Hyaluronik asit, hayvan modelinde en bol bulunan hücre dışı matrikslerden biridir. Hyaluronik asidin embriyonik gelişimdeki önemi gösterilmiştir. Bu in vitro model, nöral krest hücrelerinin hyaluronik asit bakımından zengin hücre dışı matriks içinde nasıl yapıştığını ve göç ettiğini keşfetmek için yararlıdır.
Tekniğimiz ile hem toptan sümperasyonun hem de daha sonra bireysel hücrelerin zaman içinde migrasyonunu ve HA bozunma kabiliyetini değerlendirebiliriz. Ek olarak, bu teknik, HA bozulmasını hızlandıran veya önleyen bileşiği bulmak için ilaç taraması için kullanılabilir. Başlamak için, bazal membran matrisini soğutulmuş PBS ile 1:50 oranında seyreltin ve buz üzerinde tutun.
10 santimetrelik bir kültür plakasını 10 mililitre seyreltilmiş matris çözeltisi ile kaplayın ve plakayı bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Plakayı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Matriks kaplı plaka üzerindeki O9-1 hücrelerini kültürlemek için, tüm embriyonik kök veya ES hücre ortamını 37 santigrat derecede bir su banyosunda ısıtın.
O9-1 hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın. Ardından, hücre konsantrasyonunu tam ES hücre ortamı ile mililitre başına 1.1 milyon hücreye ayarlayın. Matris kaplı 10 santimetre kültür plakasına sekiz mililitre önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve O9-1 hücrelerini plaka başına 1.1 milyon hücrede tohumlayın.
% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ortamı 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış taze tam ES hücre ortamı ile değiştirin. Bundan sonra her iki ila üç günde bir taze ortamla değiştirin.
Kültür plakasını iki mililitre PBS ile yıkayın ve ardından iki mililitre önceden ısıtılmış% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyin. 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin. Kültür plakasına iki mililitre önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve ayrışmış hücreleri 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Tüpü beş dakika boyunca 300g'de santrifüj edin ve hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı atın. Tüpe iki mililitre önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve pipetleme ile hücreleri iyice askıya alın. Daha sonra hücreleri istenen hücre yoğunluğunda yeni bir kültür plakasına tohumlayın.
3,5 santimetrelik cam tabanlı bir kaba dikkatlice 50 mikrolitre seyreltilmemiş trietoksisilan ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Çanağı iki mililitre damıtılmış suyla üç kez yıkayın ve yemek başına PBS'de 100 kez seyreltilmiş 50 mikrolitre% 0.25 glutaraldehit ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin, ardından iki mililitre PBS ile dört kez yıkayın ve bulaşıkları bir saat boyunca oda sıcaklığında 0.2 normal asetik asitte bir tane olmak üzere 300 mikrolitre kollajen tipi kollajen ile kaplayın.
Yine, iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Her yemeğe mililitre floreseinamin başına 300 mikrolitre 200 mikrogram, sodyum hyalüronat H2 etiketli ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. İki mililitre PBS ile üç kez tekrar yıkayın.
Kaplanmış cam taban kabını kuruttuktan sonra, iki kuyu kültürü ekini bulaşıklara takın ve uçları harici olarak bir mililitre PBS ile doldurun. O9-1 hücrelerini, kesici uç başına% 2 fetal sığır serumu veya FBS içeren 100 mikrolitre DMEM'de 10.000 hücredeki kuyucuklara tohumlayın. Hücreleri% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde iki gün boyunca 37 santigrat derecede kültürleyin, hepsi bir arada floresan mikroskobu kullanarak başlangıç zamanı noktası olarak faz kontrast görüntüleri yakalayın.
Uçları cımbızla kaplanmış cam tabanlı tabaklardan dikkatlice çıkarın ve hücreleri ve hücre kalıntılarını temizlemek için kaplanmış cam tabanlı tabakları iki mililitre PBS ile hafifçe yıkayın. Kültürlü yemeklere% 2 FBS içeren iki mililitre taze DMEM ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 48 saat daha kültürleyin ve kültürde 24 saat ve 48 saat sonra faz kontrast görüntüleri yakalayın.
Bulaşıkları PBS ile yıkayın ve hücreleri 48 saat sonra bir mililitre% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 15 dakika veya gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Daha sonra bulaşıkları beş dakika boyunca üç kez, her biri bir mililitre taze PBS ile yıkayın. Son olarak, daha fazla morfolojik gözlem için montaj ortamına bir kapak kayışı yerleştirin.
E9.0'daki Tmem2 bayrak embriyolarının nöral tüpünün enine kesitleri bu şekilde gösterilmiştir. Nöral tüpün kraniyal ve gövde seviyelerindeki bölümler Tmem2 bayrak proteini ve hyaluronan için çift etiketlendi. Nöral plakada ve nöral tüpün sınır bölgesinde Tmem2 ekspresyonu gözlenirken, bu bölgeler hyaluronan boyamadan yoksundu.
Tmem2 bayrağı ve Sox9 için nöral tepe hücrelerinin çift etiketlenmesi burada gösterilmiştir. E9.0 nöral tüpün enine kesitleri Tmem2 bayrağı ve Sox9 için boyandı. Tmem2'nin tükenmiş ve normal bir kültür kabında kültürlenmiş O9-1 hücrelerini kontrol eden temsili görüntüleri bu şekilde gösterilmiştir.
Bu hücrelerdeki Tmem2 ekspresyonu, normalizasyon için bir iç kontrol olarak GAPDH ile qPCR ile değerlendirildi. Tmem2 tükenmiş ve kontrol edilen O9-1 hücreleri, floresanlı hyaluronan ile kaplanmış cam kapak fişleri üzerinde 48 saat boyunca kültürlendi. Hyaluronan parçalayıcı aktivite, floresan arka planda karanlık alanlar olarak ortaya çıkar.
Hyaluronan bozunma seviyesi de Tmem2 tükenmiş ve kontrol O9-1 hücreleri arasında kantitatif olarak karşılaştırıldı. Substrata bağlı hyaluronanın O9-1 hücrelerindeki fokal adezyonlardaki bozunması bu şekilde gösterilmiştir. Col1 / HA'dan oluşan karışık substratlar üzerinde kültürlenen O9-1 hücreleri, bir anti-vinkülin antikoru ile immün olarak etiketlendi.
Koyu lekeler veya çizgiler, FAHA H2 substratındaki hyaluronan bozunma aktivitesini temsil eder. Hyaluronan bozunma ve fokal adezyon bölgeleri karışık substratlar üzerinde birlikte lokalize edildi. Cam tabanlı tabakların HA ile kaplanması protokolde kritik bir adımdır, çünkü yetersiz kaplama, HA'nın yapışma ve göç sırasında mekanik kuvvetle kolayca çıkarılmasına neden olabilir.
Doğru kaplamayı sağlamak için, glutaraldehit, kimyasal olarak hareketsiz hale getirilmiş tip bir kollajeni, aldehitle kollama bağlantısı yoluyla cama kullanıyoruz. Tip bir kollajenin yanında hücre dışı matriks substratı kullanmak mümkündür, ancak silahlanma gruplarına sahip olmaları gerekir ve kimyasal özelliklerinden dolayı cam tabanlı tabaklara kaplanmış olmaları için kapolar kaplamalarda sınırlamalar olabilir. Bu yüzden en iyi yaklaşımı belirlemek için deneme yanılma gerekli olabilir.
Bu laboratuvar deneyi, nöral krest hücrelerinin nöral tüp etrafındaki HA veya HA ortamına hareketi sırasında belirli moleküllerin nasıl çalıştığını incelemede yardımcı olabilir. Ayrıca, bu göç sürecini hızlandırabilecek veya önleyebilecek ilaçları test etmenin yararlı bir yolu olabilir. Tmem2'nin neden hem HA üzerinde yapışma hem de HA'nın bozunması işlevlerine sahip olduğunu ve HA'nın neden tam uyum bölgesinde parçalanması gerektiğini bilmek ilginçtir.
HA, hücre dışı matriksteki en yaygın madde olduğundan, bu sorunun cevabını bulmak biyoloji ve tıpta gerçekten önemlidir. Bu deneysel protokol değerlidir çünkü cilt fibroblastları, epitel hücreleri ve kanser hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir.
