Direkte Lineage-Reprogrammierung von Fibroblasten zu Erythroid-Vorläuferzellen. Es ist eine neue Methode, die wir in unserem Labor entwickelt haben, um die Prozesse der Transkriptionsregulation, die das Erythroid-Zellschicksal bestimmt, besser zu untersuchen. Der Hauptvorteil bei der direkten Linienumprogrammierung, um die Entwicklung zu untersuchen, ist, dass es eine sehr einfache Technik ist.
Im Vergleich zum Beispiel bei Funktionsverluststudien bei Knockout-Mäusen können wir hier sehr leicht den Faktor manipulieren, ihn zum bestimmten Zeitpunkt überausdrücken und dann leicht genug Material erhalten, um nachgelagerte Effekte wie Chromatin-Modifikationen oder Genexpressionsänderungen zu untersuchen. Während diese Methode konzentriert sich auf die Neuprogrammierung von Maus Schwanzspitze Fibroblasten zu Erythroid Vorläufer, Es kann auch auf andere Fibroblasten-Zelltypen angewendet werden, und auf andere Organismen einschließlich Menschen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Transfusionsmedizin, da sie den Weg zur Produktion roter Blutkörperchen in vitro ebnet.
Das Verfahren wird Alban Johansson von meiner Forschungsgruppe demonstrieren. Beginnen Sie, indem Sie die Oberfläche der Gerichte mit 0,1% Gelatine bedecken. Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für etwa 20 Minuten.
Die Gelatinelösung ansaugen und das Geschirr trocknen lassen. Verwenden Sie eine Schere, um an der Basis des Schwanzes einer eingeschläferten Maus zu schneiden, um sie zu entfernen. Legen Sie den Schwanz in DPBS mit 2%FBS, bis sie einsatzbereit sind.
In einer Gewebekulturhaube unter sterilen Bedingungen eine verdünnte Trypsinlösung von 0,02%Trypsin EDTA in DPBS zubereiten und 5 Milliliter in eine unbeschichtete 10-Zentimeter-Schale geben. In einer Gewebekulturhaube den Schwanz in ausreichend 70% Ethanol in einem 15-Milliliter-Rohr waschen, um ihn zu bedecken und dann in DPBS. Legen Sie den Schwanz flach in eine Schüssel und verwenden Sie Zangen, um es an Ort und Stelle zu halten.
Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt am Schwanz entlang seiner Längsachse von der Basis bis zur Spitze zu machen. Verwenden Sie ein Paar Zangen, um den Schwanz zu greifen und ihn vertikal zu halten und ein zweites Paar zu verwenden, um die Haut neben dem Schnitt an der Basis des Schwanzes zu greifen und ihn wieder zu schälen. Führen Sie dies an beiden Seiten des Einschnitts aus, bis die Haut abgeschält werden kann, indem Sie nach unten zur Schwanzspitze ziehen.
Halten Sie den geschälten Schwanz mit Zange über die Schüssel, die die Trypsin-Lösung enthält. Verwenden Sie Eine Sezierschere, um den Schwanz in kleine Stücke zu schneiden. Verwenden Sie eine Schere, um diese Stücke in der Trypsin-Lösung in noch kleinere Stücke zu zersplittern und dann bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten zu brüten.
Um das Trypsin zu löschen, fügen Sie zwei Bände FEX Medium, DMEM mit Ergänzungen und Antibiotika. Sammeln Sie den gesamten Inhalt der Schale in eine 50-Milliliter-Röhre. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Den Überstand ansaugen und das Pellet, das die Schwanzfragmente enthält, in 10 Milliliter frischem FEX-Medium wieder aufsetzen. Diese Suspension auf eine gelatinebeschichtete Schale übertragen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid und 4% Sauerstoff, hinzufügen frisches FEX Medium alle zwei Tage.
Beobachten Sie die Kultur nach fünf bis sieben Tagen, in der die Schwanzfragmente am Boden der Schale befestigt sind und sich Fibroblasten von ihnen entfernen. Sobald Cluster von Fibroblasten sichtbar sind, schütteln Sie die Schale sanft, um Schwanzstücke zu vertreiben. Saugen Sie das Medium mit allen Knochenfragmenten, so dass die Fibroblasten an der Platte befestigt.
Fügen Sie 10 Milliliter frisches FEX-Medium hinzu und kultiieren Sie die Fibroblasten bis zum Konfluent. Um sicherzustellen, dass es keine Kontamination durch hämatopoetische Vorläufer in der Fibroblastenkultur gibt, dissoziieren Sie die Zellen von der Platte mit Trypsin EDTA, wie im Manuskript beschrieben. Fügen Sie Medium und sammeln Sie die Zellen, und fügen Sie magnetische Perlen mit Antikörpern.
Verwenden Sie ein magnetisches Trennsystem, um Zellen zu entfernen, die hämatopoetische Marker exdrücken. Die Einbeziehung dieses Schritts ist absolut notwendig, da er alle HSPCs eliminiert, die in der Kultur vorhanden sein könnten, und daher die Wahrscheinlichkeit falscher Positivmeldungen am Tag der FACS-Analyse. Samen retrovirale Verpackungszellen mit etwa 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf einer gewebekulturbehandelten Schale.
Inkubieren Sie die Zellen in hochglukoseDMEM bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid über Nacht. Entfernen Sie am nächsten Morgen das Medium und fügen Sie die Hälfte des Volumens hinzu, das dmEM über Nacht ohne Zusatzstoffe kultiviert hat. Am Nachmittag überprüfen Sie die Zellen auf 70 bis 80 %konfluency, die für die Transfektion erforderlich sind.
Beginnen Sie die Transfektion, indem Sie für jeden Reprogrammierungsfaktor eine Mischung aus zwei bis eins des Expressionsvektors PMX und drei Mikrogramm des Hilfsvektors mit Gag-, Pol- und Hüllkurvengenen vorbereiten. Als nächstes fügen Sie für jeden Reprogrammierungsfaktor 300 Mikroliter Raumtemperatur DMEM in ein steriles Polystyrolrohr ein. Dann fügen Sie vorsichtig 27 Mikroliter Raumtemperatur kommerzielle transfektionreagenz direkt in das Medium, um den Kontakt mit der Rohrwand zu vermeiden.
Fügen Sie die Plasmidmischung in das transfektionshaltige Reagenz, das tube enthält. Wirbel kurz und inkubieren Sie die Mischung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Wirbel das Transfektionsreagenz DNA-Gemisch wieder.
Fügen Sie es tropfenweise zu den retroviralen Verpackungszellen hinzu, so dass es gleichmäßig über die Kultur verteilt ist und bei 37 Grad Celsius brütet. 24 Stunden nach der Transfektion entfernen Sie das Medium und fügen Sie DMEM mit 20%FBS und 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin Streptomycin hinzu. 48 Stunden nach der Transfektion den Überstand sammeln und durch einen Spritzenfilter in Porengröße von 0,22 Mikrometer filtern.
Beginnen Sie die Transduktion, indem Sie die Schwanzspitzen-Fibroblasten mit 10 000 Zellen pro Quadratzentimeter auf 0,1% gelatinebeschichteten Schalen in FEX-Medium säen. 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bei der Durchführung dieses Schritts ist es wichtig, die vier retroviralen Überstoffe in einem gleichen Verhältnis hinzuzufügen, um sicherzustellen, dass alle vier Transgene gleichermaßen zum Reprogrammierungsprozess beitragen.
Am nächsten Tag bereiten Sie eine Transduktionsmischung vor, indem Sie zunächst ein Volumen viralen Überstands für jeden Reprogrammierungsfaktor hinzufügen, der mit vier Mikrogramm pro Milliliter retroviralem Infektionsreagenz auf sechs Bände FEX-Medium ergänzt wird. Danach das FEX-Medium aus der Fibroblastenkultur ansaugen und die Transduktionsmischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Transduktionsreaktion für vier Stunden bei 37 Grad Celsius unter hypoxischen Bedingungen bei 5% Kohlendioxid und 4% Sauerstoff.
Nach vier Stunden die Transduktionsmischung ansaugen und frisches Reprogrammierungsmedium hinzufügen. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius in hypoxischen Bedingungen für acht Tage, Hinzufügen von frischen Reprogrammierung Medium alle zwei Tage. Beobachten Sie eine erfolgreiche Neuprogrammierung mit nachgegebenen Zellclustern, die von der Platte gelöst sind.
Um umprogrammierte Zellen aus der Schale für weitere Analysen zu ernten, pipette sie sanft nach oben und unten und sammeln Sie dann die Zellen. Nach erfolgreicher Neuprogrammierung von iEPs sind YFP-positive Zellen bereits fünf Tage nach der Transduktion beobachtbar. Sie werden rund, heben sich von der Oberfläche der Platte, beginnen, Cluster zu bilden, und zeigen eine erythroide Vorläufer-ähnliche Morphologie.
Hämoglobinierung einiger Zellen wird durch positive Benzidinfärbung deutlich. Eine kleine Fraktion drückt den erythroidspezifischen Oberflächenmarker TER-119 aus. Am achten Tag sind große YFP-positive Cluster zu sehen.
Tag acht iEPs haben einen differenzierteren Erythroid-Phänotyp als Tag fünf iEPs. Sie sind deutlich kleiner, haben mehr Hämoglobin angesammelt und zeigen eine erhöhte Expression von TER-119. Die Genexpressionsanalyse von qPCR von iEPs, die am achten Tag gesammelt wurden, zeigt, dass sie die Expression von Fibroblasten fast heruntergefahren und viele Erythroidgene hochreguliert haben.
Nach der Durchführung von BFU-e koloniebildenden Assays auf den neu programmierten Zellen bilden Tag acht iEPs zwei Arten von Kolonien, deutlich rot und nicht sichtbar rot. Während Zellen aus roten Kolonien Erythroblast-Morphologie zeigten, waren es Zellen aus nicht-roten Kolonien nicht. Etwa jeder zehnte Tag bildete fünf iEPs rote Kolonien, während nur etwa eine von 10.000 Kolonien ab Tag acht iEPs gebildet wurde.
Die Reprogrammierungder Effizienz von Schwanzspitzen-Fibroblasten oder TTFs wird durch die Durchgangsnummer beeinflusst. TTFs, die neunmal durchdrungen waren, zeigten eine dramatische Verringerung der Fähigkeit, IEPs-Cluster zu produzieren, im Vergleich zu den Zellen, die dreimal durchdrungen worden waren. Darüber hinaus können unterschiedliche Kulturbedingungen die Effizienz der Neuprogrammierung beeinträchtigen.
Transduced TTFs, die in Normoxia kultiviert werden, sind viel langsamer zu reprogrammieren und IEP-Cluster werden nach 10 Tagen statt fünf bis acht Tagen beobachtet. Nach diesem Verfahren können Methoden wie koloniebildende Assays, qPCR- und FACS-Analysen angewendet werden, um den Zelldifferenzierungsstatus zu bestimmen. Seit ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Erythropoese beim Verständnis des Wechsels zwischen primitiven und definitiven Erythroidzellen in Maus und Mensch.
