırlamak ve mümkünse sahte bir deney yapmak için ilk kez bu protokolü deneyen birisi tavsiye ederim. Bu yöntemin görsel gösterimi, talın zamanlaması gibi özellikle dikkat gerektiren bir talın adımlarını vurgulamak için çok önemlidir.
Başlamak için, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi koşullu ortam kullanarak kemik iliği türevi makrofajlar hazırlayın. Makrofajları bir gecede astarladıktan sonra, supernatant aspire ve PBS ile bir kez hücreleri yıkayın. Serum düşük serum DMEM aynı hacimde medya değiştirerek hücreleri açlıktan.
Her fare için, bir tabak anti-BSA IgG1 ile tedavi edilirken, diğeri tedavi edilmezse serum açlıktan ölür. İşlenmemiş plakalara sadece düşük serumlu DMEM ekleyin ve tedavi edilen plakalara mililitrebaşına 2,5 mikrogram içeren düşük serumlu DMEM ekleyin. Akış sitometrik kompanse kontrolü olarak hareket etmek için her deneme için bir ek işlenmemiş plaka eklediğinden emin olun.
Plakaları 4 saat 37 santigrat derecede, %5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Dört saatlik kuluçka sırasında, reaktif oksijen türleri probları bir 2X çözeltisi hazırlamak. Gerekli her 10 mililitre düşük serum DMEM için, bir oksidatif stres algılama reaktifi dört mikrolitre ve bir süperoksit algılama reaktifi dört mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, sadece oksidatif stres algılama reaktifi içeren veya sadece süperoksit algılama reaktifini içeren 2X prob çözeltilerini hazırlayın. Dört saatlik kuluçkadan sonra, hücreleri yavaşça kazıyarak, etiketli, beş mililitrelik yuvarlak dipli tüplerde toplayarak hasat edin. Tüpleri 750 kez g olarak beş dakika santrifüj edin.
Hangi hücrelerin murine anti-BSA IgG1 ile tedavi edildiğini takip edin. Daha sonra, tedavi edilen hücrelerden kalan anti-BSA'dan kurtulmak için hücre peletlerini iki mililitre PBS ile yıkayın. Tüpleri 750 kez g olarak beş dakika santrifüj edin.
Daha sonra, PBS aspire ve düşük serum DMEM 600 mikrolitre hücre pelet resuspend. 600 mikrolitrelik hücre süspansiyonundan, önceden etiketlenmiş beş mililitrelik yuvarlak alt tüplere 200 mikrolitre aliquot. İşlenmemiş hücrelerden, uyarılmamış olarak etiketlenmiş tüpler için 200 mikrolitre, pozitif indükleyici etiketli tüpler için 200 mikrolitre ve pozitif indükleyici artı inhibitör etiketli tüpler için 200 mikrolitre alın.
Daha sonra, anti-BSA IgG1 tedavi hücrelerden, FC-gama reseptör crosslinking etiketli tüpler için 200 mikrolitre almak, ve tüpler için 200 mikrolitre FC-gama reseptör crosslinking artı inhibitörü etiketli. Tedavi edilmeyen hücrelerden telafi kontrolleri için kullanılacak, lekesiz olarak etiketlenmiş tüp için 200 mikrolitre, yeşil artı indükleyici kontrolü için 200 mikrolitre ve turuncu artı indükleyici kontrolü için 200 mikrolitre alın. Pyocyanin'i 2X prob çözeltilerinin her birine 1ila 100 oranında seyrelterek 2X pozitif indükleyici çözeltisi hazırlayın.
Daha sonra, mililitre başına iki mikrogram 2X konsantrasyonu elde etmek için 2X prob çözeltisi BSA stok çözeltisini seyrelterek 2X BSA çözeltisi hazırlayın. FC-gama reseptör çapraz bağlama gibi spesifik stimülasyon başlamadan önce, tüm reaktifler ve hücrelerin hazır olduğundan emin olun ve onlar uyarılır sırasına göre buz tüpleri yerleştirin. Otomatik örnekleyicili akış sitometreleri için, sitometrenin bir örneği analiz etmek ve diğerine geçmek için aldığı zamana dikkat edin.
Karıştırma ve sonda yıkama adımlarını eklediğinden emin olun. Zamanlama bu töz için çok önemlidir. Her durumun iyi kontrol edilebilmesi için, stimülasyonun her durum için tam 30 dakika içinde yapılması gerekir.
Hücreleri sırayla uyarın ve akış sitometresi ile örnek alımları arasındaki gecikme süresini birleştirin. Bu noktada manuel kompanzasyon yapıyorsa, oksidatif stres algılama reaktifi ve indükleyici yi içeren 2X prob çözeltisinin 200 mikrolitresini yeşil artı indükleyici olarak işaretlenmiş tüplere ekleyerek telafi için kullanılacak kontrol tüplerini teşvik edin. Daha sonra, 200 mikrolitre 2X prob çözeltisi süperoksit algılama reaktifi ve indükleyici içeren tüpler içine turuncu artı indükleyici işaretli ekleyin.
Karanlıkta hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Akış sitometri yazılımını kullanarak, analiz edilecek kanalları ve parametreleri belirtmekten emin olmak için, kontrol, lekesiz, işlenmemiş, yeşil artı indükleyici ve turuncu artı indükleyici örnekleri için üç örnek dosya oluşturun ve etiketleyin. Ayrıca, istenilen durak koşullarını girin.
Kontrol örnekleri ayarlandıktan sonra, deney örnekleri için benzer bir dosya kümesi oluşturun ve etiketleyin. Şimdi, lekelenmemiş, işlenmemiş örneği çalıştırın. Y ekseninde X ekseninde ileri dağılım için bir nokta çizimi açın ve ölü hücreler ve enkaz hariç ilgi hücrelerinin etrafına bir geçit çizin.
Daha sonra, Ilk floresan belirteci, FL1, X ekseni üzerinde başka bir nokta arsa açmak için bu hücrenin kapısını kullanın, ikinci floresan marker karşı, FL2, Y-ekseni üzerinde. İlk çeyreğin kapısını çizin ve ardından fl1 ile FL2 çiziminin sol alt çeyreğinde olayların görünmesi için kadranda kapıyı ayarlayın. Bittiğinde, yeşil artı indükleyici örnek çalıştırın.
Fl1 ile FL2 çiziminin sol ve sağ alt çeyreğinde olayların görünmesi için voltajı ayarlayın. Ardından, bu telafi matrisini üç örnek dosyaya da uygulayın. Şimdi, portakal artı indükleyici örneğini çalıştırın.
Voltajı, fl1 ile FL2 çiziminin sol üst ve alt alt kadranında görünecek şekilde ayarlayın ve bu telafi matrisini üç örnek dosyaya da uygulayın. Her tazminat dosyasını kontrol edin ve lekesiz, işlenmemiş olayların sol alt kadranda görünmesini, yeşil artı indükleyici olayların sol alt ve sağ kadranda görünmesini ve turuncu artı indükleyici olayların FL1'e karşı FL2 arsasının üst ve alt sol kadranda görünmesini sağlayın. Ardından, tüm deneme örnek dosyalarına telafi matrisi uygulayın.
Manuel kompanzasyon yapıldıktan ve deneysel bir şablon alındıktan sonra deneysel numunelere geçin. Pozitif bir indükleyici ile hücreleri tedavi veya FC-gama reseptör hücre stimülasyon iletmeden önce, tüpler bir ROS inhibitörü alacak işareti. Bu hücreleri, pozitif indükleyici veya FC-gama reseptör stimülasyonundan en az 30 dakika önce, beş milimonun son konsantrasyonu için 200 mikrolitre resuspended hücreye inhibitör mikrolitresini ekleyerek ROS inhibitörü ile tedavi edin.
Uyarılmamış hücreler için, hücreleri 2X prob çözeltisinin 200 mikrolitresi ile, lekeli, uyarılmamış olarak etiketlenmiş 200 mikrolitre hücre süspansiyonuna herhangi bir uyarıcı eklenmeden tedavi edin. Pozitif kontroller için, pozitif indükleyici veya pozitif indükleyici artı inhibitör etiketli hücre süspansiyon 200 mikrolitre için 2X pozitif indükleyici çözeltisi 200 mikrolitre ile hücreleri tedavi. Son olarak, FC-gama reseptör crosslinking tarafından uyarılmış hücreler için, 2X BSA çözeltisi 200 mikrolitre ile tedavi 200 hücre süspansiyon 200 mikrolitre fc-gama reseptör crosslinking veya FC-gamma reseptör crosslinking plus inhibitörü etiketli.
Karanlıkta hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, ilk telafi adımları sırasında oluşturulan akış sitometresini ve analiz şablonlarını kullanarak numuneleri uyarıldıkları sırada analiz edin. Burada gösterilen veriler, fc-gama reseptörü aracılığıyla makrofajların uyarılmasından kaynaklanan reaktif oksijen türlerinin üretiminin akış sitometrik saptanmasını göstermektedir.
Fc-gama reseptör çapraz bağlama ajanı ile uyarıldığında fl1 ve FL2 floresansında belirgin bir artış vardır. Fc-gama reseptör çapraz bağlama önce hücreleri reaktif oksijen türleri inhibitörü ile tedavi edildiğinde, bu artan floresan bazal seviyelere geri getirilir. Buna karşılık, bu nokta çizimler fc-gama reseptör stimülasyonu sonucu suboptimal reaktif oksijen türleri üretimi gözlendi başarısız bir deney mevcut.
Beklenen yüzdeler veya MFI artışları arasındaki büyük farkları vurgulamak için, bu veriler FL1 ve FL2 floresanlarında en az artış gösteren örneklerin neye benzediğini gösterir. Geçerli protokol 24 saatlik bir astar adımı kullanır. 24 saatlik bir primleme süresi ile 48 saatlik bir astarlama süresini karşılaştırırken, yeşil oksidatif stres reaktifi için pozitif hücrelerin yüzdesi arasında belirgin bir fark yoktu.
Ancak, 48 saat priming süresini artırmak turuncu floresan için pozitif hücrelerin yüzdesi arttı. Bu yordamı gerçekleştirirken hatırlanması gereken en önemli şey önceden planlama ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tahkikat zamanlaması hakkında tutarlı olmaktır.
