Name: functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica
Uploaded: 2018-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica at JoVE.com

1. ifade ve yalıtım bir böcek hücre Baculovirus-aracılı ifade sistemi ile hedef proteinlerin
<ol><li>Directionally evi sinekler üzerinden hedef proteinlerin PCR ürünleri künt uçlu klon.<ol>
<li>PCR astar yeşil flüoresan protein (GFP) ve ev sinek MdαE7 gene onların dizileri ve seçtikleri vektörü (Tablo 1) özel gereksinimleri temel tasarım.</li>
		<li>Bir transfer, prova-okuma DNA polimeraz ve astar adım 1.1.1 150 µL PCR reaksiyon (30 µL tepki arabelleği, 10 mM dNTPs, DNA polimeraz 1,5 µL, ev sinek şablon DNA, ileri astar 7.5 µL 6 µL 3 µL yapmak için kullanın Bir son Hacim 150 µL su ile ters astar 7.5 µL). PCR reaksiyon için 30 98 ° c ısı 35 98 ° C devredir 10 ardından s, s, 53 ° C 30 s ve 72 ° C 60 s ve sonra son bir uzantısı için 2 dk 72 ° C'de).<ol>
<li>% 1'özel jel ile 150 µL PCR ürününün çalıştırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Özel hedef DNA parçalardan jel keskin, temiz neşterle tüketim: 1317 bp MdαE7 ve 858 için bp GFP için. Piyasada bulunan jel ekstraksiyon kiti üreticisinin protokolüne (Malzemeler tablo) kullanarak DNA arındırmak. 15 µL distile su içinde saf DNA geçiyoruz.</li>
		<li>% 1'özel jel bütünlüğünü kontrol etmek için saf DNA 1 µL ile çalıştırın. Saf DNA'ın başka bir 1 µL konsantrasyonları ile spektrofotometre ölçmek için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir giriş plazmid hedef proteinler için inşa<ol>
<li>Klonlama tepki kadar ayarla. Mix taze DNA ürün--dan adım 1.1.3 saflaştırılmış ve ticari olarak mevcut giriş vektörler içeren attL-siteleri (Tablo reçetesi) molar oranı 1:1 (0,5-2 70-200 ng/µL konsantrasyonlarda taze PCR ürününün µL: 0.5 µL vektör). Daha sonra piyasada bulunan tuz solüsyonu (1, 2 M NaCl2 ve 0,06 M MgCl2) 1 µL ekleyin ve bir final hacmi 6 µL. için su ekleyin karışımı yavaşça ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Kimyasal olarak yetkili E. coli 50 µL içine adım 1.2.1 reaksiyon ürünleri klonlama 4 µL aktarım hücreleri. 30 dk. Isı şok buz üzerinde 30 için hücreleri kuluçkaya s sallayarak olmadan bir 42 ° C su banyosunda.</li>
		<li>Tüp buz için başka bir 2 dk. eklemek 250 µL oda sıcaklığında S.O.C. Orta (%2 tryptone % 0.5 maya ekstresi 10 mM NaCl; 2.5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM glikoz) geri koyun. Hafifçe sallayarak ile 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>50-200 µL adım 1.2.3 seçici LB tabaklarda (1 g tryptone NaCl 1 g Maya ekstresinin 0.5 g; 1,5 g 100 mL distile su içinde çözünmüş agar. bakteriyel kültürünün yaymak Basınçlı kap ve %0,1 50 mg/mL sefaloridin ekleyin). LB plakalar koloni büyüme için 37 ° C'de 16 h için kuluçkaya.</li>
		<li>5-10 kolonileri alın ve onları tek tek askıya 5 µL distile su yeniden.</li>
		<li>PCR reaksiyon arabelleği 5 µL, 10 mM dNTPs 0.5 µL, DNA polimeraz, askıya alınan kolonilerin 1 µL, 10 µM M13 ileri astar 1,25 µL 0,25 µL ekleyerek gerçekleştirmek, hedef gen ve su son hacmiyle 25 µL. 10 µM ters astar 1,25 µL PCR ısı reaksiyon 98 ° c 30 35 98 ° C devredir 10 ardından s, s, 53 ° C 30 s ve 72 ° C 60 s ve sonra 2 dk (Tablo 1) için 72 ° C'de son bir uzantısı.</li>
		<li>Adım 1.2.5 (100 mL 0,17 M KH2PO4 ve 0,72 M K2HPO4 ile 6 g tryptone, 12 g Maya ve 2 mL içeren taban suyu orta 450 mL içeren fosfat tampon TB medyada askıya alınan kolonilerin 3 µL yeniden kültür sterilize, gliserol, %0,1 50 mg/mL sefaloridin içeren) için 16 h. üreticisinin protokol sonrası ultra-saf plazmid DNA ayıklayın.</li>
		<li>1.2.7. adımdaki ticari Sanger kullanım 200 ng/µL ultra-saf plazmid M13 ileriye ve geriye doğru astar ile sıralama. Vektör üreticisi tarafından sağlanan sıra harita dayalı hedef gene doğru ekleme doğrulayın.</li>
		<li>-20 ° c ' MdαE7 ve GFP sıra doğrulanmış ultra-saf plazmid DNA örnekleri depolamak Not: Bu giriş plazmid DNA MdαE7 ve GFP vardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rekombinant baculovirus Lambda rekombinasyon (LR) tepkimesi gerçekleştirerek oluşturmak.<ol>
<li>Sırasıyla, 300 ng/µL giriş plazmid DNA GFP, MdαE7 adım 1.2.7 veya giriş plazmid DNA ile ticari olarak kullanılabilir (içeren attL siteleri) 5 µL hücre transfection kit tarafından sağlanan Kloramfenikol Asetiltransferaz gen (CAT) 1 µL mix C-terim doğrusal DNA ( attR siteleri içeren) 250 µL PCR tüpleri '. Toplam hacmi 8 µL yapmak TE arabellek ekleyin. Not: GFP ve kedi reaksiyonları kontrol grubu kullanılmıştır.</li>
		<li>Piyasada bulunan Lambda rekombinasyon (LR) enzim karışımı (Tablo reçetesi) her adım 1.3.1 LR reaksiyonu katalizler karışımı içine 2 µL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 25 ° C gece (≈16 h) kuluçkaya. Not: LR tepki bir attL içeren giriş plazmid DNA bir attbir attB içeren ifade virüs oluşturmak için R içeren doğrusal DNA C-vade ile rekombinasyon kolaylaştırır. Bu adım her hedef protein için rekombinant baculovirus oluşturur.</li>
		<li>1.3.2. adımdaki LR tepki ürünlerin 1 µL seyreltik 20 X. PCR bir Polyhedrin ileri astar ve V5 ters astar (Tablo 1) kullanarak gerçekleştirin. 5 µL PCR ürünlerinin kalite kontrol etmek için % 1'özel jel çalıştırmak için kullanın. Şekil 1 MdαE7 gen gelen LR reaksiyon ürünü bir örnek gösterir.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig1.jpg"> Şekil 1: örnek sonuçlarını PCR analizi ile MdαE7 LR tepki. 2 µL LR tepki 200-fold sulandırmak ve seyreltme Polyhedrin ileri astar ve V5 ters astar ile birlikte 2 µL 25 µL PCR gerçekleştirmek için kullanın. 5 µL PCR ürünlerinin % 1'özel jel LR tepki kalitesini kontrol etmek için çalıştırmak için kullanın. bir
<ol start="4"><li>Böcek Sf9 hücre transfect<ol>
<li>Kültür böcek Sf9 hücrelerle T25 tam hücre büyüme orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS) ile orta serum içermeyen) 5 mL şişe 27 ˚C, tedavi.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve alt bağlı hücrelerle taze tam hücre büyüme orta 3 mL sifonu. 0.5 mL yeniden askıya alınan hücre yeni bir tedavi T25 şişesi aktarın. Tam büyüme orta 4.5 mL ekleyin. 27 ° C'de 3-4 gün öncesine kadar sonraki transfer için kuluçkaya.</li>
		<li>Tohum log fazı büyüme böcek Sf9 2 mL kültür hücreleri (≈3.0-5.0 × 106 hücreler) hücre kültürü iyi üzerinde eşit olarak. Hücreleri başlıklı oda sıcaklığında en az 3 h için eklemek izin verir.</li>
		<li>Hücre ek bir ters faz mikroskop vasıl 250 X ile gözlemleyerek kontrol edin. Hücre kültür orta kaldırın ve Grace'in böcek Orta 2 mL ile değiştirin.</li>
		<li>Transfection karışımı A çözüm (100 µL Grace'in böcek orta ile piyasada bulunan hücre enfeksiyon reaktif (Tablo reçetesi) 8 µL) ve transfection karışımı B çözüm her hedef gen (9 µL LR reaksiyon ürünleri adım 1.3 hazırlamak unsupplemented Grace'in böcek orta 100 µL ile) 1,5 mL santrifüj kapasitesi tüpler, anılan sıraya göre.</li>
		<li>Transfection karışımı A ve B birlikte tüpler dokunarak karışımı yavaşça. Başlıklı 35 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Eşit olarak adım 1.4.4 adımından 1.4.6 dropwise numaralı seribaşı hücreleri üzerine karışımı ekleyin. Wells bantlar ile mühür ve 27 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
		<li>Grace'in böcek Orta 2 mL tam büyüme orta 2 mL ile değiştirin. Rekombinant baculovirus karşı olumsuz seçmek için her kuyuya 100 µM Gansiklovir ekleyin. Wells teyp ile mühür ve 72 h 27 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>72 h sonrası enfeksiyon hücre kültür orta her kuyudan toplamak ve 1,5 mL santrifüj tüpleri için transfer. 4 ° C'de hücreler veya büyük enkaz kaldırmak için 5 min için 1.500 x g, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant yeni 1,5 mL santrifüj tüpler içine aktarın. Onlara ışık koruma 4 ° C'de depolayın. Not: P1 virüs hisse senedi çözümleri her hedef gen için bunlar.</li>
		<li>Düşük-titresi P1 viral stok (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) bir yüksek titresi P2 viral stok (5 × 107-1 × 108 pfu/mL) yükseltmek.</li>
		<li>Tohum log fazı büyüme böcek Sf9 2 mL kültür hücreleri (≈3.0-5.0 × 106 hücreler) hücre kültürü iyi üzerinde eşit olarak. Hücreleri başlıklı oda sıcaklığında en az 3 h için eklemek izin verir.</li>
		<li>P1 virüs stokunun de adımı 1.4.12, sırasıyla seribaşı adımda 1.4.10 hücre elde 5 µL aşılamak. Daha sonra her şey için 100 µM Gansiklovir ekleyin. Kuyu mühür ve 72 h 27 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>P2 virüs hisse senedi çözümleri 72 h sonrası enfeksiyon toplamak. Işık koruma 4 ° C'de depolayın. Not: Bu P2 virüs hisse senedi çözümleri her hedef gen vardır.</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Adımları 1.4.12-1.4.14 P3 virüs hisse senedi çözümleri toplamak için P2 virüs stokunun 5 µL ile yineleyin. Not: Bu P3 virüs hisse senedi çözümleri her hedef gen vardır.</li>
		<li>Tüm inşa baculovirus ışık koruma 4 ° C'de depolayın. Not: GFP ve kedi gen kontrol grubu servis. Şekil 2 farklı amplifikasyon aşamalarında GFP-rekombinant baculovirus tarafından enfekte hücreleri belirtileri gösterdi.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig2.jpg"> Resim 2: Sf9 enfekte belirtileri örneği hücreleri farklı baculovirus amplifikasyon aşamalarında. Rakam GFP-rekombinant baculovirus hücreleri altında doğal ışık ve floresan ışık gösterir. P1 enfeksiyon aşamada enfeksiyon oranı düşüktür. P2 enfeksiyon aşamada enfeksiyon oranı önemli ölçüde geliştirilmiş oldu. P3 enfeksiyon aşamada hücre çapı, hem de hücre büyümesini kesilmesi hemen hemen tüm hücreleri hücre kültür plaka, dekolmanı belirtileri gösterdi artırır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58106/58106fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="5"><li>Böcek Sf9 hücrelerdeki hedef proteinlerin büyük ölçekli ifade<ol>
<li>Kültür günlük faz büyüme böcek Sf9 hücre T25 olmayan tedavi şişeler ortamda tam büyüme ile 10 mL.</li>
		<li>1.5.1. adımda 72 h hücre kültürleri bulaştırmak için 200 µL P2 virüs hisse senedi çözüm (1.4.14. adımda elde) ekleyin.</li>
		<li>72 h sonrası enfeksiyon hücre kültür orta toplamak. 4 ° C'de 5 min için 1.500 x g, santrifüj</li>
		<li>1 mL 0.1 M PBS arabelleği (pH 7.5) ile iki kez süpernatant ve yıkama granül atmak.</li>
		<li>Tam olarak hücre topakları böcek hücre proteini ayıklama & lizis arabellek (Tablo reçetesi) 1 mL ile geçiyoruz. % 10 gliserol hücre lizis ekleyin. Hemen-80 ° C'de depolayın</li>
		<li>Adımları 1.5.1-1.5.5 P2 virüs hisse senedi çözüm kontrol grubu hizmet etmek için kedi proteinlerin ile yineleyin. Not: 1.5 nüsha olarak farklı protein hazırlıkları adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bir hücre tabanlı MTT sitotoksisite tahlil
<ol><li>Kültür günlük faz büyüme (1.5-2.5 × 106 hücre/mL) böcek Sf9 hücre T25 olmayan tedavi şişeler ortamda tam büyüme ile 5 mL.</li>
	<li>2.1. adımda nazik sallayarak 27 ˚C ile 48 h hücre kültürleri bulaştırmak için P1 virüs hisse senedi çözüm (1.4.14. adımda elde) 25 µL ekleyin.</li>
	<li>100 mM Asetonitril Permetrin standart stok çözümlerinde hazırlayın. Asetonitril 50 mM, 25 mM, 12,5 mM ve 6.25 mM 500 µL, 250 µL, 125 µL ve 62.5 µL Permetrin hisse senedi çözüm toplam hacmi çok 1000 µL, sırasıyla ekleyerek sulandırmak için kullanın.</li>
	<li>Eşit olarak 2 × 105 hücre/mL yoğunluğu 24-şey plaka içine tam büyüme orta 300 µL ile desteklenmiş adım 2.2 enfekte hücre kültürleri 200 µL tohum.</li>
	<li>Permetrin standart çözümleri (6.25 mM, 12,5 mM, 25 mM ve 50 mM) 4 µL son konsantrasyonu 50 µM, 100 µM, 200 µM ve 400 µM, sırasıyla yapmak için her kuyuya ekleyin. Sadece Asetonitril 4 µL kuyular için hücre canlılığı hesaplamaları (Şekil 3) içine ekleyin.</li>
	<li>Plakalarının bantları ve ışık koruma ile 48 h 27 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>5 mg/mL MTT (Thiazolyl mavi Tetrazolium bromür) reaktif arabellekte çözünmüş hazırlamak (NaCl, KCl, 0,05 g 2.0 g 0,36 g NaH2PO4∙2H2O, NaH2PO4, 0,05 g 0,28 g KH2PO4 çözünmüş 200 mL distile su, pH 7.5).</li>
	<li>Hücre kültür orta adım 2.6 48 h kuluçka sonra alt bağlı hücre katmanı dokunmadan kaldırın. 200 µL MTT reaktif adım 2.7 her kuyuya ekleyin. Her şey (Şekil 3) oluşan koyu mor formazan precipitates kadar 4 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Koyu mor formazan her şey formunda precipitates kadar 4 h için 37 ° C'de kuluçkaya. Tam precipitates (Şekil 3) çözülmeye DMSO 500 µL ekleyin.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig3.jpg"> Şekil 3: örnek MTT sonuçları. 48 saat sonra kedi gen bir 24-şey hücre kültür plaka ifade eşit olarak tohum 500 µL hücreleri kedi rekombinant baculovirus çözüm, P1 virüs hisse senedi çözümü ile enfeksiyon sonrası. Sırasıyla, 50 µM, 100 µM, 200 µM ve 400 µM nihai toplama yapmak için her satırda farklı bir doz (6.25 mM, 12,5 mM, 25 mM ve 50 mM), 4 µL Permetrin ekleyin. Denetim satır sadece Asetonitril ile tedavi ve plaka CK işaretlenmiş. (A) sonra kuluçka 27 ° C'de 48 h, hücre kültürü orta üst katmandaki atmak ve sarı renkli MTT reaktifler 200 µL ile değiştirin. Sonra 48 h. koyu mor renkli azaltma her şey hayatta kalma hücreleri sarı renk metabolize yeteneğine sahip olduğunu gösteren form precipitates için 37 ° C'de MTT reaktifler koyu mor renkli çökelti kuluçkaya. (B) 500 µL DMSO solvent kurulan çökelti çözülmeye her kuyuya eklendi. Her absorbans değeri de 540, spektrofotometre tarafından algılandı nm. Permetrin konsantrasyonları arttıkça, rengi koyu kırmızı ışık kırmızı hücre viabilities yavaş yavaş azalma düşündüren, yavaş yavaş değişir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58106/58106fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="10"><li>Çözünmüş çözüm 200 µL 96-şey plaka aktarın. Ölçmek absorbans değerleri, 540 nm Mikroplaka Okuyucu (Tablo reçetesi) kullanarak.</li>
	<li>Hücre canlılığı bu sadece tedavi Asetonitril hücre ile tedavi Permetrin hücrelerin absorbans değerleri karşılaştırarak hesaplayın.</li>
	<li>Kontrol grubu için Kloramfenikol Asetiltransferaz (CAT) Rekombinant baculovirus 1.4. adımda elde P2 virüs hisse senedi çözümü ile tüm adımları yineleyin.</li>
	<li>4 kez farklı virüs hazırlıkları için yineleyin.</li>
</ol>3. Vitro metabolik tahlil
<ol><li>100 mM Asetonitril Permetrin standart stok çözümlerinde hazırlayın. Asetonitril 50 mM, 25 mM, 12,5 mM ve 6.25 mM sulandırmak için kullanın. HPLC kullanarak her konsantrasyon altındaki karşılık gelen en yüksek alan tespit. Oluşturmak ve farklı Permetrin konsantrasyonları ile en yüksek alanına bağlı Permetrin standart eğri hesaplamak.</li>
	<li>Adım 1.5 Bradford yöntemleri21ile protein konsantrasyonları ölçmek.</li>
	<li>700 µL 40 µM Permetrin standart metabolik reaksiyon ve proteinlerin 0.2 M Tris-HCl tampon (pH 7,4) çözünmüş adım 1.5 elde 1 mg hazırlamak. Nazik sallayarak ile 2 h 30 ° C'de kuluçkaya. Işıktan korumak.</li>
	<li>Reaksiyon buz gibi Asetonitril 700 µL ekleyerek gidermek. Nazik sallayarak ile başka bir 30 dk 30 ˚C, kuluçkaya. Işıktan korumak.</li>
	<li>16.000 x g oda sıcaklığında 2 min için tepki karisimin santrifüj kapasitesi. Süpernatant ve 0,45 µm membran filtreden toplamak. Filtrasyon HPLC analiz için ultraclean kahverengi cam şişe içine aktarın.</li>
	<li>HPLC (mobil faz A: % 90 Asetonitril ve % 10 su; optimal kromatografik koşullar altında çalıştırmak PH %2.3 85 fosforik asit ile için mobil faz B: %5 Asetonitril ayarlanabilir). Degrade elute 1 mL/dk ve bir dalga boyu, ölçü 232 bir akış oranı ile nm.</li>
	<li>Eklendi protein örnek reaksiyonlar ile karşılaştırarak Permetrin tükenmesi yüzdesini hesaplamak.</li>
	<li>1.5.6. adımda elde kedi protein denetimi olarak sunmak için kullanır.</li>
	<li>1.5.7. adımda farklı protein ürünleri ile tüm adımları yineleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+house+flies+from+the+United+States:+Resistance+levels+and+frequency+of+pyrethroid+resistance+alleles.">Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+transcriptomal+linkage+analysis+of+gene+co-regulation+in+insecticide+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica.</a> BMC Genomics. 14, 803 (2013).</li><li>Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+mosquitoes:+impact,+mechanisms,+and+research+directions.">Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions.</a> Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+and+genetic+study+reveal+amplified+carboxylesterase+genes+implicated+in+temephos+resistance,+in+the+Asian+tiger+mosquito+Aedes+albopictus.">Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus.</a> e0003771. 9, e0003771 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+gene+amplifications+associated+with+insecticide+resistance+in+Aedes+albopictus:+Geographical+distribution+and+evolutionary+origin.">Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).</li><li>Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).</li><li>Feng, X., Li, M., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+genes+in+pyrethroid+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).</li><li>Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+two+P450s,+CYP9M10+and+CYP6AA7,+in+the+permethrin+resistance+of+Culex+quinquefasciatus.">The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).</li><li>Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+carboxylesterase+gene+associated+with+organophosphorous+insecticide+resistance+in+cotton+aphids,+Aphis+gossypii+(Glover).">Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).</li><li>Zhang, L., Gao, X., Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cypermethrin+resistance+associated+with+high+carboxylesterase+activities+in+a+strain+of+house+fly,+Musca+domestica+(Diptera:+Muscidae).">Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).</li><li>Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+the+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: the MTT assay.</a> Cancer cell culture. , 237-245 (2011).</li><li>Stockert, J. C., Bl&#225;zquez-Castro, A., Ca&#241;ete, M., Horobin, R. W., Villanueva, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTT+assay+for+cell+viability:+Intracellular+localization+of+the+formazan+product+is+in+lipid+droplets.">MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets.</a> Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assays.">Cell viability assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2013).</li><li>Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).</li><li>Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+resistance+to+synthetic+and+natural+xenobiotics.">Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics.</a> Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+metabolism+of+a+pyrethroid+insecticide,+permethrin,+and+its+hydrolysis+products+in+rats.">The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats.</a> Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).</li><li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system.">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).</li><li>Bulter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+fungal+laccase+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+directed+evolution.">Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).</li><li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li></ol>

Son yıllarda, kapaklı ifade sistemleri yaygın olarak hızlı ve büyük miktarda protein, böylece biyokimyasal ve fonksiyonel belirlenmesi ve enzimler vitrokarakterizasyonu izin izole etmek için kullanılmıştır. Bugüne kadar Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeve Spodoptera frugiperda gibi birkaç farklı model sistemleri Rekombinant protein ifade ve seçim için adapte edilmiştir vitro sistem baktılar proteinler22<...

Böcek ilacı direnç Şu anda evi sinek denetim dünya çapında1,2önemli bir konudur. Böcek ilacı direnç mekanizmasının belirlemek için çabaları bu konunun daha iyi anlamayı kolaylaştırır ve böylece etkili önlemek veya direnç geliştirme3yayılmasını en aza indirmek için roman stratejileri sağlamak. Carboxylesterases, bir büyük detoksifikasyon enzimler olarak iyon ve böcek öldürücüler çeşitli böcekler4,5,6metabolize rolleri için ilgi çok çekmiştir. Bizim önceki çalışma evi sinekler içinde birden çok carboxylesterases tespit etti ve onların ifade düzeyleri sadece yapısal dayanıklı ALHF zorlanma yukarı düzenlenir değildi ama aynı zamanda yanıt olarak Permetrin tedaviler7 indüklenen için daha yüksek düzeyde olabilir . Ancak, böcek ilaçları metabolize içinde bu carboxylesterase gen işlevsel karakterizasyonu keşfedilmeyi kalır.
Erken 1980'li yıllarda8ilk raporda beri yabancı gen baculovirus-aracılı ifade sistem yaygın olarak yüksek protein üretim verimliliği ve ökaryotik protein yetenekleri9işleme nedeniyle istihdam edilmiştir. Bu ikili sistem iki temel unsurdan oluşur: konak hücreleri ve büyük ölçekli ifade rekombinant baculovirus tarafından enfekte hücreleri tarafından baktılar proteinlerin içine yabancı gen teslim inşa rekombinant baculovirus. Son on yıl boyunca baculovirus aracılı hücre ifade sistem yaygın rekombinant proteinler membran bağlı proteinler arasında böcek sitozolik enzimler arasında değişen, binlerce üretmek için kullanılmıştır ve10memeli hücreleri. Bizim önceki çalışma başarıyla birden fazla CYP450 enzimleri bu sistem11ile böcek Sf9 hücrelerdeki dile getirdi. Bu çalışmada, böcek Sf9 hücre bulaştırmak için bir carboxylesterase-rekombinant baculovirus inşa, farklı Permetrin tedaviler ve büyük ölçekli ifade carboxylesterase proteinler vitro için hücre tolerans incelenmiştir fonksiyonel keşif. Önceki çalışmalar12,13tarafından kabul edilen birden çok carboxylesterase izozim karışımları böcek homogenates üzerinden araştıran yerine, bu böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistemi belirli ifade sağlar ve biyokimyasal ve yapısal özelliklerini daha iyi karakterizasyonu için hedeflenen proteinlerin yalıtım.
Tetrazolium tuz tabanlı tahlil (MTT) geliştirilen ve hücre canlılığı ölçmek için optimize edilmiş yüksek üretilen iş kolorimetrik yöntemi olduğunu. Bu tahlil sadece canlı hücreler sarı renkli MTT reaktif colorimetrically sonra çözünmüş organik çözücüler14'analiz edilebilir bir koyu mor renkli formazan çökelti için metabolize yeteneğine mekanizması dayanır, 15. Birkaç daha doğru ama Trypan mavi dışlama ve timidin titrasyon tahlil16,17, gibi zaman alan yöntemleri son yıllarda geliştirilmiştir. Ancak, hücre tabanlı MTT tahlil hala şu anda hızlı bir şekilde hücre canlılığı algılamak için en hızlı ve kolay işletilen yöntemi olarak tanınır. Burada, böcek ilacı tedaviler karşı hücre tolerans keşfetmek için MTT tahlil kullanırız. Güçlü carboxylesterase rekombinant baculovirus ile enfekte hücreleri geliştirilmiş dayanıklılık için böcek öldürücüler, buna karşılık onların katılımı böcek ilacı direnç www.cdc.gov/drugresistance öneriyor carboxylesterases metabolik rolleri destekleyen.
Ayrıca, bir vitro metabolik tahlil de bu çalışma yapılmıştır. Carboxylesterases hydrolytic faaliyetleri yansıtmak için α-napthyl asetat (α-NA) ve β-naftil asetat (β-NA) gibi ortak yüzeylerde kullanın genel carboxylesterase deneyleri ile karşılaştırıldığında, vitro metabolik çalışma doğru bir yol kabul edilmektedir doğrudan carboxylesterases böcek öldürücüler18doğru faaliyetlerinin ölçmek için. Bu yöntem başarılı bir şekilde çeşitli böcek böcek ilacı direnç11,19,20ile birlikte birden çok sitokrom P450s karakterize etmek için istihdam edilmiştir. Ancak, bu yöntem henüz carboxylesterase çalışmalarda uygulanmamıştır. Baculovirus-aracılı ifade sistem tarafından üretilen carboxylesterase proteinler durumu ile daha da güçlü kanıtı sağlayabilir Permetrin doğru carboxylesterases bir vitro metabolik çalışma gerçekleştirebilirsiniz pyrethroid direnç içinde ev veriyor, carboxylesterases, uçar.

<table><tbody><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs inc.</td><td>M0491L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K240020</td><td>S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K210002</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirect&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Kits</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>11791-023</td><td></td></tr><tr><td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>12562-019</td><td>Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit</td></tr><tr><td>pENTR-CAT plasmid</td><td>Invitrogen by life technology</td><td></td><td>Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL</td></tr><tr><td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 cells in Sf-900 III SFM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction &amp;amp; Lysis Buffer</td><td>G Biosciences by A Geno Technology Inc</td><td>786-411</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM (1&amp;times;) Serum Free Medium Complete</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>12658-019</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s Insect Medium, unsupplemented</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>11595030</td><td></td></tr><tr><td>Permethrin (isomers) analytical standard</td><td>SUPELCO by Solutions Within&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>442748</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (analytical graded)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (analytical graded)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 &amp;mu;m GHP Membrane (HPLC Certified)</td><td>Pall Life Sciences</td><td>21890388</td><td></td></tr><tr><td>Alliance Waters 2695 HPLC System</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycle</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica

Carboxylesterase-aracılı metabolizma çeşitli böcek böcek ilacı direnci önemli bir rol oynamaktadır düşünülmektedir. Böcek ilacı direnci veriyor onların rolleri keşfedilmeyi kaldı, ancak birkaç carboxylesterase genler dayanıklı ev sinek gerginliği, yukarı düzenlenir bulunamadı. Burada, biz bir protokol carboxylesterases fonksiyonel karakterizasyonu için tasarlanmıştır. Üç örnek deneyler sunulmaktadır: (1) ifade ve yalıtım carboxylesterase protein aracılığıyla bir baculovirus-aracılı böcek Spodoptera frugiperda (Sf9) hücre ifade sistemi; (2) bir hücre tabanlı MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromür) böcek hücreleri toleransları farklı Permetrin tedavilere; ölçmek için sitotoksisite tahlil ve carboxylesterases doğru Permetrin metabolik yeteneklerini keşfetmek için (3) vitro metabolik çalışmaları. MdαE7 dayanıklı bir evden klonlanmış carboxylesterase gen soy ALHF sinek ve Sf9 hücreleri enfeksiyon için rekombinant baculovirus oluşturmak için kullanılan. Hücre viabilities farklı Permetrin tedaviler karşı MTT tahlil ile ölçüldü. Permetrin için denetim gruplarının (kedi-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri ve GFP-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri) ile karşılaştırıldığında deney grubu (MdαE7-rekombinant baculovirus enfekte hücreleri) Gelişmiş hücre toleransları tedaviler MdαE7 yeteneklerini böylece hücrelerin kimyasal zararlardan korunması, böcek öldürücüler, metabolize önerdi. Bunun yanı sıra, carboxylesterase proteinler böcek Sf9 hücrelerde ifade ve vitro metabolik çalışma yapmak için izole. Bizim sonuçları önemli vitro bir metabolik verimlilik MdαE7 Permetrin, doğrudan böcek ilaçları metabolize içinde carboxylesterases tutulumu gösteren doğru belirtilen ve böylece evde böcek ilacı direnci veriyor uçar.

Hücre canlılığı farklı Permetrin tedaviler (ÇMT tahlil) doğru
Permetrin sitotoksisite MdαE7-rekombinant enfekte baculovirus Sf9 hücreleri (deney grubu) ve kedi-rekombinant (enfekte baculovirus kit tarafından sağlanan) baculovirus enfekte hücreleri (kontrol grubu) incelenmiştir. Gelişmiş hücre toleransları için hücreleri kuvvetle ifade Permetrin MdαE7 içinde bu carboxylesterase böcek öldürücüler ve böylec...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica at JoVE.com

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Burada, bir aracılı baculovirus böcek hücre ifade sistemi ile ev sinek carboxylesterase proteinler vitro üretmek ve daha sonra işlevsel olarak Permetrin, metabolize onların rolleri böylece, karakterize bir protokol pyrethroid veriyor mevcut rezistansının hücre tabanlı MTT tahlil ve vitro metabolik çalışmalar yürütmektedir.

Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

functional-characterization-carboxylesterases-insecticide-resistant

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

7.4K Görüntüleme.  Auburn University. Burada, bir aracılı baculovirus böcek hücre ifade sistemi ile ev sinek carboxylesterase proteinler vitro üretmek ve daha sonra işlevsel olarak Permetrin, metabolize onların rolleri böylece, karakterize bir protokol pyrethroid veriyor mevcut rezistansının hücre tabanlı MTT tahlil ve vitro metabolik çalışmalar yürütmektedir.

Video: Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Method for Evaluating Insecticide Efficacy against Bed Bug, Cimex lectularius, Eggs and First Instars

Standard toxicity evaluations of insecticides against insect pests are primarily conducted on adult insects. Evaluations are based on a dose-response or concentration-response curve, where mortality increases as the dose or concentration of an insecticide is increased. Standard lethal concentration (LC50) and lethal dose (LD50) tests that result in 50% mortality of a test population can be challenging for evaluating toxicity of insecticides against non-adult insect life stages, such as eggs and early instar or nymphal stages. However, this information is essential for understanding insecticide efficacy in all bed bug life stages, which affects control and treatment efforts. This protocol uses a standard dipping bioassay modified for bed bug eggs and a contact insecticidal assay for treating nymphal first instars. These assays produce a concentration-response curve to further quantify LC50 values for insecticide evaluations.

A Method for Evaluating Insecticide Efficacy against Bed Bug,  Cimex lectularius, Eggs and First Instars

Insecticide evaluations are often targeted against adult insects, rather than immature stages. Here, we present a protocol for evaluating insecticides against bed bug eggs with a comparison to the first nymphal bed bug stage. These protocols could be adjusted for other insects to evaluate insecticide efficacy in non-adult life stages.

Yatak Bug karşı Böcek etkinliğini değerlendirmek için bir yöntem,<em&gt; Cımex lectularius</em&gt; Yumurta ve İlk instars

Standard toxicity evaluations of insecticides against insect pests are primarily conducted on adult insects. Evaluations are based on a dose-response or ...

Çevre

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Biyokimya

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Davranış

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

İnsektisit Direnci İzleme için biyoanalizlere

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Biyoloji

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Sivrisinekler ve Meyve Sinekleri için İnsektisit Toksisitesini Ölçmek için Topikal Uygulama Biyotahlili

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Control of Aedes albopictus Mosquito Larvae with Carpesium abrotanoides L.

As a vital vector of dengue fever, yellow fever, and other mosquito-borne diseases, Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) can be broadly distributed worldwide and cause a severe threat to public health. To date, considering the fast-emerging insecticide resistance in the mosquito, the development of new botanical insecticides to control and reduce Ae. albopictus is urgent and crucial. Therefore, to investigate the decoction effect of the plant C. abrotanoides L. on mosquito larvae killing, we detected the mortality of larvae after treatment with different concentrations (60 mg/mL, 120 mg/mL, and 180 mg/mL) of decoction within a series of time points (12 h, 24 h, 36 h, and 48 h). We found that 24 h with 180 mg/mL C. abrotanoides L. decoction treatment killed 92.35% of mosquitoes relative to the control treatment. Meanwhile, 36 h with 120 mg/mL could also kill more than 90% of mosquitoes. Furthermore, Carassius auratus populations were exposed to 120 mg/mL C. abrotanoides L. decoction for 36 h and were not dead. The mortality evaluation indicated that this concentration is not a harmful level of ecological environmental pollution. This study provides a possible plant candidate that could be used for designing plant-derived insecticides. Additionally, these methods can be altered and applied to other mosquito species.

Control of Aedes albopictus Mosquito Larvae with Carpesium abrotanoides L.

Using the Carpesium abrotanoides L. plant for mosquito larvae control can effectively reduce the Aedes albopictus mosquito population and provide a foundation for designing plant-derived insecticides.

As a vital vector of dengue fever, yellow fever, and other mosquito-borne diseases, Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) can be broadly distributed ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

CRISPR / Cas9 Oryantal Meyve Sineği Bactrocera dorsalis'in mutagenezi için protokoller

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...

Helicoverpa armigera Üzerindeki Fitokimyasal Etkilerin Besleme Testi ile Değerlendirilmesi

Developing a Feeding Assay System for Evaluating the Insecticidal Effect of Phytochemicals on Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and agricultural productivity. In response, plants produce several phytochemicals that negatively impact the insect's growth and survival. This protocol demonstrates an obligate feeding assay method to evaluate the effect of a phytochemical (quercetin) on insect growth, development, and survival. Under controlled conditions, the neonates were maintained until the second instar on a pre-defined artificial diet. These second-instar larvae were allowed to feed on a control and quercetin-containing artificial diet for 10 days. The insects' body weight, developmental stage, frass weight, and mortality were recorded on alternate days. The change in body weight, the difference in feeding pattern, and developmental phenotypes were evaluated throughout the assay time. The described obligatory feeding assay simulates a natural mode of ingestion and can be scaled up to a large number of insects. It permits one to analyze phytochemicals' effect on the growth dynamics, developmental transition, and overall fitness of H. armigera. Furthermore, this setup can also be utilized to evaluate alterations in nutritional parameters and digestive physiology processes. This article provides a detailed methodology for feeding assay systems, which may have applications in toxicological studies, insecticidal molecule screening, and understanding chemical effects in plant-insect interactions.

Yazar Spotlight: Böcek Haşere Yönetimi için Besleme Deneylerinin Geliştirilmesi ve Zorlukları 

This protocol describes the obligate feeding assay to evaluate the potentially toxic effect of a phytochemical on the lepidopteran insect larvae. This is a highly scalable insect bioassay, easy to optimize the sublethal and lethal dose, deterrent activity, and physiological effect. This could be used for screening eco-friendly insecticides.

Fitokimyasalların Helicoverpa armigera Üzerindeki İnsektisidal Etkisinin Değerlendirilmesi için Beslenme Deney Sistemi Geliştirilmesi

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and ...

Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Yatak Bug karşı Böcek etkinliğini değerlendirmek için bir yöntem,

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

İnsektisit Direnci İzleme için biyoanalizlere

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

Sivrisinekler ve Meyve Sinekleri için İnsektisit Toksisitesini Ölçmek için Topikal Uygulama Biyotahlili

Control of Aedes albopictus Mosquito Larvae with Carpesium abrotanoides L.

CRISPR / Cas9 Oryantal Meyve Sineği Bactrocera dorsalis'in mutagenezi için protokoller

Fitokimyasalların Helicoverpa armigera Üzerindeki İnsektisidal Etkisinin Değerlendirilmesi için Beslenme Deney Sistemi Geliştirilmesi