Hücre adezyonunu teşvik etmek için kompleman protein C1q ve hyaluronik asit arasındaki etkileşimi değerlendirmek için kapsamlı bir prosedür. Yakın zamanda doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kompleman bileşeni C1q bir molekülün yüksek tümör ve plasenta mikroortamda ifade ve ekstrasellüler matriks bileşeni ile etkileşim edebildiğini tanımlanmıştır. Bu durumda, hyaluronik asit.
Ekronomik ortamda proteinlerin biyolojik fonksiyonlarını incelemek için bir yöntem öneriyoruz. Bu moleküllerin hücre dışı matriks faktörlerinin hücre bölünmesi özelliklerini şekillendirme yeteneğini araştırmak için. Bu etkileşimin çevre dokusunda bulunan hücreler tarafından nasıl hissedildiğini incelemek için, insan dokularından elde edilen ikili hücrelerin hücre dışı matrikse bağlı C1q'a yapışmasına izin verilen bu kolay yöntemi, bu durumda hyaluronik asit.
Kaplama işlemi için ilk adım, yüksek molekül ağırlıklı hyaluronik asitin 96 iyi doku kaplı mikroplakaya bağlanmasıdır. Kaplama için, hyaluronik asit mililitre başına 15 mikrogram konsantrasyonda 0,1 mol karbon tampon PH 9.6 seyreltilir. Ve yavaşça borulama homojen bir çözüm elde etmek için requited olduğunu.
Kuyuları kaplamak için çözeltinin 100 mikrolitresi kullanılır. Plaka daha sonra bir gecede dört santigrat derece ye aktarılır. Ertesi gün vakum tedavi kuyuları aspire.
DPBS ile bir kez yıkayın. İlgili kuyulara C1q veya BSA ekleyin. C1q günümüzde ticari olarak mililitre başına bir miligram konsantrasyonda mevcuttur ve mililitre başına 25 mikrogram konsantrasyonda seyreltilir.
Ve dPBS içeren 0.5% BSA ve 0.7 milimols kalsiyum ve magnezyum ve divalent katyonlar. BSA LPS ücretsiz% 0.5 konsantrasyonda kullanılır ve tarih PBF. Plaka daha sonra bir gecede dört santigrat derece ye aktarılır.
Immobilize hyaluronik asit ile C1q doz bağımlı etkileşimleri enzim bağlı immün SA tarafından belirlenir. Hızlı DiI ile etiketleme hücreleri. Lipophilic tracer hızlı DiI ilgi hücreleri etiketlemek için kullanılır. DPBS'de yeniden askıya alınan hücreler mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonunda kullanılır.
Hızlı DiI doğrudan hücre süspansiyon içine 1-100 seyreltilir. Hücre süspansiyonu elle karıştırılır ve 37 derecede 15 dakika aktarılır. Beş dakika kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonunu karıştırın ve bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
Hızlı DiI fazlalığı kaldırmak için, dPBS 10 mililitre ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pivot ve yedi dakika boyunca 250 g santrifüj. 0.1% BSA varlığında insan endophilical serum serbest ortamda bir mililitre hücre pelet resuspend.
Hyaluronik asit C1q matrisler üzerinde hücre yapışma. Vakum kaplı kuyulardan dPBS aspire. 100 mikrolitre etiketli hücre süspansiyonu kaplamalı kuyulara dağıtın.
Standart eğri üretimi için kullanılmak üzere ependure tüpünde 200 mikrolitre etiketli hücre parçalanır. Plakayı 37 derecede 35 dakika kuluçkaya yatırın. Kuvözdeki tabağı çıkar.
Dengesiz hücreleri yavaşça aspire edin. %0,5 BSA ve 0,7 milimol kalsiyum ve magnezyum içeren dPBS ile bir kez yıkayın. Lys yapışık hücreleri 200 mikrolitre lysis tampon ekleyerek.
Aynı zamanda lysis tampon etiketli hücrelerin bir ila iki seri seyreltme üzerine standart eğri hazırlamak. Floresan sinyalinin sonsuz F 200 T-can cihazında uyarma dalga boyu olarak 544 nanometre ve emisyon dalga boyu olarak 590 nanometre kullanarak okunmasını gerçekleştirin. Temsili sonuçlar.
Temsili sonuçlardan da anlaşıldığı gibi, hyaluronik asit üzerindeki hücre adezyonunun C1q'u tek başına HA veya HA'ya bağlı BSA ile karşılaştırıldığında güçlü bir şekilde geliştirilmiş olduğu açıktır. Her matristeki yapışık hücrelerin yüzdesi standart eğriye göre hesaplanır. Sonuç. Deneylerimizde öncelikle kompleman bileşeni C12'nin bu durumda hyaluronik asidi arisal bir metal kullanarak ekstrasellüler matriks bağlama yeteneğini değerlendirdik.
İkinci olarak, floresan boya ile boyanmış insan birincil hücrelerinin bağlı hyaluronik asit takibini yapmak için yeteneğini analiz ettik. Bu çalışmada önerdiğimiz model, bu hücresel yanıtın uyaranların bir kombinasyonuna karşı değerlendirilmesi için hücre dışı matris iskelelerin 3Boyutlu modeline alternatif olarak daha kolay ve daha ucuz bir yöntemdir.
