Bu yöntem, maya hücrelerindeki yapıları birkaç dakika boyunca üç boyutlu olarak izleyerek hücre içi organellerin ve bölmelerin dinamiklerini incelememizi sağlar. 4D görüntüleme, özellikle geçici olabilecek yapılar veya belirteçler için hücre içi dinamikler hakkında güvenilir sonuçlar çıkarabildiğimizi sağlar. Prosedürü gösteren Natalie Johnson, laboratuvarımdan bir doktora sonrası.
23 santigrat derece, iyi havalandırma ile 15 mililitre baffled şişesinde floresan olmayan sentetik tanımlı veya NSD, orta, beş mililitre ilgi maya suşu bir gecede kültür büyüyerek başlayın. Analizden üç ila dört saat önce, logaritmik faz maya kültürünü taze NSD ortamında seyreltin, böylece 600 nanometre veya OD600'deki son optik yoğunluk görüntüleme sırasında 0,5 ila 0,8 olacaktır. Kültür hazır olmadan en az bir saat önce, mililitre Concanavalin Bir çözelti santigrat iki miligram bir aliquot tam hızda beş dakika için, herhangi bir partikül pelet ve temiz bir 35 milimetre cam alt mikroskobik çanak içine supernatant 250 mikrolitre ekleyin.
15 dakika sonra, çanak yıkama başına iki mililitre distile su ile 2-3 kez yıkayın, kuruduktan sonra Concanavalin A kaplı çanak maya kültürünün 250 mikrolitre ekleyerek. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için 10 dakika bekleyin, yavaşça taze NSD orta iki mililitre ile çanak 2-3 kez daha yıkamadan önce. Sonra taze NSD iki mililitre ile hücreleri kaplayın.
Maya hücrelerini görüntülemek için, konfokal ışık mikroskobunda en az 1,4 sayısal diyafram açıklığına sahip 63X yağ daldırma lensi seçin. Burada, 100X objektif lens yerine 63X objektif lens de kullanılabilir. Sonra, daldırma yağı ile benekli objektif lens, çanak yerleştirin.
Edinme Modu sekmesinin açılır menüsünden xyzt'yi seçin. XY sekmesialtında, çerçeve boyutunu 128 yüksekliğe göre 256 genişliğe biçimlendirin. Genellikle sekiz kilohertz sırasına göre maksimum taramalar hızını kullanın.
Varsa çift yönlü X taramasını açın ve yaklaşık 80 nanometre piksel boyutuyla sonuçlanacak yakınlaştırma faktörünü dokuza ayarlayın. 100X hedefi kullanılırsa, yaklaşık 80 nanometrelik bir piksel boyutunu korumak için yakınlaştırma faktörünün buna göre ayarını ayarlayın. Sonra hat birikimini dört ya da altı olarak ayarlayın.
İğne deliğini 1,2 Havadar ünitelere ayarlayın ve varsa beyaz ışık lazerini açın. Daha sonra her floresan kanalı için uyarma dalga boyu ve yüzde lazer gücü ayarlayın. Varsa, maksimum tümleştirme süresini seçerek yapılandırma sekmesi altında foton sayma modunun kullanımını etkinleştirin.
Her floresan kanalı için yüksek hassasiyetli bir dedektör atayın, emisyon dalga boyu aralığını ayarlayın ve varsa foton sayma modunu açın. Cam çankırıdaki yansıyan ışığı yakalamamak için her floresan kanalı için zaman gating penceresini 0,6 ila 10 nanosaniye olarak ayarlayın. Ardından, parlak alan görüntülemeyi açın ve veri toplama için düşük hassasiyet lidedektörünü seçin.
Canlı görüntüleme modunu açın ve hücreler açıkça görülene kadar parlak alan kanalındaki kazancı açın. Foton sayma modundaysanız, floresan sinyalini görüntülemek için gri değerlerin aralığını manuelden otomatike değiştirin. Maya hücrelerinin tüm hacmini görüntülemek için Z yığınını ayarlayın ve aşağı kapak kayma doğru hareket eder gibi görüntüleme yönlülüğünü belirtin.
Z-stack başına yaklaşık 20 ila 25 optik kesit elde etmek için Z adım aralığını 0,25 ila 0,35 mikrometreye ayarlayın ve varsa Galvo Akışını açın. Tipik bir film için, Z yığınları arasındaki zaman aralığını iki saniyeye ayarlayın ve film süresini beş ila 10 dakikaolarak ayarlayın. Ardından filmi LIF dosyası olarak kaydedin.
Film deconvolution için, klasik maksimum olasılık tahmin algoritması kullanan uygun bir deconvolution yazılım programı başlatın ve veri serisini açın. Görüntüleme parametrelerinin algılanıp doğru görüntülendiğini doğrulamak için deconvolution sihirbazını ve parametre düzenleyicisini seçin. Katıştırma orta kırılma indeksinin değerini maya sitoplazmasını yaklaşık olarak 1,4 olarak değiştirin.
Daha sonra kapak kayma konumunu tahmin etmek için editörü kullanın. Doğrulanmış tümünü ayarla'yı seçin ve Kabul Et'i tıklatın ve sihirbazı girin'i seçin. Nokta yayma işlevi seçimini atlamak ve ön işleme aşamalarını kırpmak için sonraki oku tıklatın ve her floresan kanalı için deconvolution sihirbazı ile devam edin.
İşlem logaritmik dikey eşleme işlevini seçin ve ham veri floresan yoğunluğu profilini inceleyin. Kılavuzu arka plan tahmini modu olarak ayarlayın, bir arka plan değeri girin ve Kabul et'i tıklatın. Maksimum yineleme değerini 40'ta bırakın ve tahmini bir sinyali gürültü oranına girin.
Sonra çamaşır suyu düzeltme kapatın ve Deconvolve tıklatın. Ses loş yapılardaki gerçek floresan ortadan kaldırılmadan gürültü yeterince kaldırılırsa, deconvolution sonuç penceresinde bir sonraki kanala kabul et'i seçin. Floresan kanalların tümü tatmin edici bir şekilde deconvolved edildikten sonra, Tüm yapılanı tıklatın ve kırmızı kanalı ilk olarak düzenleyin, ardından imagej'de sonraki düzenleme için yeşil, mavi ve parlak alan kanalları takip edin.
Ardından görüntü dizisini sekiz bitlik tif dosyası olarak kaydedin ve kanal başına bir dosya seçin ve dönüştürme modu olarak kontrast uzantısı. Ağartıcı düzeltme için, dekonvolved görüntü dizilerini ImageJ'e aktarın ve görüntüleri bir hiper yığına dönüştürmek için Resim, Hyperstack ve Stack'i Hyperstack'e tıklayın. Açılan menüden xyzct'i seçin ve kanal sayısını, Z yığını dilimlerini ve zaman dilimlerini girin.
Fotoğraf beyazlatma için floresan kanallarını düzeltmek için Görüntü, Renk, Split Kanalları ve floresan kanallar için Eklentiler, EMBLtools, Bleach Düzeltme ve Üstel Sığdır'ı seçin. Ardından, parlak alanı birleştirmek ve floresan kanallarını bir hiperyığında birleştirmek için Görüntü, Renk ve Birleştirme Kanalları'nı seçin ve sonraki film oluşturma ve düzenleme için deconvolved ve beyazlatma düzeltilmiş hiperyığını sekiz bitlik TIF dosyası olarak kaydedin. Deconvolved ve ağartılmış düzeltilmiş veri kümesini ölçekli bir montaja dönüştürmek için Eklentiler, IJ_Plugins ve Montaj Serisi Yapın'ı seçin ve ilgili sekiz bitlik hyperstack'i seçin.
Tüm dilimlerin montaj oluşturmak için kullanılacağını kabul etmek için Aç ve Tamam'ı tıklatın ve önerilen ölçek faktörü değerini kabul etmek için yeniden Tamam'ı tıklatın. Orijinal montajı sekiz bitlik TIF dosyası olarak kaydedin ve tüm zaman dilimlerini içeren orijinal montajdan 4D hyperstack oluşturmak için Eklentiler, IJ_Plugins, Montaj Serilerinden Hyperstack ve Tamam'a seçin. Orijinal ortalama öngörülen filmi oluşturmak için, ZProjection varsayılan parametrelerini kabul etmek için önce Eklentileri, IJ_Plugins, Project Hyperstack'i ve Tamam'ı seçin.
Yansıtılan ortalama filmi sekiz bitlik TIF dosyası olarak kaydedin ve etiketleme süreleri boyunca izlenebilen tek tek yapıları belirlemek için filmi inceleyin. Film boyunca güvenilir bir şekilde izlenebilen bir yapının tanımlanması ve bu yapının analiz için yalıtılması yordamın en kritik adımlarıdır. Daha sonra eklenti kullanım kılavuzundaki yönergeleri uygulayın, montajı düzenleyerek ilgi yapılarını yalıtın.
İlgi yapıları da dahil olmak üzere dönem için düzenlenmiş montajdan bir 4B hyperstack oluşturun ve düzenlenen hyperstack kaydedin. Düzenlenen 4B hiperyığının yalıtılmış yapısı için zaman içinde floresan yoğunluğunu ölçmek için Eklentiler, IJ_Plugins ve Düzenlenmiş Filmi Çözümle'yi seçin, Z yığınları arasındaki zaman aralığını girdive Tamam'ı tıklatın. Yalıtılmış yapının son filmini oluşturmak için Eklentiler, IJ_Plugins ve Project Hyperstack'i seçin, eklenmesi gereken Z yığını dilimlerini belirtin, Projeksiyon türü olarak Ortalama Yoğunluk'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Düzenlenen verilerin üzerinde orijinal verilerle birlikte bir 4B hiperyığın oluşturmak için eklentileri seçin, IJ_Plugins, İki Hyperstack'i birleştirin ve ikincinin üstünde birinciyi yerleştirin. Düzenlenen verilerin üzerinde orijinal verilerle birlikte 4B hiper yığınından bir film oluşturmak için Eklentiler, IJ_Plugins ve Project Hyperstack'i seçin, eklenmesi gereken Z yığını dilimlerini belirtin, projeksiyon türü olarak Ortalama Yoğunluk'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Burada, ham verilerin Z-stack projeksiyonunun ilk karesi, aynı dekonvolved ve ağartıcı düzeltilmiş verilerle karşılaştırılabilir.
Aynı deconvolved ve çamaşır suyu düzeltilmiş film bu çerçeveler analiz edildi iki sarnıç göstermek, yeşil Vanadate direnci glikozilasyon proteini ile ilk etiket 4 veya Vrg4 marker, ve daha sonra kırmızı Secretory 7 veya Sec7 gen taşıma protein belirteci ile. Deconvolved ve çamaşır suyu düzeltilmiş hiperyığının oluşturduğu bu montaj, seçilen sarnıktan birinin sinyalinin izolasyonuna izin vermek için, düzenlemeden önce ve sonra tüm optik bölümleri tek bir zaman noktasında gösterir. Bu şekilde, yansıtılan Z-yığınlarının son filmine ait birkaç kare, figürün üst kısmındaki orijinal projeksiyonlar ve alttaki düzenlenmiş projeksiyonlarla gösterilir.
Seçilen Golgi sarnıçyeşil ve kırmızı floresan sinyalleri quantification yeşil Vrg4 marker geldi ve yaklaşık 80 saniye boyunca devam ettiğini ortaya koymaktadır, sonra, kırmızı Sec7 marker geldi ve yaklaşık 60 saniye boyunca devam, iki belirteçarasında kısa bir örtüşme ile. Bu yordamı gerçekleştirirken, yaşamları boyunca kesin olarak izlenebilen yapıları belirlemek önemlidir. Aynı tür analiz, mutasyon veya başka bir spesifik tedirginlik türü yapıldıktan sonra yapılabilir.
Bu teknik, mayayı model sistem olarak kullanarak Golgi sarnıç ve endoplazmik retikulum çıkış yerlerinin dinamik davranışlarını incelemenin yolunu açmıştır.
