Fibroblastlardan eritroid ata hücrelerine doğru soy yeniden programlama. Eritroid hücre kaderini belirleyen transkripsiyonel düzenleme süreçlerini daha iyi incelemek için laboratuarımızda geliştirdiğimiz yeni bir yöntemdir. Geliştirme yi incelemek için doğrudan soy yeniden programlamakullanmanın en büyük avantajı çok basit bir teknik olmasıdır.
Yani, örneğin, nakavt fareler içinde fonksiyon çalışmalarıkaybı ile karşılaştırıldığında, burada çok kolay faktör manipüle, belirli bir zaman noktasında aşırı ifade ve daha sonra kolayca kromatin değişiklikleri veya gen ekspresyon değişiklikleri gibi downstream etkileri incelemek için yeterli malzeme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, fare kuyruk ucu fibroblastlarının eritroitoid atalarına yeniden programlanmasına odaklanırken, diğer fibroblast hücre tiplerine ve insanlar da dahil olmak üzere diğer organizmalara da uygulanabilir. Bu tekniğin etkileri transfüzyon tıbbına kadar uzanır ve bu da in vitro olarak kırmızı kan hücrelerinin üretimine giden yolu açmaktır.
Prosedürü gösteren araştırma grubumdan Alban Johansson olacak. % 0.1 jelatin ile bulaşıkyüzeyini kaplayarak başlayın. Yaklaşık 20 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.
Jelatin çözeltisini aspire edin ve yemeklerin kurumasını bekleyin. Kaldırmak için ötenazi li bir farenin kuyruğunun tabanını kesmek için makas kullanın. Kuyruk kullanıma hazır olana kadar %2 FBS ile DPBS'ye yerleştirin.
Steril koşullar altında bir doku kültürü başlık, DPBS 0.02% tripsin EDTA seyreltilmiş trippsin çözeltisi hazırlamak ve kaplamasız 10 santimetrelik çanak içine 5 mililitre ekleyin. Bir doku kültürü başlık olarak, onu kapsayacak şekilde 15 mililitrelik bir tüp içinde yeterli% 70 etanol kuyruk yıkayın ve daha sonra DPBS. Kuyruğu bir tabağa düz yerleştirin ve yerinde tutmak için forceps kullanın.
Tabandan uca uzunlamasına eksenboyunca kuyruk üzerinde bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Kuyruğu kavramak ve dikey olarak tutmak için bir çift forceps kullanın ve kuyruk tabanında kesi yanında deri kavrama ve geri soyma kullanabilirsiniz ikinci bir çift kullanın. Deri kuyruğun ucuna doğru aşağı doğru çekerek soyulmuş kadar kesiğin her iki tarafında bunu gerçekleştirin.
Soyulmuş kuyruğu, tripsin çözeltisini içeren yemeğin üzerinde forsepslerle tutun. Küçük parçalar halinde kuyruk kesmek için diseksiyon makas kullanın. Daha küçük parçalar halinde tripsin çözeltisi bu parçaları parçalamak ve daha sonra 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka makas kullanın.
Tripsin gidermek için, FEX orta iki cilt ekleyin, Takviyeleri ve antibiyotikler ile DMEM. 50 mililitrelik bir tüp içine çanak tüm içeriğini toplayın. Tüpü 350 kez G'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.
Supernatant aspire ve taze FEX orta 10 mililitre kuyruk parçaları içeren pelet resuspend. Bu süspansiyonu jelatin kaplı bir tabağa aktarın. %5 karbondioksit ve %4 oksijenle 37 derecede kuluçkaya yatarak her iki günde bir taze FEX ortamı ekleyin.
Kuyruk parçalarının yemeğin altına bağlandığı ve fibroblastların onlardan uzaklaştığını gösteren beş ila yedi gün sonra kültürü gözlemleyin. Fibroblastkümeleri görünür olduktan sonra, yavaşça kuyruk parçaları yerinden çanak sallayın. Tüm kemik parçaları ile orta aspire, plaka bağlı fibroblastlar bırakarak.
Taze FEX orta ve kültür fibroblastlar 10 mililitre ekleyin confluent kadar fibroblastlar. Fibroblast kültüründe hematopoetik ataların kontaminasyon olmamasını sağlamak için, el yazmasında açıklandığı gibi tripsin EDTA kullanarak hücreleri plakadan ayırın. Orta ekleyin ve hücreleri toplamak ve antikorlar ile manyetik boncukekleyin.
Hematopoetik belirteçleri ifade eden hücreleri kaldırmak için manyetik ayırma sistemi kullanın. Bu adım ın dahil edilmesi kesinlikle hayati önem taşımaktadır, çünkü kültürde bulunabilecek herhangi bir HSPC'yi ve bu nedenle FACS analizinin olduğu gün herhangi bir yanlış pozitif sonuç olasılığını ortadan kaldırır. Tohum retroviral ambalaj hücreleri yaklaşık 25, 000 hücre kare santimetre kare bir doku kültürü tedavi çanak üzerinde.
Yüksek glikozLu DMEM'deki hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle inkübe edin. Ertesi sabah, orta çıkarın ve hiçbir katkı maddesi ile DMEM kültür için kullanılan hacmin yarısını ekleyin. Öğleden sonra, transfeksiyon için gerekli% 70-80 birleşimi için hücreleri kontrol edin.
Her yeniden programlama faktörü için gag, Pol ve zarf genleri içeren yardımcı vektörün altı mikrogramı ve üç mikrogramı ile altı mikrogramlık bir karışımını hazırlayarak transfeksiyona başlayın. Daha sonra, her yeniden programlama faktörü için steril polistiren tüpe 300 mikrolitre oda sıcaklığında DMEM ekleyin. Daha sonra dikkatlice tüp duvar ile temas önlemek için doğrudan orta içine oda sıcaklığında ticari transfeksiyon reaktif 27 mikrolitre ekleyin.
Plazmid karışımını tüp içeren transfeksiyon reaktifine ekleyin. Girdap kısaca ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karışımı kuluçkaya yatırın. Girdap transfeksiyon reaktif DNA karışımı tekrar.
Retroviral ambalaj hücrelerine damla şeklinde ekleyin, böylece kültüre eşit olarak yayılır ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırılır. Transfeksiyondan 24 saat sonra, ortayı çıkarın ve mililitre penisilin streptomisin başına 100 ünite ile DMEM ekleyin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, supernatant'ı toplayın ve 0,22 mikrometre lik gözenek boyutuşırşırıktan geçirin.
FEX ortamda%0,1 jelatin önceden kaplanmış yemeklerde kuyruk ucu fibroblastlarını santimetre kare başına 10,000 hücreye tohumlayarak transdüksiyona başlayın. 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bu adımı gerçekleştirirken, dört transgenin de yeniden programlama sürecine eşit katkıda bulunmasını sağlamak için dört retroviral süpernatantı eşit oranda eklemek önemlidir.
Ertesi gün, ilk FEX orta altı hacimli retroviral enfeksiyon reaktif mililitre başına dört mikrogram ile desteklenen her yeniden programlama faktörü için viral supernatant bir hacim ekleyerek bir transdüksiyon karışımı hazırlamak. Bundan sonra, fibroblast kültüründen FEX ortamı aspire ve transdüksiyon karışımı ekleyin. Transdüksiyon reaksiyonu hipoksik koşullarda %5 karbondioksit ve %4 oksijenle 37 santigrat derecede dört saat kuluçkaya yatırın.
Dört saat sonra, transdüksiyon karışımı aspire ve taze yeniden programlama ortamı ekleyin. Hipoksik koşullarda 8 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yat, her iki günde bir yeni programlama ortamı ekleyin. Plakadan ayrılan hücre kümeleri ile başarılı yeniden programlama gözlemleyin.
Daha fazla analiz için çanak yeniden programlanmış hücreleri hasat için, yavaşça onları pipet yukarı ve aşağı ve daha sonra hücreleri toplamak. IED'lerin başarılı bir şekilde yeniden programlanmasından sonra, YFP pozitif hücreler transdüksiyondan beş gün sonra gözlemlenebilir. Yuvarlak olurlar, plakanın yüzeyinden yükselirler, kümeler oluşturmaya başlarlar ve eritroid öncül benzeri morfolojisi sergilerler.
Bazı hücrelerin hemoglobinizasyonu pozitif benzidin boyama ile belirgindir. Küçük bir kısmı eritroid özgü yüzey belirteci TER-119 ifade eder. Sekizinci güne kadar büyük YFP pozitif kümeler görülebilir.
Sekizinci gün iEP'ler beşinci gün iEP'lerden daha farklı eritroid fenotipgösterirler. Onlar önemli ölçüde daha küçük, daha fazla hemoglobin birikmiş, ve TER-119 artan ifade göstermektedir. Sekizinci gün toplanan iPCR'lerin qPCR'ı ile yapılan gen ekspresyonu analizi, fibroblast genlerinin ekspresyonunu neredeyse kapattıklarını ve birçok eritroid geni güncellediklerini göstermektedir.
Yeniden programlanmış hücrelerde BFU-e koloni oluşturan tahliller yaptıktan sonra, sekizinci gün iEP'ler belirgin kırmızı ve gözle görülür kırmızı olmayan iki tür koloni oluştururlar. Kırmızı kolonilerden hücreler eritroblast morfolojisi sergilerken, kırmızı olmayan kolonilerden hücreler sergilenmedi. Yaklaşık 1,000 günde bir, beş iEP kırmızı koloniler oluşurken, sekiz giyotlu iEP'den sadece 10,000 koloniden biri oluşmuştur.
Kuyruk ucu fibroblastlarının veya TTF'lerin yeniden programlama verimi geçiş sayısından etkilenir. Dokuz kez geçen TTF'ler, üç kez geçen hücrelere kıyasla iED kümeleri üretme yeteneğinde dramatik bir azalma gösterdi. Ayrıca, farklı kültür koşulları yeniden programlama verimliliğini etkileyebilir.
Normoksia da kültüre aktarılan TTF'ler yeniden programlanır ve IEP kümeleri beş ila sekiz gün yerine 10 gün sonra gözlenir. Bu işlemden sonra hücre farklılaşma durumunu belirlemek için koloni oluşturma tahlilleri, qPCR ve FACS analizi gibi yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, gelişiminden bu yana, fare ve insan daki ilkel ve kesin eritroid hücreler arasındaki geçişi anlamada eritropoez alanında araştırmacıların önünü açmektedir.
