Düğüm ve notochordal plaka fare embriyonik gelişimi sırasında temel organizatörlerdir. Bugün, gelişimbiyologları tarafından bu yapıları görselleştirmek ve incelemek için kullanılan iki tekniği açıklayacağız. İlk protokolde, taramalı elektro mikroskopi, SEM ve ikinci protokole monte immünfloresans nasıl yapılacağını göstereceğiz.
Düğüm ve notoraktal plaka geçici embriyo gün E7.75 de embriyo yüzeyinde mevcut, vurgu küçük cilia dışında, onların kimlik ve SEM tarafından görselleştirme sağlayan yansıtMaktadır. Her iki protokolde de, nispeten küçük fare embriyolarının işlenmesinde kritik adımlar göstereceğiz ve bunları nasıl aktarıp yönlendireceğimiz üzerinde odaklanacağız. Başlamak için, deri ve mezenterler aracılığıyla bir ötenazi hamile farenin karın açın.
Makas ve ince forceps kullanarak, rahim kaldırın. Rahmi distile suda kısa bir süre durulayın ve PBS içeren küçük bir petri kabına yerleştirin. Sonra, bireysel decidui serbest etmek için rahim kasları kaldırmak için bir diseksiyon mikroskop ve ince forceps kullanın.
Diseksiyon mikroskobu altında, her bir kesi bir çift forceps ile tutun ve kırmızı parçası ve beyaz parçası arasında uzunlamasına, tam kalınlıkta kesi yapmak için başka bir çift kullanın. Kesi ile bitişik, yaprak beyaz kısmı boyunca dikey yüzeysel delikler olun. Daha sonra, iki yarıya yatay ayrı yaprak çekin ve dikkatle decidua beyaz kısmından embriyo kaldırın.
Bundan sonra, steril filtrelenmiş PBS içeren yeni bir petri kabına embriyolar transfer. Reichert'in zarını her embriyodan çıkarın, ektosental koniden başlayarak. Gelecekteki genotipleme için, sarısı kese küçük bir parça kaldırın.
Kimyasal bir başlık altında, embriyoları %2,5 glutaraldehit ve steril filtreli PBS'den oluşan EM sınıfı fiksitif içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bundan sonra, embriyolar rahatsız etmeden tüpten fiksatif kaldırın. Embriyoları steril, filtrelenmiş PBS'de oda sıcaklığında 15 dakika üç kez yıkayın.
Embriyoları beşer dakika boyunca %50%70 ve PBS'de seyreltilmiş %85 etanol kullanarak susuz bırakın. %100 etanolde üç kez yıkayın. Embriyoları 20 santigrat derecede %100 etanolde saklayın veya bir sonraki adıma geçin.
Bundan sonra, uygun bir gemiye embroyos aktarın ve kalan sıvı kaldırın. 30 dakika boyunca embriyolara bire bir oranında HMDS ve etanol ekleyin. Daha sonra sıvıyı çıkarın ve 30 dakika boyunca saf HMDS ekleyin.
Bir pipet ile embriyolar sıvı çıkarın ve onları 30 dakika kurumasını bekleyin. Kurutulmuş embriyoları SEM saplarına monte etmek için küçük bir fırça ve çift taraflı bant kullanın. Altın parçacık kaplama için bir püskürtme kaplama makinesiiçine saplamalar yerleştirin.
SEM parçacığının en hassas adımlarından biri, embriyoların doğru yönde saplama üzerine monte etmesidir. Embriyo kasete indikten sonra, oryantasyon artık değiştirilemez. Bundan sonra, bir SEM mikroskobu içine kaplamalı saplamalar yerleştirin, bir vakum uygulamak ve silya ile embriyonik düğümleri ve notochordal plaka hücreleri gözlemlemek.
E7.75'teki embriyoları çıkardıktan sonra, pbs tween'de buz üzerinde bir petri kabına yerleştirin. Kimyasal bir başlık altında, fiksatif çözelti içeren bir mikrosantrifüj tüp embriyolar transfer. Bundan sonra, embriyolara dokunmamaya dikkat edin, tüpten fiksatif kaldırın.
Daha sonra embriyoları PBS'de %0.2 Triton X-100 içeren embriyoları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Embriyolardan son yıkamayı çıkarın ve %10 ısı inaktive serumu ile PBS Triton içeren engelleme solüsyonu ekleyin. Embriyoları en az iki saat boyunca bir nutator'da dört santigrat derecede engelleyin.
Daha sonra, engelleme kaldırın ve engelleme çözeltisi seyreltilmiş birincil antikor yaklaşık bir mililitre ekleyin. Embriyoları bir gecede bir nutatorla dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Birincil antikor çıkarın ve daha sonra kullanmak için kaydedin.
Sonra, pbs Triton ile iki kez embriyoları durulayın. Ve bir nutator üzerinde 30 dakika boyunca üç kez yıkayın. Birincil antikor konak türlerine karşı seyreltilmiş floresans konjuge ikincil antikor ile yıkama değiştirin.
Ve bir gece boyunca bir nutator'da dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Sonra, ikincil antikor kaldırmak ve iki kez PBS Triton ile embriyoları durulayın. PBS Triton ile 30 dakika boyunca üç kez yıkamadan önce.
Son yıkamayı, seyreltilmiş floresan konjuge phalloidin ve seyreltilmiş DAPI ve leke içeren PBS Triton ile oda sıcaklığında bir saat değiştirin. Sonra, PBS Triton'da embriyoları iki kez durulayın. Ve oda sıcaklığında 30 dakika PBS Triton ile yıkayın.
Bundan sonra, PBS Triton'u PBS ile değiştirin ve embriyoları buzda bırakın. Sonra temiz hazırlamak, pozitif yüklü slaytlar, kapak fişleri ve sulu gliserol tabanlı montaj ortamı. Slayta birbirinden 15 milimetre uzakta iki adet açık bant yerleştirin.
Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında, bir embriyoyu slayta taşımak için değiştirilmiş bir P200 pipeti kullanın. Ince forceps kullanarak, embriyo açmak için sarısı kesesinin lateral taraflarında iki tam kesim yapmak. Daha sonra, ventral tarafı yukarı embriyo pozisyon.
Embriyoya 50 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Daha sonra, kapak fişine montaj lı bir ortam ekleyin. Bant iki parça straddling yerleştirin ve bükülmüş bir iğne kullanarak embriyolar üzerine yavaş yavaş indirin.
Fazla montaj ortamını kaldırmak için emici bir mendil kullanın ve kapak fişini hareket ettirmemeye özen azalın. Sonra, kapak kayma taraflarını mühürlemek için oje cömert bir miktar kullanın. Son olarak, embriyoları gözlemlemek için bir tarama konfokal mikroskop kullanın.
Embriyoların üzerine monte ettikten sonra kapak kaymahareket etmemek çok önemlidir, çünkü 3D görselleştirme için onları bozabilir. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak, e7.75'te bir mutant fare embriyosu ve yabani tipte düğümün oluşumu gözlendi. Vahşi tipçukur şeklindedüğüm aksine, mutant embriyolar düzleştirilmiş ve düzenli bir düğüm ve nodalcordal plaka görüntülenir.
Tüm şimdi immünoresans için hücre düzeyinde Strip 1 mutant embriyolarda düğüm ve notochordal plaka oluşumu kusurları çalışmak için kullanılmıştır. Veriler, mutant embriyolarında anormal ve bodur olduklarını gösterdi. Düğüm ve nodalkortal plaka sadece geçici embriyo yüzeyinde mevcut, bu nedenle zamanlama SEM başarısı için gereklidir.
Örneğin, iki ila dört somit embriyolar uzun silia ile olgun bir düğüm SEM analizi için iyidir. Saflık reaktifler de bu tekniklerin başarısı için gereklidir, özellikle SEM tarafından ultrayapı probing. Embriyo sopa Küçük yabancı maddeleri genellikle büyük eserler neden.
Bu iki tekniğin normal gelişim sırasında düğüm ve nodalkortal plakanın yapısı ve bu yapıların oluşumunda kusurlar gösteren mutantlar hakkında tamamlayıcı bilgi verdiğine inanıyoruz.
