Name: functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica
Uploaded: 2018-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
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1. expressão e isolamento de proteínas do alvo com um sistema de expressão de células de inseto mediada por Baculovirus
<ol><li>Direcionalmente clone sem corte-terminados produtos PCR de proteínas do alvo de moscas domésticas.<ol>
<li>Projetar primers PCR de proteína verde fluorescente (GFP) e o gene MdαE7 casa voar com base em suas sequências e os requisitos especiais do vetor escolhido (tabela 1).</li>
		<li>Usar uma DNA-polimerase termoestável, correcção e primers da etapa 1.1.1 para realizar uma reação de PCR de 150 µ l (30 µ l de tampão de reação, 3 µ l de dNTPs 10 mM, 1,5 µ l de DNA polimerase, 6 µ l de DNA de casa modelo voar, 7,5 µ l de primer para a frente 7,5 µ l de primer reverso, com água até um volume final de 150 µ l). Aqueça a reação de PCR a 98 ° C por 30 s, seguido por 35 ciclos de 98 ° C por 10 s, 53 ° C por 30 s e 72 ° C por 60 s e em seguida uma extensão final a 72 ° C por 2 min).<ol>
<li>Execute um gel de agarose 1% com 150 µ l de produto do PCR.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Impostos especiais de consumo os fragmentos de DNA alvo do agarose gel com um bisturi afiado e limpo: 1317 bp para MdαE7 e 858 bp para as boas práticas agrícolas. Purifica o DNA usando gel comercialmente disponível kit de extração seguindo o protocolo do fabricante (Tabela de materiais). Dissolva o DNA purificado em 15 µ l de água destilada.</li>
		<li>Execute um gel de agarose 1% com 1 µ l de DNA purificado para verificar a integridade. Use outro 1 µ l de DNA purificado para medir concentrações com o espectrofotómetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construir um plasmídeo de entrada para as proteínas alvo<ol>
<li>Configure a reação de clonagem. Mistura purificada recentemente produtos DNA da etapa 1.1.3 e comercialmente disponível entrada vetores contendo attL-sites (Tabela de materiais) em uma relação molar de 1:1 (0,5-2 µ l de produto fresco de PCR em concentrações de 70-200 ng / µ l: vetor de 0,5 µ l). Em seguida, adicione 1 µ l de solução salina comercialmente disponível (1,2 M NaCl2 e 0,06 M MgCl2) e adicionar água até um volume final de 6 µ l. Misture delicadamente e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
		<li>Transferir 4 µ l de clonagem de produtos de reacção na etapa 1.2.1 em 50 µ l de quimicamente competentes de Escherichia coli células. Incubar no gelo por 30 min. calor-choque as células por 30 s em banho de água de 42 ° C, sem agitação.</li>
		<li>Coloque o tubo de volta no gelo para outro µ l de 2 min. Adicione 250 de temperatura S.O.C médio (2% triptona extrato de levedura 0,5% 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM de MgSO4; glicose 20 mM). Incube a 37 ° C, durante 1 h, agitando suavemente.</li>
		<li>Espalhe 50-200 µ l de cultura bacteriana na etapa 1.2.3 nas placas seletivas LB (1 g de triptona 1 g de NaCl 0,5 g de extrato de levedura; 1,5 g de ágar-ágar dissolvido em 100 mL de água destilada. Autoclave e adicionar 0,1% de canamicina 50mg/mL). Incube as placas LB para 16 h a 37 ° C para o crescimento da colônia.</li>
		<li>Escolha 5 a 10 colônias e re-suspendê-las individualmente em 5 µ l de água destilada.</li>
		<li>Realizar PCR adicionando 5 µ l de tampão de reação, 0,5 µ l de dNTPs 10 mM, 0,25 µ l de DNA polimerase, 1 µ l de suspensa colônias, 1,25 µ l de 10 µM M13 forward da primeira demão, 1,25 µ l de 10 µM inversa da primeira demão do gene alvo e da água para o volume final de 25 µ l. aquecer o PCR reação a 98 ° C por 30 s, seguido por 35 ciclos de 98° C por 10 s, 53 ° C por 30 s e 72 ° C por 60 s e em seguida uma extensão final a 72 ° C por 2 min (tabela 1).</li>
		<li>Re-cultura 3 µ l de suspensa colônias da etapa 1.2.5 em mídia TB (100 mL de tampão fosfato contendo 0,17 M KH2PO4 e 0,72 M K2HPO4 com 450 mL do meio de base de caldo de triptona, 12 g de fermento e 2 mL de 6 g glicerol, esterilizado, contendo 0,1% canamicina de 50 mg/mL) por 16 h. extrair DNA de plasmídeo ultra-pura seguindo o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Uso de 200 ng / µ l plasmídeo ultra-pura da etapa 1.2.7 para Sanger comercial sequenciando com primers para diante e reversos de M13. Verificar a inserção correta do gene alvo no vetor de acordo com o mapa de sequência fornecido pelo fabricante.</li>
		<li>Armazenar as amostras de DNA de plasmídeo ultra-pura verificada a sequência de MdαE7 e GFP em-20 ° C. Nota: Estas são a entrada plasmídeo DNA de MdαE7 e GFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construa um baculovirus recombinante, realizando a reação de recombinação (LR) Lambda.<ol>
<li>Respectivamente, misture 1 µ l de plasmídeo de entrada ng / µ l 300 DNA de GFP, MdαE7 da etapa 1.2.7 ou entrada do plasmídeo DNA do gene do acetyltransferase de cloranfenicol (CAT) fornecido pelo kit de transfecção celular com 5 µ l de comercialmente disponíveis (contendo sites attL) C-termo DNA linear (contendo sites attR) em 250 µ l tubos de PCR. Adicione tampão TE para fazer um volume total de 8 µ l. Nota: As reações de GFP e CAT foram usadas como grupos de controle.</li>
		<li>Adicione 2 µ l de comercialmente disponível mistura enzima recombinação (LR) a Lambda (Tabela de materiais) em cada mistura de passo 1.3.1 para catalisar a reação de LR. Delicadamente, misturar e incubar a 25 ° C durante a noite (≈16 h). Nota: A reação de LR facilita a recombinação de um attL contendo entrada plasmídeo com uma attcontendo R C-termo DNA linear para gerar um attB-contendo vírus expressando. Esta etapa produz o baculovirus recombinantes para cada proteína do alvo.</li>
		<li>Diluir 1 µ l de produtos de reacção LR da etapa 1.3.2 20 X. Realize PCR usando um Polyhedrin para a frente da primeira demão e V5 reverso primer (tabela 1). Use 5 µ l de produtos do PCR para executar um gel de agarose a 1%, para verificar a qualidade. A Figura 1 mostra um exemplo de produto de reação o LR do gene MdαE7.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig1.jpg"> Figura 1: resultados do exemplo de reação MdαE7 LR por análise PCR. Diluir 2 µ l de reação LR 200-fold e usar 2 µ l da diluição juntamente com Polyhedrin cartilha para diante e reverso primer V5 para executar um 25 µ l do PCR. Use 5 µ l de produtos do PCR para executar o gel de agarose 1% para verificar a qualidade da reação de LR. um
<ol start="4"><li>Transfect inseto Sf9 de células<ol>
<li>Insetos células Sf9 de cultura com 5 mL de meio de crescimento de célula completa (meio livre de soro com 10% de soro fetal bovino (FBS)) no T25 trataram frascos em 27 ˚ c.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e irrigue células conectado à parte inferior com 3 mL de meio de cultura fresco célula completa. Transferi 0,5 mL de células re-suspensas num balão de novo T25 tratados. Adicione 4,5 mL de meio de crescimento completo. Incube a 27 ° C, por 3-4 dias até a próxima transferência.</li>
		<li>Semente de 2 mL de inseto de crescimento log-fase Sf9 células de cultura (≈3.0-5,0 × 106 células) uniformemente na cultura de pilha bem. Permitir que células anexar pelo menos 3 h à temperatura de capuz.</li>
		<li>Verificar a fixação da célula ao observar com um microscópio de fase invertido em 250 X. Remover o meio de cultura celular e substitua por 2 mL do meio de inseto da Grace.</li>
		<li>Preparar a solução de mistura A transfeccao (8 µ l de reagente de infecção de célula comercialmente disponíveis (Tabela de materiais) com 100 µ l de meio inseto de Grace) e solução de mistura B transfeccao de cada gene alvo (9 µ l dos produtos de reação LR da etapa 1.3 com 100 µ l de meio inseto da Grace unsupplemented) em 1,5 mL centrifugar tubos, respectivamente.</li>
		<li>Misture suavemente mistura de transfeccao A e B juntos tocando os tubos. Incube a temperatura ambiente por 35 min no capô.</li>
		<li>Uniformemente, adicione a mistura da etapa 1.4.6 gota a gota sobre as células semeadas da etapa 1.4.4. Selar poços com fitas e incubar a 27 ° C durante a noite.</li>
		<li>Substitua 2 mL do meio de inseto da Grace com 2 mL do meio de crescimento completo. Adicione 100 µM ganciclovir em cada poço para selecionar negativamente contra não-recombinante baculovirus. Selar poços com fita e incubar a 27 ° C, durante 72 h.</li>
		<li>Coletar 72 h pós infecção meio de cultura celular de cada poço e transferir para tubos de centrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 1.500 x g por 5 min a 4 ° C para remover células ou fragmentos grandes.</li>
		<li>Transferi o sobrenadante para novos tubos de centrífuga de 1,5 mL. Armazená-los em 4 ° C, com proteção da luz. Nota: Estas são as soluções de estoque de vírus P1 para cada gene alvo.</li>
		<li>Amplifica o estoque de viral baixa-título P1 (1 × 105-1 × 106 pfu/mL) para uma ação viral foram P2 (5 × 107-1 × 108 pfu/mL).</li>
		<li>Semente de 2 mL de inseto de crescimento log-fase Sf9 células de cultura (≈3.0-5,0 × 106 células) uniformemente na cultura de pilha bem. Permitir que células anexar pelo menos 3 h à temperatura de capuz.</li>
		<li>Inocule a 5 µ l de estoque de vírus P1 obtido na etapa 1.4.10 na célula semeada bem de passo 1.4.12, respectivamente. Em seguida, adicione 100 µM ganciclovir para cada poço. Selar poços e incubar a 27 ° C, durante 72 h.</li>
		<li>Colete P2 soluções estoque de vírus de infecção de post de 72 h. Armazenar a 4 ° C, com proteção da luz. Nota: Estas são as soluções de estoque de vírus P2 para cada gene alvo.</li>
		<li>(Opcional) Repita os passos 1.4.12-1.4.14 com 5 µ l de estoque de vírus P2 para coletar P3 soluções estoque de vírus. Nota: Estas são as soluções de estoque de vírus P3 para cada gene alvo.</li>
		<li>Armazene todos os baculovirus construídos em 4 ° C, com proteção da luz. Nota: O gene GFP e gato serviram como grupo de controle. Figura 2 mostrou os sinais das células quando infectado pelo baculovirus recombinante-GFP em fases diferentes de amplificação.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig2.jpg"> Figura 2: exemplo de sinais infectados de Sf9 células em estágios de amplificação de baculovirus diferente. A figura mostra células de baculovirus recombinante-GFP sob luz natural e fluorescentes luz. Na fase de infecção P1, a taxa de infecção é baixa. Na fase de infecção P2, a taxa de infecção foi aprimorada significativamente. Na fase de infecção P3, quase todas as células apresentou sintomas de afastamento da placa de cultura de células, aumenta de diâmetro da célula, bem como a cessação do crescimento celular. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58106/58106fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="5"><li>Expressão em larga escala de proteínas do alvo em células de inseto Sf9<ol>
<li>10 mL de log crescimento inseto Sf9 células em fase com meio de crescimento completo T25 não tratados frascos de cultura.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de solução-mãe vírus P2 (obtida na etapa 1.4.14) para infectar culturas celulares na etapa 1.5.1 para 72 h.</li>
		<li>Colete 72 h pós infecção meio de cultura celular. Centrifugar a 1.500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e lavar pelotas duas vezes com 1 mL de tampão PBS de 0,1 M (pH 7,5).</li>
		<li>Dissolva totalmente pelotas de célula com 1 mL de extração de proteínas de célula inseto & lise (Tabela de materiais). Adicione 10% de glicerol na lise celular. Imediatamente, armazenar a-80 ° C.</li>
		<li>Repita as etapas 1.5.1-1.5.5 com P2 vírus solução estoque de proteínas CAT para servir como grupo controle. Nota: Repita o passo 1.5 em triplicado para as preparações de proteína diferentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. um ensaio de citotoxicidade MTT baseada em célula
<ol><li>5 mL de log crescimento (1,5-2,5 × 106 células/mL) inseto Sf9 células em fase com meio de crescimento completo T25 não tratados frascos de cultura.</li>
	<li>Adicione 25 µ l de solução-mãe vírus P1 (obtida na etapa 1.4.14) para infectar culturas celulares na etapa 2.1 para 48 h com agitação suave em 27 ˚ c.</li>
	<li>Prepare 100 mM permetrina soluções-padrão estoque em acetonitrila. Use o acetonitrilo para diluir a 50 mM, 25 mM, 12,5 mM e 6,25 mM adicionando 500 µ l, 250 µ l, 125 µ l e 62,5 µ l permetrina solução em um volume total de 1.000 µ l, respectivamente.</li>
	<li>Uniformemente as sementes 200 µ l de culturas de células infectadas da etapa 2.2 suplementado com 300 µ l de meio completo crescimento em placa de 24 em uma densidade de 2 × 105 células/mL.</li>
	<li>Adicione 4 µ l das soluções-padrão permetrina (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM e 50 mM) em cada poço tornar-se uma concentração final de µM 50, 100 µM, 200 µM e 400 µM, respectivamente. Apenas adicione 4 µ l de acetonitrilo em poços para cálculos de viabilidade celular (Figura 3).</li>
	<li>Placas com fitas de vedação e incubar a 27 ° C, durante 48 h com proteção da luz.</li>
	<li>Preparar o reagente MTT (Thiazolyl azul tetrazólio brometo de) 5mg/mL dissolvido em buffer (2,0 g de NaCl, 0,05 g de KCl, 0,36 g de NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g de NaH2PO4, 0,05 g de KH2PO4 dissolvido em 200 mL de água destilada água, pH 7,5).</li>
	<li>Remova o meio de cultura celular de passo 2.6 após incubação de 48 h sem tocar a camada celular conectado à parte inferior. Adicione 200 µ l de reagente MTT na etapa 2.7 em cada poço. Incube a 37 ° C por 4 h até formazan roxo escuro precipitados formaram em cada poço (Figura 3).</li>
	<li>Incube a 37 ° C por 4 h até formazan roxo escuro precipita-se forma em cada poço. Adicione 500 µ l de DMSO para dissolver totalmente precipitados (Figura 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig3.jpg"> Figura 3: exemplo de resultados MTT. Após 48 h pós infecção com solução-mãe de vírus P1 da solução de baculovirus recombinante CAT, uniformemente semente 500 µ l células expressando o gene CAT em uma placa de cultura de células 24 poços. Respectivamente, adicione 4 µ l permetrina em uma dose diferente (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM e 50 mM) em cada linha para fazer a concentração final de 50 µM e 100 µM, 200 µM 400 µM. A linha de controle foi tratada com acetonitrilo apenas e marcada como CK no prato. (A) após 48 h de incubação a 27 ° C, elimine o meio de cultura de células na camada superior e substitua com 200 µ l de reagentes MTT coloridos amarelos. Então incube a 37 ° C por 48 h. roxo escuro colorida redução precipita-se forma em cada bem, indicando que as células de sobrevivência são capazes de metabolizar a cor amarela reagentes MTT no precipitado de cor roxo escuro. (B) 500 µ l de solvente DMSO foi adicionado em cada bem para dissolver o precipitado formado. O valor de absorvância de cada bem foi detectado pelo espectrofotômetro a 540 nm. Como aumenta a concentração de permetrina, a cor gradualmente irá mudar de vermelho escuro para a luz vermelha, sugerindo que as realidades de célula foram gradualmente diminuiu. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58106/58106fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="10"><li>Transferi 200 µ l de solução dissolvida em placa de 96 poços. Medir os valores de absorvância a 540 nm, utilizando um leitor de microplacas (Tabela de materiais).</li>
	<li>Calcule a viabilidade celular, comparando os valores de absorvância das células de permetrina tratada com aqueles de apenas células de acetonitrilo Tratado.</li>
	<li>Para o grupo de controle, repita todos os passos com P2 solução stock de vírus de chloramphenicol acetyltransferase (CAT) baculovirus recombinante obtido na etapa 1.4.</li>
	<li>Repita 4 vezes para preparações de vírus diferentes.</li>
</ol>3. in Vitro ensaio metabólico
<ol><li>Prepare 100 mM permetrina soluções-padrão estoque em acetonitrila. Use o acetonitrilo para diluir a 50 mM, 25 mM, 12,5 mM e 6,25 mM. Detecta a área do pico correspondente sob cada concentração usando HPLC. Criar e calcular a curva padrão de permetrina baseada a área do pico com concentrações diferentes de permetrina.</li>
	<li>Medir as concentrações de proteína na etapa 1.5 com Bradford métodos21.</li>
	<li>Prepare-se 700 µ l de reação metabólica com padrão de permetrina 40 µM e 1 mg de proteínas obtido na etapa 1.5 dissolvida no buffer de 0.2 M Tris-HCl (pH 7,4). Incube a 30 ° C, durante 2 h com agitação suave. Protege da luz.</li>
	<li>Saciar a reação adicionando 700 µ l de acetonitrilo gelado. Incube a 30 ˚ c por mais 30 minutos com agitação suave. Protege da luz.</li>
	<li>Centrifugue a mistura de reação a 16.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Recolha o sobrenadante e filtrar através de uma membrana de 0,45 µm. Transferi a filtragem em frascos de vidro castanho ultraclean para análise HPLC.</li>
	<li>Executar a HPLC sob as condições cromatográficas ideais (fase móvel r: acetonitrilo de 90% e 10% de água; Fase móvel b: 5% acetonitrila ajustado ao pH 2.3 com ácido fosfórico 85%). Gradiente eluir com uma taxa de fluxo de 1 mL/min e medida no comprimento de onda de 232 nm.</li>
	<li>Calcule a porcentagem de depleção de permetrina, comparando com reações sem proteína amostra adicionada.</li>
	<li>Use a proteína CAT obtida na etapa 1.5.6 para servir como o controle.</li>
	<li>Repeti todos os passos com preparações de proteína diferentes na etapa 1.5.7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+house+flies+from+the+United+States:+Resistance+levels+and+frequency+of+pyrethroid+resistance+alleles.">Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+transcriptomal+linkage+analysis+of+gene+co-regulation+in+insecticide+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica.</a> BMC Genomics. 14, 803 (2013).</li><li>Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+mosquitoes:+impact,+mechanisms,+and+research+directions.">Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions.</a> Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+and+genetic+study+reveal+amplified+carboxylesterase+genes+implicated+in+temephos+resistance,+in+the+Asian+tiger+mosquito+Aedes+albopictus.">Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus.</a> e0003771. 9, e0003771 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+gene+amplifications+associated+with+insecticide+resistance+in+Aedes+albopictus:+Geographical+distribution+and+evolutionary+origin.">Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).</li><li>Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).</li><li>Feng, X., Li, M., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+genes+in+pyrethroid+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Jarvis, D. 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J., Minor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assays.">Cell viability assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2013).</li><li>Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).</li><li>Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. 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A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li></ol>

Nas últimas décadas, sistemas de expressão heteróloga têm sido amplamente utilizados para expressar e isolar grandes quantidades de proteínas, permitindo assim a determinação bioquímica e funcional e caracterização de enzimas em vitro. Até à data, vários sistemas de modelo diferente, incluindo Escherichia colie Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae, Spodoptera frugiperda foram adaptados para a expressão da proteína recombinante e a escolha da sistema i...

Resistência de inseticida é atualmente um grande problema de casa fly controle mundial1,2. Os esforços para determinar o mecanismo de resistência de inseticida facilita o melhor entendimento desta questão e, assim, fornecer novas estratégias para efetivamente prevenir ou minimizar a propagação de resistência desenvolvimento3. Carboxylesterases, como uma das enzimas de desintoxicação principais, têm atraído muita atenção por seus papéis em sequestro e metabolizar inseticidas em vários insetos4,5,6. Nosso estudo anterior identificou vários carboxylesterases em moscas domésticas e seus níveis de expressão não foram apenas constitutivamente acima-está regulada na cepa resistente do ALHF, mas também podem ser induzido para maiores níveis em resposta aos tratamentos de permetrina7 . No entanto, as caracterizações funcionais destes genes carboxylesterase em metabolizar inseticidas continuam a ser explorado.
Desde o primeiro relatório no início da década de 19808, um sistema de expressão de gene estrangeira mediada por baculovirus tem sido amplamente empregado devido a sua eficiência de produção de alta proteína e proteína eukaryotic processamento recursos9. Este sistema binário é composto de dois elementos essenciais: o baculovirus recombinante construído entregando estrangeiros genes em células hospedeiras e a expressão em larga escala de proteínas interessadas por células infectadas por baculovirus recombinante. Nas últimas décadas, o sistema de expressão baculovirus mediada por células tem sido amplamente utilizado para produzir milhares de proteínas recombinantes, variando de enzimas citosólica a proteínas de membrana-limite no inseto e10células de mamífero. Nosso estudo anterior com êxito manifestou várias enzimas CYP450 em células de inseto Sf9 com este sistema de11. Neste estudo, temos construído um baculovirus recombinante-carboxylesterase para infectar células de inseto Sf9, explorou a tolerância de célula à permetrina diferentes tratamentos e em grande escala expressa carboxylesterase proteínas em vitro para funcional exploração. Em vez de investigar várias misturas de Isozima carboxylesterase de insetos homogenates adoptado pela anteriores estudos12,13, este sistema de expressão de células de inseto mediada por baculovirus permite a expressão específica e isolamento de proteínas específicas para melhor caracterização das suas propriedades bioquímicas e estruturais.
O ensaio baseado em sal de tetrazólio (MTT) é um método colorimétrico de alta produtividade, desenvolvido e otimizado para medir a viabilidade celular. Este ensaio baseia-se o mecanismo que apenas as células vivas são capazes de metabolizar o reagente MTT amarela a um precipitado de formazan cor roxo escuro, que pode ser analisado colorimetricamente depois dissolvido em solventes orgânicos14, 15. Mais precisos, mas demorados métodos, tais como a exclusão de Trypan azul e a timidina titulação ensaio16,17, vários foram desenvolvidos nos últimos anos. No entanto, o ensaio de MTT baseada em célula ainda atualmente é reconhecido como o método mais rápido e facilmente operado para detectar rapidamente a viabilidade celular. Aqui, usamos o ensaio de MTT para explorar a tolerância celular contra tratamentos insecticidas. A tolerância melhorada de células quando infectadas com baculovirus recombinante carboxylesterase fortemente suporta as funções metabólicas de carboxylesterases aos inseticidas, que por sua vez, sugere sua participação na resistência de inseticida.
Além disso, um ensaio metabólico em vitro foi também realizado neste estudo. Em comparação com ensaios de carboxylesterase geral que usam substratos comuns tais como acetato de α-napthyl (α-at) e β-naftil acetato (β-NA) para refletir a actividades hidrolíticas de carboxylesterases, o estudo metabólico em vitro é considerado como uma maneira exata para medir diretamente as atividades de carboxylesterases em direção a inseticidas18. Este método tem sido empregado com sucesso em vários tipos de insetos para caracterizar vários citocromo P450s em associação com inseticida resistência11,19,20. No entanto, este método ainda não foi aplicado em estudos carboxylesterase. Com a disponibilidade de carboxylesterase proteínas produzidas pelo sistema de expressão mediada por baculovirus, podemos realizar um em vitro estudo metabólico de carboxylesterases em direção a permetrina, que mais pode fornecer fortes evidências do envolvimento de carboxylesterases em conferir resistência piretroide em casa voa.

<table><tbody><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs inc.</td><td>M0491L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K240020</td><td>S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K210002</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirect&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Kits</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>11791-023</td><td></td></tr><tr><td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>12562-019</td><td>Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit</td></tr><tr><td>pENTR-CAT plasmid</td><td>Invitrogen by life technology</td><td></td><td>Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL</td></tr><tr><td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 cells in Sf-900 III SFM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction &amp;amp; Lysis Buffer</td><td>G Biosciences by A Geno Technology Inc</td><td>786-411</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM (1&amp;times;) Serum Free Medium Complete</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>12658-019</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s Insect Medium, unsupplemented</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>11595030</td><td></td></tr><tr><td>Permethrin (isomers) analytical standard</td><td>SUPELCO by Solutions Within&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>442748</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (analytical graded)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (analytical graded)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 &amp;mu;m GHP Membrane (HPLC Certified)</td><td>Pall Life Sciences</td><td>21890388</td><td></td></tr><tr><td>Alliance Waters 2695 HPLC System</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycle</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica

Mediada por Carboxylesterase metabolismo é pensado para jogar um papel importante na resistência de inseticida em vários tipos de insetos. Vários carboxylesterase de genes foram encontrados acima-está regulada em tensão de voar a casa resistente, Considerando que seus papéis em conferir resistência inseticida permaneceram para ser explorado. Aqui, nós projetamos um protocolo para a caracterização funcional de carboxylesterases. Três experimentos de exemplo são apresentados: (1) expressão e isolamento de proteínas carboxylesterase através de um inseto mediada por baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) sistema de expressão de células; (2) um MTT baseada em célula (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium brometo) ensaio de citotoxicidade para medir a tolerância das células de inseto à permetrina diferentes tratamentos; e (3) em vitro estudos metabólicos para explorar os recursos metabólicos do carboxylesterases em direção a permetrina. O gene carboxylesterase MdαE7 foi clonada de uma casa resistente voar estirpe ALHF e usado para construir um baculovirus recombinante para Sf9 infecção de células. As realidades de célula contra permetrina diferentes tratamentos foram medidas com o ensaio de MTT. A tolerância de célula reforçada do grupo experimental (células de baculovirus infectado MdαE7-recombinante) comparado com os dos grupos controle (CAT-recombinante baculovirus infectados células e células de baculovirus infectados de GFP-recombinante) a permetrina tratamentos sugeriram que os recursos do MdαE7 em metabolizar inseticidas, protegendo assim as células de danos químicos. Além disso, carboxylesterase proteínas foram expressas em células de inseto Sf9 e isoladas para realizar um estudo metabólico em vitro . Nossos resultados indicaram uma significativa em vitro eficiência metabólica de MdαE7 em direção a permetrina, indicando diretamente o envolvimento do carboxylesterases em metabolizar inseticidas e assim conferir resistência inseticida em casa voa.

A viabilidade celular em direção a permetrina diferentes tratamentos (ensaio de MTT)
A citotoxidade de permetrina foi examinada em MdαE7-recombinante baculovirus infectado Sf9 células (grupo experimental) e CAT-recombinante baculovirus (fornecido pelo kit de baculovirus infectado) infectados células (grupos de controle). As tolerâncias de célula reforçada de permetrina em MdαE7 expressando células fortemente apoiar as fun...

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Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir casa voar carboxylesterase proteínas em vitro com um sistema de expressão baculovirus mediada por células de inseto e mais tarde funcionalmente caracterizar seus papéis em metabolisante permetrina, desse modo, conferindo piretroide resistência por estudos baseados em células MTT ensaio e in vitro metabólica.

Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

functional-characterization-carboxylesterases-insecticide-resistant

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

7.4K visualizações.  Auburn University. Aqui, apresentamos um protocolo para produzir casa voar carboxylesterase proteínas em vitro com um sistema de expressão baculovirus mediada por células de inseto e mais tarde funcionalmente caracterizar seus papéis em metabolisante permetrina, desse modo, conferindo piretroide resistência por estudos baseados em células MTT ensaio e in vitro metabólica.

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Imunologia e Infecção

A Method for Evaluating Insecticide Efficacy against Bed Bug, Cimex lectularius, Eggs and First Instars

Standard toxicity evaluations of insecticides against insect pests are primarily conducted on adult insects. Evaluations are based on a dose-response or concentration-response curve, where mortality increases as the dose or concentration of an insecticide is increased. Standard lethal concentration (LC50) and lethal dose (LD50) tests that result in 50% mortality of a test population can be challenging for evaluating toxicity of insecticides against non-adult insect life stages, such as eggs and early instar or nymphal stages. However, this information is essential for understanding insecticide efficacy in all bed bug life stages, which affects control and treatment efforts. This protocol uses a standard dipping bioassay modified for bed bug eggs and a contact insecticidal assay for treating nymphal first instars. These assays produce a concentration-response curve to further quantify LC50 values for insecticide evaluations.

A Method for Evaluating Insecticide Efficacy against Bed Bug,  Cimex lectularius, Eggs and First Instars

Insecticide evaluations are often targeted against adult insects, rather than immature stages. Here, we present a protocol for evaluating insecticides against bed bug eggs with a comparison to the first nymphal bed bug stage. These protocols could be adjusted for other insects to evaluate insecticide efficacy in non-adult life stages.

Um método para avaliar Inseticida Eficácia contra Bed Bug,<em&gt; Cimex lectularius</em&gt;, Ovos e primeiros estádios

Standard toxicity evaluations of insecticides against insect pests are primarily conducted on adult insects. Evaluations are based on a dose-response or ...

Ambiente

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Bioquímica

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Comportamento

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

Bioensaios de Resistência a Inseticidas Monitoramento

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Biologia

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Bioensaio de aplicação tópico para quantificar toxicidade de inseticida para mosquitos e moscas de frutas

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Control of Aedes albopictus Mosquito Larvae with Carpesium abrotanoides L.

As a vital vector of dengue fever, yellow fever, and other mosquito-borne diseases, Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) can be broadly distributed worldwide and cause a severe threat to public health. To date, considering the fast-emerging insecticide resistance in the mosquito, the development of new botanical insecticides to control and reduce Ae. albopictus is urgent and crucial. Therefore, to investigate the decoction effect of the plant C. abrotanoides L. on mosquito larvae killing, we detected the mortality of larvae after treatment with different concentrations (60 mg/mL, 120 mg/mL, and 180 mg/mL) of decoction within a series of time points (12 h, 24 h, 36 h, and 48 h). We found that 24 h with 180 mg/mL C. abrotanoides L. decoction treatment killed 92.35% of mosquitoes relative to the control treatment. Meanwhile, 36 h with 120 mg/mL could also kill more than 90% of mosquitoes. Furthermore, Carassius auratus populations were exposed to 120 mg/mL C. abrotanoides L. decoction for 36 h and were not dead. The mortality evaluation indicated that this concentration is not a harmful level of ecological environmental pollution. This study provides a possible plant candidate that could be used for designing plant-derived insecticides. Additionally, these methods can be altered and applied to other mosquito species.

Control of Aedes albopictus Mosquito Larvae with Carpesium abrotanoides L.

Using the Carpesium abrotanoides L. plant for mosquito larvae control can effectively reduce the Aedes albopictus mosquito population and provide a foundation for designing plant-derived insecticides.

As a vital vector of dengue fever, yellow fever, and other mosquito-borne diseases, Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) can be broadly distributed ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...

Avaliação dos efeitos fitoquímicos em Helicoverpa armigera por meio de ensaio alimentar

Developing a Feeding Assay System for Evaluating the Insecticidal Effect of Phytochemicals on Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and agricultural productivity. In response, plants produce several phytochemicals that negatively impact the insect's growth and survival. This protocol demonstrates an obligate feeding assay method to evaluate the effect of a phytochemical (quercetin) on insect growth, development, and survival. Under controlled conditions, the neonates were maintained until the second instar on a pre-defined artificial diet. These second-instar larvae were allowed to feed on a control and quercetin-containing artificial diet for 10 days. The insects' body weight, developmental stage, frass weight, and mortality were recorded on alternate days. The change in body weight, the difference in feeding pattern, and developmental phenotypes were evaluated throughout the assay time. The described obligatory feeding assay simulates a natural mode of ingestion and can be scaled up to a large number of insects. It permits one to analyze phytochemicals' effect on the growth dynamics, developmental transition, and overall fitness of H. armigera. Furthermore, this setup can also be utilized to evaluate alterations in nutritional parameters and digestive physiology processes. This article provides a detailed methodology for feeding assay systems, which may have applications in toxicological studies, insecticidal molecule screening, and understanding chemical effects in plant-insect interactions.

Autor em destaque: Desenvolvimento e desafios de ensaios de alimentação para manejo de pragas de insetos 

This protocol describes the obligate feeding assay to evaluate the potentially toxic effect of a phytochemical on the lepidopteran insect larvae. This is a highly scalable insect bioassay, easy to optimize the sublethal and lethal dose, deterrent activity, and physiological effect. This could be used for screening eco-friendly insecticides.

Desenvolvimento de um Sistema de Ensaio Alimentar para Avaliação do Efeito Inseticida de Fitoquímicos sobre Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and ...

Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Resumo

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Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

Um método para avaliar Inseticida Eficácia contra Bed Bug,

Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

Bioensaios de Resistência a Inseticidas Monitoramento

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

Bioensaio de aplicação tópico para quantificar toxicidade de inseticida para mosquitos e moscas de frutas

Control of Aedes albopictus Mosquito Larvae with Carpesium abrotanoides L.

Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

Desenvolvimento de um Sistema de Ensaio Alimentar para Avaliação do Efeito Inseticida de Fitoquímicos sobre Helicoverpa armigera