Questo metodo tiene traccia delle strutture nelle cellule di lievito in tre dimensioni in molti minuti, permettendoci di studiare la dinamica degli organelli e compartimenti intracellulari. L'imaging 4D ci consente di trarre conclusioni affidabili sulla dinamica intracellulare, in particolare per strutture o marcatori che possono essere transitori. A dimostrare la procedura sarà Natalie Johnson, una postdoc del mio laboratorio.
Inizia coltivando una coltura notturna del ceppo di lievito di interesse in cinque millilitri di sintetico non fluorescente definito, o NSD, medio, in un pallone sconcertato da 15 millilitri con una buona aerazione, a 23 gradi Celsius. Da tre a quattro ore prima dell'analisi, diluire la coltura del lievito di fase logaritmica in mezzo NSD fresco, in modo che la densità ottica finale a 600 nanometri, o OD600, sia da 0,5 a 0,8 al momento dell'imaging. Almeno un'ora prima che la coltura sia pronta, centrifugare un'aliquota di due milligrammi per millilitro Concanavalin Una soluzione per cinque minuti a tutta velocità, pellettare eventuali particelle e aggiungere 250 microlitri del supernatante in un piatto di microscopia inferiore in vetro pulito da 35 millimetri.
Dopo 15 minuti, lavare il piatto da due a tre volte con due millilitri di acqua distillata per lavaggio, aggiungendo 250 microlitri della coltura del lievito al piatto rivestito con Concanavalin A dopo che è stato asciugato. Attendere 10 minuti per consentire alle cellule di aderire, prima di lavare delicatamente il piatto da due a tre volte con due millilitri di mezzo NSD fresco. Quindi coprire le cellule con due millilitri di NSD fresco.
Per immagini le cellule di lievito, selezionare una lente ad immersione dell'olio 63X con un'apertura numerica di almeno 1,4 su un microscopio a luce confocale. Qui, è anche possibile utilizzare un obiettivo 100X al posto di un obiettivo 63X. Quindi, posizionare il piatto sulla lente oggettiva, macchiato con olio ad immersione.
Nel menu a discesa della scheda Modalità acquisizione selezionare xyzt. Sotto la scheda XY, formatta le dimensioni del fotogramma a 256 larghezza per 128 altezza. Utilizzare la velocità massima di scansione, che in genere è dell'ordine di otto kilohertz.
Attivare la scansione X bidirezionale se disponibile e regolare il fattore di zoom su nove, che si tradurrà in una dimensione in pixel di circa 80 nanometri. Se si utilizza un obiettivo 100X, regolare il fattore di zoom di conseguenza per mantenere una dimensione in pixel di circa 80 nanometri. Quindi impostare l'accumulo di linea su quattro o sei.
Impostare il foro stenopeica su 1,2 unità Airy e accendere il laser a luce bianca, se disponibile. Quindi impostare la lunghezza d'onda di eccitazione e la potenza laser percentuale per ogni canale di fluorescenza. Se disponibile, abilitare l'uso della modalità di conteggio dei fotoni nella scheda di configurazione deselezionando il tempo massimo di integrazione.
Per ogni canale di fluorescenza, assegnare un rilevatore ad alta sensibilità, impostare l'intervallo di lunghezze d'onda di emissione e attivare la modalità di conteggio dei fotoni, se disponibile. Impostare la finestra di gating del tempo su 0,6-10 nanosecondi per ogni canale di fluorescenza, per evitare di catturare la luce riflessa dal piatto di vetro. Attivare quindi l'imaging a campo luminoso e selezionare rilevatore a bassa sensibilità per la raccolta dei dati.
Attivare la modalità di imaging dal vivo e aumentare il guadagno nel canale dei campi luminosi fino a quando le celle non sono chiaramente visibili. Se in modalità di conteggio dei fotoni, modificare l'intervallo di valori grigi da manuale a automatico per visualizzare il segnale fluorescente. Impostate la pila Z per immaginare l'intero volume delle cellule di lievito e specificate la direzionalità dell'imaging in modo che verso il basso si muova verso lo slittamento del coperchio.
Impostare l'intervallo z-step su 0,25-0,35 micrometri per ottenere da 20 a 25 sezioni ottiche per Z-stack e attivare il flusso Galvo se disponibile. Per un filmato tipico, impostate l'intervallo di tempo tra z-stack su due secondi e impostate la durata del filmato su cinque a 10 minuti. Quindi salvare il filmato come file LIF.
Per la deconvoluzione dei film, avviare un programma software di deconvoluzione appropriato che utilizza il classico algoritmo di stima della massima verosimiglianza e aprire la serie di dati. Selezionare la Procedura guidata di deconvoluzione e l'editor di parametri per verificare che i parametri di imaging siano rilevati e visualizzati correttamente. Modificare il valore dell'indice di rifrazione medio incorporante in 1,4 per approssimare il citoplasma del lievito.
Quindi utilizzare l'editor per stimare la posizione dello slittamento di copertura. Selezionare Imposta tutto verificato e fare clic su Accetta e selezionare Invio guidato. Fare clic sulla freccia successiva per ignorare la selezione della funzione di diffusione del punto e le fasi di pre-elaborazione del ritaglio e procedere attraverso la procedura guidata di deconvoluzione per ogni canale di fluorescenza.
Selezionare la funzione di mappatura verticale logaritmica di calcolo e ispezionare il profilo di intensità della fluorescenza dei dati grezzi. Impostare manual come modalità per la stima in background, immettere un valore di sfondo e fare clic su Accetta. Lasciare il valore massimo delle iterazioni a 40 e immettere un rapporto segnale/rumore stimato.
Quindi disattivare la correzione della candeggina e fare clic su Deconvolvi. Selezionate Accetta al canale successivo nella finestra dei risultati della deconvoluzione, se il rumore viene rimosso a sufficienza senza eliminare la fluorescenza reale dalle strutture fioche. Una volta che tutti i canali fluorescenti sono stati deconvolti in modo soddisfacente, fare clic su Tutto fatto e disporre prima il canale rosso, seguito dai canali verde, blu e campo luminoso, per il successivo editing in ImageJ.
Quindi salvare la sequenza di immagini come file TIF a otto bit e selezionare un file per canale e allungare il contrasto come modalità di conversione. Per la correzione della candeggina, importate le sequenze di immagini deconvolte in ImageJ e fate clic su Immagine (Image), Hyperstacks e Stack in Hyperstack per convertire le immagini in un hyperstack. Selezionate xyzct dal menu a discesa e immettete il numero di canali, sezioni z-stack e tempi.
Per correggere i canali di fluorescenza per lo sbiancamento delle foto, selezionare Immagine, Colore, Canali divisi e, per i canali fluorescenti, selezionare Plugin, EMBLtools, Correzione candeggina e Adattamento esponenziale. Quindi selezionate Immagine, Colore e Unisci canali per unire il campo luminoso e i canali di fluorescenza corretti per la candeggina in un hyperstack, quindi salvate l'iperstack deconvolto e corretto per la successiva generazione e modifica di film come file TIF a otto bit. Per convertire il set di dati deconvoluto e corretto per la candeggina in un montaggio ridimensionato, selezionate Plugin, IJ_Plugins e Make Montage Series e selezionate l'iperstack a otto bit pertinente.
Fare clic su Apri e su OK per accettare che tutte le sezioni verranno utilizzate per creare il montaggio e quindi di nuovo su OK per accettare il valore del fattore di scala suggerito. Salvare il montaggio originale come file TIF a otto bit e selezionare Plugin, IJ_Plugins, Montage Series in Hyperstack e OK, per creare un hyperstack 4D dal montaggio originale che include tutti i tempi. Per generare il filmato proiettato medio originale, selezionare Innanzitutto Plug-in, IJ_Plugins, Project Hyperstack e OK, per accettare i parametri predefiniti di ZProjection.
Salvare il filmato proiettato medio come file TIF a otto bit e ispezionare il filmato per identificare le singole strutture che possono essere tracciate per tutta la durata del periodo di etichettatura. Identificare una struttura che può essere tracciata in modo affidabile per tutta la durata del filmato e isolare tale struttura per l'analisi sono i passaggi più critici della procedura. Quindi segui le istruzioni nella guida dell'utente del plug-in, per isolare le strutture di interesse modificando il montaggio.
Creare un hyperstack 4D dal montaggio modificato per il periodo, incluse le strutture di interesse, e salvare l'iperstack modificato. Per quantificare l'intensità della fluorescenza nel tempo per la struttura isolata nell'iperstack 4D modificato, selezionate Plugin, IJ_Plugins e Analizza filmato modificato, immettete l'intervallo di tempo tra gli stack Z e fate clic su OK. Per creare un filmato finale della struttura isolata, selezionate Plugin, IJ_Plugins e Project Hyperstack, specificate le sezioni dello stack Z da includere, selezionate Intensità media come tipo di proiezione e fate clic su OK. Per creare un hyperstack 4D con i dati originali sui dati modificati, selezionare plugin, IJ_Plugins, Unire due hyperstack e posizionarsi al primo posto al secondo posto. Per generare un filmato dall'iperstack 4D con i dati originali sui dati modificati, selezionare Plugin, IJ_Plugins e Project Hyperstack, specificare le sezioni dello stack Z da includere, selezionare Intensità media come tipo di proiezione e fare clic su OK. Qui, il primo fotogramma di una proiezione Z-stack di dati grezzi può essere confrontato con gli stessi dati deconvolti e corretti per la candeggina.
Questi fotogrammi dello stesso film deconvolto e corretto per la candeggina mostrano due cisterne che sono state analizzate, che prima etichettano con il marcatore di proteina di glicosilazione di resistenza Vanadate verde 4 o Vrg4, e in seguito con il marcatore proteico di trasporto genico Secretory 7 o Sec7 rosso. Questo montaggio, creato da un iperstack sconvoluto e corretto per candeggina, mostra tutte le sezioni ottiche in un unico punto di tempo prima e dopo la modifica, per consentire l'isolamento del segnale da una delle cisterne scelte. In questa figura, diversi fotogrammi del filmato finale delle pile Z proiettate vengono visualizzati con le proiezioni originali nella parte superiore della figura e le proiezioni modificate nella parte inferiore.
La quantificazione dei segnali fluorescenti verdi e rossi delle cisterne Golgi scelte rivela che il marcatore Vrg4 verde arriva e persiste per circa 80 secondi, dopodi clic, il marcatore Sec7 rosso arriva e persiste per circa 60 secondi, con una breve sovrapposizione tra i due marcatori. Quando si esegue questa procedura, è importante identificare strutture che possono essere tracciate in modo inequivocabile per tutta la vita. Lo stesso tipo di analisi può essere eseguita dopo aver effettuato una mutazione o qualche altro tipo di perturbazione specifica.
Questa tecnica ha aperto la strada allo studio del comportamento dinamico delle cisterne golgi e dei siti di uscita del reticolo endoplasmatico utilizzando il lievito come sistema modello.
