Bu gizem, hücre biyolojisi alanında protein input gibi birkaç soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknolojinin en büyük avantajı, en vivo koşullarda kloroplastlara protein girişinin çalışılmasıdır. Prosedürü gösteren Junho Lee ve Hyangju Kang, benim laboratuvar dan iki sonrası outs olacaktır.
Başlamak için, bir ila iki B5 plakaları iki haftalık bitkilerden bozulmamış yaprak dokuları hasat. Yaprakları hasat ve enzim çözeltisi 25 mililitre içeren 50 mililitrekonik tüp içine yerleştirmek için bir cerrahi bıçak kullanın. Tüpü yatay olarak döner bir çalkalayıcıüzerine yerleştirin ve 22 santigrat derecede hafif bir ajitasyonla karanlıkta sadece petioles ve sapları çözeltide kalana kadar 8 ila 12 saat boyunca inkübe edin.
Kuluçkayı tamamladıktan sonra, serbest bırakılan protoplastları içeren enzim çözeltisini 140 mikrometrelik gözenek büyüklüğündeki örgüden taze bir Petri kabına süzün. Daha sonra çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpte %21 sakaroz çözeltisinin 15 mililitre üzerine dikkatlice katlayın. En düşük hızlanma ve yavaşlama ayarları ile 10 dakika boyunca 98 gs bir sallanan kova rotor tüp santrifüj.
Bundan sonra, enzim çözeltisi içeren en üst tabakadan ve enzim solüsyonu ile sakkaroz çözeltisi arasındaki arabirimden protoplastları dikkatlice çıkarmak için patura pipetini kullanın. Bu çözeltiyi 30 mililitre W5 çözeltisi içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü karıştırmak için ters çevirin. Tüpü 51 gs'de altı dakika santrifüj edin.
Peletteki protoplastları rahatsız etmeden bu süpernatantı dikkatlice atmak için bir pipet kullanın. 25 mililitre W5 çözeltisi ekleyin ve protoplastları nazikçe yeniden askıya alın. Stabilizasyon için, en az bir saat boyunca dört santigrat buzdolabında kuluçka.
Dört derece santigrat kuluçka sonra, pelet tamamen iki dakika için 46 gs onları santrifüj ederek protoplasts. Supernatent'i dikkatlice tamamen çıkarın ve mililitre başına altıya beş kat on elde etmek için protoplast peletine MANG çözeltisi ekleyin. Taze 13 mililitrelik yuvarlak dipli tüpe 10 mikrogram plazma DNA'sı ve 300 mikrolitre protoplast çözeltisi eklemek için bir pipet kullanın.
Tüpleri elle hafifçe döndürerek karıştırın ve hemen 300 mikrolitre taze hazırlanmış %40 PEG çözeltisi ekleyin. Tüpü neredeyse yatay olarak yatırarak ve birkaç kez elle hafifçe döndürerek tamamen karıştırın. 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.
Sonra W5 çözeltisi bir mililitre ekleyin ve daha önce olduğu gibi yavaşça elle tüp döndürerek tamamen karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. İlk 1,5 mililitre ve daha sonra w5 iki mililitre ekleyerek ve son ekleme ve karıştırma sonra, 30 dakika kuluçka ile iki kez daha tekrarlayın.
Dört dakika boyunca 46 gs tüp santrifüj ve sonra supernatant atın. Pelet iki mililitre W5 çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırın, ama tamamen, daha önce olduğu gibi aynı şekilde. Karanlık bir odada 22 derecede 18 saat kuluçkaya yat.
Floresan mikroskobu kullanarak protein ithalatıanaliz etmek için, bir cam slayt üzerine protoplast çözeltisi 10 mikrolitre yerleştirmek için kesilmiş ucu ile bir pipet kullanın. Protoplastlara zarar vermemek için çözeltiyi dikkatlice örtmek için bir kapak fişi kullanın. Yeşil floresan protein ve klorofil otofloresan gözlemlemek için ayarlanmış bir uyarma kabul filtresi ile bir floresan mikroskop sahnesine slayt yerleştirin.
Görüntüleri yakalamak ve sözde renkli görüntüler üretmek için bir hayal düzenleme yazılımı kullanarak bunları işlemek için soğutulmuş şarj çift cihaz kamera kullanın. Toplam protein çıkarma ve immünoblotting için, protoplast çözeltisinden bir mililitre çıkarın ve kalan bir mililitre karıştırın. Bu protoplast çözeltiyi 46 gs'de dört dakika boyunca bir santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.
Santrifüj tamamladıktan sonra supernatant çıkarın ve denatürasyon tampon 80 mikrolitre ekleyin. Girdap beş saniye boyunca güçlü bir şekilde. Beş XDS örnek tampon ekleyin, iyice karıştırın ve dennature için 10 dakika kaynatın.
Standart STS sayfası ve anti-GFP antikor ile immünoblot ile devam edin. RBCS ve TGFT, GFP'ye kaynaşmış transit peptid içeren RBCS'nin 79 son terminal amino asit kalıntılarını kodlayan bir füzyon yapısı olan floresan mikroskobu ve immünoblotlama ile proteinlerin kloroplastlara ithalatını incelemek için kullanılmıştır. Floresan mikroskobu ile incelendiğinde, hedef proteinden gelen yeşil floresan sinyaller klorofil otofloresanstan gelen kırmızı floresan sinyallerle birleşerek kloroplastlara protein ithal ettiğini gösterir.
Toplam protein izole edildikten sonra, iki protein bantları immünoblot gözlenir, bir protein düzgün kloroplast içine ithal olduğunu gösteren. Üst bant kloroplastiçine ithal edildikten sonra işlenmiş forma tam uzunlukta öncül ve alt bant karşılık gelir. Proteinin işlenmiş form miktarı zamana bağlı bir şekilde artarak proteinin kloroplastlara ithal edildiğini düşündürmektedir.
Bu gelişmede, bu teknik, hücre biyolojisi alanında araştırmacıların Arabidopsis'te protein yorucu veya membran iplik toplamayı keşfetmelerinin önünü açmıştır.
