Bu yöntem, kloroplast membranları arasında protein taşıma mekanizmaları ve enerjik yanı sıra plastids içinde proteinlerin konumu ile ilgili anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. Thylakoid protein hedeflemesi için bu tekniğin en büyük avantajı, sıcaklık, pH, iyonik koşullar ve öncül konsantrasyonları da dahil olmak üzere taşıma sırasında thylakoid ortamının tam kontrol sağlar olmasıdır. Üç saat boyunca 400 mililitre distile su yaklaşık 55 gram bezelye ıslatarak başlayın.
Toprağa plastik bir tepsi içinde batırılmış bezelye ekin, vermikülit ince bir tabaka ile kaplı, ve metin protokolü açıklandığı gibi dokuz ila 15 gün boyunca büyümek. Kloroplast izolasyon gününde, 15 mililitre Percoll mililitre ve 15 mililitre lik 2xGB tamponu 30 mililitrelik polikarbonat yüksek hızlı santrifüj tüpünde 30, sabit açıda rotorda 900 gs'lik bir karışımı nı frenkapalı yken 30 dakika boyunca 30 dakika boyunca santrifüj ederek sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Sonra hasat yaklaşık 25 gram dokuz ila 15 günlük bezelye sürgünler.
Soğutulmuş bir blender soğuk 1xGB tampon 95 mililitre ekleyin, keskinleştirilmiş bıçakları ile. Ve homojenize. Soğutulmuş bir kabın üzerine bir huni yerleştirilen peynir bezi en az iki kat ile bu karışımı filtreleyin.
Santrifüj filtrasyon bir 15 mililitre polikarbonat santrifüj tüp kullanarak bir sallanan kova rotor 3, 000 gs dört derece santigrat beş dakika için. Supernatant atın ve hafifçe 1xGB bir mililitre pelet resuspend için bir paintbrush kullanın. Bundan sonra dikkatle Percoll gradyan üstüne ekran süspansiyon katman için bir cam duruş pipet kullanın.
8,000 gs'de sallanan bir kova rotorunda 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca freni kapalı santrifüj edin. Bir duruş pipet kullanarak tekrar dikkatle bozulmamış kloroplastlar içeren alt yeşil bant taze bir 50 mililitre polikarbonat tüp içine aktarın ve 1xIB tampon 30 mililitre ekleyin. Dört santigrat derece beş dakika için 1, 800 gs bir sallanan kova rotor tüp santrifüj.
Supernatant attıktan sonra, yavaşça bir boya fırçası ile 1xIB bir mililitre pelet resuspend. 30 mililitre 1xIB ve santrifüj de aynı koşullarda tekrar yıkayın. 1xIB bir mililitre son santrifüj sonra pelet resuspend.
Klorofil konsantrasyonu belirlemek için, % 80 aseton beş mililitre ile tamamen resuspended kloroplast10 mikrolitre karıştırın. 11 mikrometre gözenek boyutuna sahip 180 mikrometre kalınlığındaki filtre kağıdından süzün ve klorofil konsantrasyonunu spektrofotometre ile belirleyin. Soğuk 1xIB kullanarak mililitre başına bir miligram kloroplast karışımı seyreltin.
Stromal ekstresin gerekli olmadığı nda thylakoidleri izole etmeye başlamak için cpTat taşıma, santrifüj bozulmamış kloroplastlar 1,5 mililitrelik tüplerde sallanan kova rotorunda 1,000 gs'de dört derece santigrat derece altı dakika süreyle. Bundan sonra, supernatant atın ve bir mikropipet ile mililitre başına bir miligram elde etmek için hipotonik lysis tampon pelet resuspend. 10 dakika ara sıra karıştırarak karanlıkta buz üzerinde kuluçka.
Timokoidleri kurtarmak için, sallanan kova rotorunda santrifüj 3, 200 gs'de dört derece santigrat derecede sekiz dakika. Bir ila iki mililitre likiz tamponu ile peleti yeniden suyararak ve aynı koşullarda santrifüj ederek timokoidleri iki kez yıkayın. Son santrifüjden sonra, peleti 1xIB tamponunun bir mililitresinde yeniden askıya alın ve daha önce gösterildiği gibi bir spektrofotometre kullanarak izole timokoidlerde klorofil konsantrasyonunu belirleyin.
CPSec1 ve CPSRP eliquate gibi stromal ekstresi kurtarma gerektiren yollar için bir sallanan kova rotor ve santrifüj izole kloroplast600 mikrolitre 1,000 gs dört derece santigrat altı dakika için. Kloroplast lysis için, 600 mikrolitre hipotonik lysis tamponu ile pelet askıya alıyoruz. Ara sıra karıştırma ile 10 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde kuluçka.
Sonra tüpleri sallanan kova rotorunda 3, 200 gs'de dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüj edin. Stroma kaydetmek için, yeni bir mikro santrifüj tüp sarı supernatant açık yeşil transfer ve 2x ham stromal tampon eşit hacim ekleyin. Thylokoids yıkamak için, dört santigrat derece sekiz dakika boyunca 3, 200 gs iki cilt lysis tampon ve santrifüj ekleyin.
Mililitre başına bir miligram klorofil konsantrasyonu elde etmek için 1xIB pelet resuspend ve taşıma tahlillerde daha sonra kullanılmak üzere buz üzerinde bir kenara koyun. Seyreltilmiş ham stroma'yı 42, 000 gs'de sabit açı rotoruyla santrifüj ederek ham stromadan arta kalan membranları 42 derece santigrat derecede 30 dakika çıkarın. Daha sonra her tüpten alınan hacmi not ederken, küçük sarı yeşil pelet rahatsız değil emin olmak için her tüp hacminin% 95 toplamak.
Konsantre stromal ekstresi hazırlamak için, toplanan supernatants havuz. Sonra dört mililitre kullanın 30 kilodalton moleküler ağırlık kesme konsantratörü ekstre beş kat konsantre. Buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpteki cpTat taşımasını tahlil etmek için izole timokoidleri mililitrede 0,33 miligram lık son klorofil konsantrasyonuna, 1xIB'de hazırlanan beş milimolar ATP'ye ve 1xIB'de hazırlanan sekiz milimolar DTT'ye karıştırın.
Taşımayı başlatmak için, substrat proteinini taşıma karışımına tanıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fotosentetik olarak aktif radyasyonun saniyede 80 ila 100 mikroeinstein'ı ile süspansiyonu aydınlatarak reaksiyonuyguluyor. Taşıma reaksiyonu durdurmak için, süspansiyonu buz gibi 1xIB ile sekiz kat seyreltin.
Centrifuge 3, 200 gs bir mikro santrifüj beş dakika dört derece santigrat thys de thylokoids kurtarmak için. Supernatant attıktan sonra, buz soğuk 1xIB 120 mikrolitre pelet resuspend. CPSec1 veya PSRP yollarını teşpetmek için aşağıdakileri 1,5 mililitrelik bir tüpte buz üzerinde karıştırın.
Mililitrebaşına 0.33 miligram son klorofil konsantrasyonuna thylakoidler, stromal ekstresin mililitre klorofil eşdeğerleri başına 0.83 miligram ve 1xIB'de hazırlanan beş milimolar ATP. Buz gibi soğuk 1xIB ile reaksiyonu istenilen hacime getirin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Taşımayı başlatmak için bu taşıma karışımına substrat proteinhacmine göre %10 hacim sağlar.
Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fotosentetik olarak aktif radyasyonsaniyede metrekare başına 80 ila 100 mikroeinstein ile aydınlatın. Reaksiyonu durdurmak için süspansiyonu buz gibi 1xIB ile sekiz kat seyreltin. Santrifüj 3, 200gs bir mikro santrifüj beş dakika dört santigrat derece.
Supernatant attıktan sonra, buz soğuk 1xIB 120 mikrolitre pelet resuspend. Taşınmış değil artık substrat kaldırmak için, mililitre termilsin başına iki miligram altı mikrolitre ve 1xIB 10 milimolar kalsiyum klorür ekleyerek dış protein sindirmek. Bu proteaz reaksiyonu 40 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
1xIB'de 25 milimolar EDTA ile hacmi ikikatına çıkararak proteazı söndürün. Centrifuge 3, 200 gs bir mikro santrifüj beş dakika dört derece santigrat thys de thylokoids kurtarmak için. Supernatant çıkarıldıktan sonra, 1xIB beş milimolar EDTA 120 mikrolitre de kurtarılan timokoidler resuspend, ve yeni bir 1.5 mililitre tüp transfer.
Tekrar santrifüj sonra 3, bir mikro santrifüj beş dakika boyunca bir mikro santrifüj içinde gs dört santigrat, supernatant atın ve laemmli örnek tampon uygun bir hacim içinde pelet resuspend, 10 milimolar EDTA ile takviye. Örnekleri 10 dakika kaynar su banyosuna koyun. Örnekleri SDS sayfasına göre analiz etmeye devam edin.
iOE17 proteininin cpTat yolu ile taşınması, tanıtılan substrat ile olgun işlenmiş form arasında 2-3 kilodalton büyüklüğünde bir boyut kaymasıile sonuçlandı. Bunun nedeni, başarılı bir cpTat taşımasını gösteren n terminal sinyal peptidinde dekoltedir. Termolizin tedavisi sadece başarılı bir şekilde taşınan ve bu nedenle proteus dirençli olgun bant bırakır.
OE33 öncütünün CPSec1 yolu üzerinden taşınması, olgun substratta bir boyut kayması ve taşınan substratproteus koruması ile sonuçlandı. LHCP öncülünün cpSRP yolu ile timokoid membrana yerleştirilmesi, termolysin sindirimi ile değerlendirilerek 1,5 ila iki kilodalton boyut kaymasına yol açmıştır. Bu başarılı membran ekleme, membran tam proteolysis olgun LHCP bozulma ürün amcaaved korur gibi.
Bu videoyu izledikten sonra enerjiye bağımlı cpTat, cpSec 1 ve cpSRP yolları ile thylokoids ve asa tranportivity izole etmek için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bir kez bu teknik ustalaştıktan sonra düzgün yapıldığında 3-4 saat içinde yapılabilir. Bu videoda resimli olmasa da biz genellikle izole ve fotosentetik aktif kloroplastlar ve thylakoids ile çalışırken laboratuarda havai ışıkları kapalı tutmak.
Bu prosedürü denerken izole kloroplast ve thylakoidleri dört santigrat derecede tutmak önemlidir. Başlangıçta kloroplastları nazikçe askıya almamayı unutmayın. İlk santrifüj adımından sonra Procoll degradesini rahatsız etmekten kaçının.
Ayrıca, yüzde giriş örneği taşıma reaksiyonlarına paralel olarak hazırlanabilir ve substrat taşımasını tahmin etmek için aynı jel üzerinde çalıştırılabilir. Unutmayın, radyoaktif yüzeyler ile çalışan vicdani işleme ve uygun PPE gerektirir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, protein hedeflemesi alanında araştırmacıların thylakoid membranlar arasında protein taşımasını yöneten enerjik, kinetik ve benzersiz mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açmıştır.
