Bu eser tarafından temel bilim Enstitüsü (IBS-R015-D1) ve temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Eğitim Bakanlığı (2017R1A6A1A03015642) tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir.

Tüm cerrahi işlemler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Sungkyunkwan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. numune hazırlama
Not: Otoklav hayvan işleme önce tüm cerrahi aletler. Cerrahi işlemler için özel bir odada tüm cerrahi performans kuralları. Steril Cerrahi Önlük ve eldiven cerrahi odasında tüm personeli tarafından her zaman giyilmelidir.
<ol><li>
Doku fiksasyon
	<ol>
<li>Her fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve % 4 paraformaldehyde (PFA) PBS ile dolu iki 10 mL şırınga hazırla.</li>
		<li>7-12-hafta-yaşlı fare, (C57BL/6J veya herhangi bir fare çizgi ya cinsiyet ile) zoletil ve xylazine (1:1, 20 mg/kg) veya (Örneğin, 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg karışımı bir alternatif uygun anestezi rejimi karışımı yönetmek anestezi xylazine) mayi iğne ile.</li>
		<li>Fare anestezi (ayak çimdik-yanıt yöntemi kullanın) cerrahi uçağa ulaştı sonra kalp makasla keserek cilt ve göğüs kafesi maruz.</li>
		<li>Sağ atrium kanı ve bir iğne ile PBS ve İngiltere'de yılın solution'ı sırayla sol ventrikül sıvı küçük makas ile makasla kesme (perfüzyon oranı 4 mL/dk, birim = her çözüm için 10 mL =). Not: Fare yordamı başarıyla tamamlanırsa sert olur. Göz merhem veya sterilizasyon yordamı terminal olduğu gibi gerekli değildir. Fiksasyon işlemi atlanabilir. Ancak, bu adımı yapısal deformasyonlar mekanik doku hasarı ve iskemik aksonal şişme gibi en aza indirmek için tavsiye edilir. Doku fiksasyon hakkında daha fazla ayrıntı için Gage, G. J. vd tarafından makaleye başvurun 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beyin dilim hazırlanması
	<ol>
<li>Fare aracılığıyla ventral göğüs ve karında cerrahi makas ile başını kesmek.</li>
		<li>Kafa derisi ve kafatası tamamen açığa kadar uygun küçük bir makas kullanarak kapaklarini kaldırın.</li>
		<li>Frontal kemik kırmak ve kafatası beyin zarar vermemesi için özenle küçük makas kullanarak oksipital kemikten sagittal dikiş boyunca kesti.</li>
		<li>Yavaşça kafatası ve dura mater sırayla iyi forseps kullanarak çıkarın.</li>
		<li>Beyin doku zarar vermemeye dikkat çekici bir yumuşak plastik kaşık kullanarak ayıklayın.</li>
		<li>Durulama ve % 4 İngiltere'de yılın çözüm 4 ° C'de 30 dk için ayıklanan beyinde emmek</li>
		<li>Sabit beyin 100 – 150 µm bölüme bir vibratome kullanma dilim. Not: doku hazırlık hakkında daha fazla ayrıntı için makalesine bakın tarafından Segev vd. 11. sonraki işlemler için doku bölümlere spacer kalınlığı ince dilimlenmiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beyin dilim montaj
	<ol>
<li>2 kare kapak gözlük (22 × 22 × 0,17 mm) ve 1 cam slayt her doku dilim için hazır olun.</li>
		<li>Bir kare kapak gözlük ikiye ayırmak (iki dikdörtgen parça) bir cam kesici kullanarak.</li>
		<li>İki süper yapıştırıcı kullanarak slayt camına yarıya kapak bardak ekleyin. Not: İki yarıya gözlük arasındaki boşluk biraz doku dilim boyutundan daha büyük olmalıdır.</li>
		<li>Bir fırça veya bir pipet kullanarak beyin dilim hasat ve spacer arasında slayt cam doku yatıyordu. Doku kat değil için dikkat ediniz.</li>
		<li>PBS 100 μL doku yüzeyi dağıtmak.</li>
		<li>Diğer kare kapak cam doku üstüne yerleştirin. Hava kabarcıkları eklenmesi bu aşamasında kaçının.</li>
		<li>PBS buharlaşma ve diğer yabancı maddelerden toz tarafından sonraki görüntüleme oturumu sırasında önlemek için tırnak cilası (veya alternatif olarak uygun yapıştırıcılar) kullanarak kapak cam etrafında mühür. Not: Bu aşamada deneyci duraklatabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kalibrasyon
<ol><li>Mikroskop en az 1 h geçiş ( Tablo malzemelerigörmek) lazer termal stabilizasyon izin vermek için önce görüntüleme kaynak. Sonra spektral tarama ( Tablo malzemelerigörmek) için belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve üst kısmında GUI (Şekil 3a). Al düğmesini tıklatın
</li>
	<li>Beyaz ışık lazer (WLL) ve photomultiplier tüp (PMT) (Şekil 3a) için yazılım çekim açın.</li>
	<li>Aşağı açılan listedeki xyΛ modu içinde Satın alma moduseçin ve sonra lazer giriş modu otomatik olarak Sabit güçiçin sürekli yüzde değiştirilir. Otomatik SPhareketinin onay kutusundaki işareti kaldırın. Ve sonra 470-670 nm ve spektral adım boyu 4 giriş lazer spektral pencere ayarlayın nm ΛTarih-uyarma Lambda tarama ayarları (Şekil 3b).</li>
	<li>Devresel_ödeme spektral Aralık çift tıklatarak veya spektral Aralık (Şekil 3 c) için ayar çubuğu hareket 450-690 için ayarlayın. Not: Bu spektral Aralık tam bant genişliği giriş kaynağı içermelidir.</li>
	<li>Bir su-daldırma objektif lens, yüksek bir sayısal diyafram ile uygun seçin (NA > 0,7) ve devresel ödeme ve lazer güç için AOBS yapılandırma ve Live tarama düğmesini etkinleştirmek için herhangi bir değer vermek. Optik yol anahtarını belirtmezseniz AOBS yapılandırma (şekil 3d) yansıma kontrol ederek.</li>
	<li>Bir başvuru ayna monte ( Tablo malzemelerigörmek) mikroskop sahnede. Ayna yüzey objektif lens karşı karşıya. Eğer ayna mikroskop sahneye koymak kolay değil, bir ayna üzerine düz plaka (Örneğin slayt cam) bağ.</li>
	<li>Denetim odak düzlem ayna yüzeyine hizalamak için mikroskop sahne.</li>
	<li>Devresel_ödeme kazanç ve dedektör dinamik aralığını dikkate alınarak lazer güç ayarlamak ve sonra sürekli yüzde Sürekli güçiçin lazer giriş modunu değiştirin. Not: tipik olarak, bir devresel ödeme kazanmak 500 (V) ve göreceli lazer güç % 0.1 570 kullanılır nm.</li>
	<li>Dalga boyu aralığı boyunca hiçbir doygunluk olup olmadığını denetlemek için bir sahte renk modunda onaylayın. Doygunluk gözlem yapılırsa, lazer güç (Şekil 3a) indir.</li>
	<li>Lambda tarama edinme çalıştırın.</li>
	<li>Sahne Alanı'ndan, yansıtmayı kaldırma ve karanlık başvuru (yani, karanlık sapma) elde etmek için bir örnek olmadan aynı edinme tekrarlayın.</li>
	<li>Veri Multistacked TIF biçiminde kaydedin.</li>
</ol>3. SpeRe resim alma
<ol><li>Bağlı doku mikroskop sahnesinde yerini. Kabaca dokusu objektif lens odak düzlemi ile hizalamak için bir göz-parça aracılığıyla geniş alanlı floresans modunu kullanın.</li>
	<li>Odak düzlemi doku ilgi bölgesine hizalamak için Live inceden inceye gözden geçirmek ile denetim mikroskop sahne üzerinde. Kapak notu arka plan gürültü önlemek için cam doku arabirimden en az 15 μm kalınlığında derinlik hedef bölgeyi seçin.</li>
	<li>2.1-2,10 adımlarda açıklandığı gibi aynı yordam kullanılarak hedef bölge için spektral görüntü yığını elde etmek.</li>
	<li>İçin doku ve karanlık ofset Multistacked TIF biçiminde kaydedin. Not: Bu aşamada deneyci duraklatabilirsiniz.</li>
</ol>4. görüntü işleme ve analiz
<ol><li>Başvuru ayna ve beyin dokusu için spektral verileri (multistacked TIF) ImageJ içinde açın.</li>
	<li>ROIs (faiz bölgelerinde) için açılan görüntü yığınları seçin — başvuru ayna ve bir akson elyaf beyin dokusu için segment için merkez alan.</li>
	<li>Ham spectra seçili ROIs için çalışan görüntü → yığınları → tarafından elde Arsa z ekseni profil ImageJ menüsünden.</li>
	<li>Karanlık mahsup verileri, bir başvuru ayna ve diğer alınan beyin dokusu için alınan açın.</li>
	<li>Spectra karanlık uzaklıklar için çalışan görüntü → yığınları → tarafından elde Arsa z ekseni profil ImageJ menüsünden.</li>
	<li>Edinsel spectra kopyalama ve yapıştırma seçenekleri kullanarak kaydedin. Not: SpeRe görüntüleme için eksen dışı optik anomalileri en aza indirmek için merkezi görüntüleme alanının kullanımı önerilir. Axon lifleri yapısal olarak kendi uzunluğu boyunca heterojen olabilir. Bu nedenle, yatırım getirisi bir küçük axon kesimindeki seçerek, genellikle < 5 µm, kısmi hacimli eserdir en aza indirmek için tavsiye edilir.</li>
</ol>5. temel düzeltme ve SpeRe Sinyal Analizi
<ol><li>Başvuru ayna ve beyin dokuları spectra dan mahsup spectra çıkarma.</li>
	<li>Her spektrum yelpazenin en fazla yoğunluk bölerek normalize.</li>
	<li>Axon normalleştirilmiş spektrum referans ayna normalleştirilmiş spektrum tarafından bölmek ve normalleştirilmiş spektrum DC ofset çıkarın.</li>
	<li>Wavenumber frekans sinüsoidal bir için edinsel spektrum yaklaştırarak ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek) eğri ve sonra alınan wavenumber alarak karşılıklı tarafından periodicity için dönüştürün.</li>
	<li>Wavenumber periyodik olarak Şekil 4 cdenklemi kullanarak akson çapı dönüştürün.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath.">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li><li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction.">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices.">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system?.">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?.</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li><li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath.">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo.">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının ilan: J. Kwon ve M. Choi mucitler Bu makalede açıklanan patent bekleyen teknoloji vardır.

SpeRe canlı myelinated akson nano bilgileri sunan ilk kez spektral Interferometry dayalı bir yeni etiket içermeyen görüntüleme yöntemi var. Geçerli edinme protokolünde, akson çapı için uzamsal çözünürlük 10 sipariş olduğunu nm. Ayrıca, SpeRe diğer süper çözünürlük microscopies göre büyüklüğü Siparişler alt hafif doz kullanır; Böylece, fototoksisite ve photobleaching ücretsizdir. SpeRe myelinated akson dinamikleri nano eğitimi için yeni bir cadde sağlayacaktır.
<p class="jove_c...

Memeli sinir sisteminde miyelin hızlı sinir iletim ve aksonal bütünlüğü axon lifleri çok katmanlı zar kılıfı ile enwrapping tarafından sağlar. Çok katmanlı yapısı nano ince plazma zarı oluşur filimler alternatif oluşmaktadır (~ 5 nm), sitozol (~ 3 nm) ve hücre dışı alanlarda (~ 7 nm)1,2. Optik mikroskobu son süper çözünürlük mikroskobu, dahil olmak üzere, nano miyelin dinamikleri nedeniyle optik kırınım3,4,5onların yetersiz çözünürlük nedeniyle gözlemlemek için uygun değildir. Elektron mikroskobu miyelin nanostructure ince detaylar sağlamasına karşın, kimyasal fiksasyonu ve ultrasectioning6,7 içeren son derece invaziv örnek hazırlıkları nedeniyle yaşayan biyolojik sistemler ile uyumlu. . Yakın zamana kadar ortada hiçbir teknik myelinated akson içinde in situdinamikleri nano gözlemlemek için uygulanabilir.
Schain ve ark. daha önce myelinated akson renkli ışık yansıma8sergi bildirdi. Yansıyan ışık spektroskopik analizine benimseyerek, yeni bir görüntüleme yöntemidir myelinated akson, spektral reflectometry (SpeRe)9adlı nano görüntüleme için tasarladılar. SpeRe miyelin Kılıf (Şekil 1) çok katmanlı yapısı içinde meydana gelen ince film girişim temel alır. Çeşitli aksonlar üzerinde optik simülasyon tarafından biz-si olmak kâşif yansıma spektrum wavenumber ve onun periyodik olarak periyodik bir fonksiyonudur (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) akson çapı (d) ters orantılıdır. Bu basit ilişki (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) akson çapı facile miktar SpeRe verileri sunar. Bu kullanmak, hafif travmatik beyin hasarı bizim önceki rapor altında şişkin yaygın axon ortaya koydu.
SpeRe sistemi confocal mikroskobu dayanmaktadır ve özel Lazer kaynağı oluşur ve filtreler (Şekil 2). Geniş bant spektral çıkış için kızılötesi bölgeleri görünür sağlayan bir beyaz ışık lazer giriş kaynağıdır. Spektral tarama sistemi iki acousto optik cihazlarla donatılmıştır: Seçili yol gösterici yansıyan için seçili bir dalga boyu giriş geniş bant kaynağı ve bir acousto-optik ışın splitter (AOBS) teslim etmek için bir acousto-optik ayarlanabilir filtresi (AOTF) belgili tanımlık bulmak için dalga boyu. Hyperspectral confocal mikroskobu ( Tablo malzemelerigörmek) sırayla çeşitli giriş dalga boylarında, yansıma görüntüleri elde etmek için özelleştirilebilir spektral tarama seçeneği sunar. Buna ek olarak, renk sapmaları eleştirel spektral ölçüm engelleyebilir; Bu nedenle, bir apochromat objektif lens kullanılması tavsiye edilir.
Dikkat, beyaz ışık lazerler düzensiz bir spektral çıktı üretmek ve optik bileşenleri de spektral profil etkiler. Bu nedenle, alınan spectra sonraki kantitatif analiz için ayarlanması gerekir. Korumalı bir gümüş ayna genellikle tam görünür bölge üzerinde hemen hemen sürekli yansıma (> % 97'si) sağlayan bir başvuru olarak kullanılır. Edinsel spectra sonra ayna üzerinden başvuru spectra tarafından ayrılır.
Spektral tarama için spektral adım boyu edinme hızını belirler; Bu nedenle, optimize edilmiş olması gerekir. Bir daha yüksek spektral dönemi büyük bir akson vardır gibi ince spektral örnekleme gerektirir. Örneğin, bir akson 10 µm, en büyük fizyolojik aksonlar biri büyüklüğündeki bir spektral ~ 8 vardır nm. Nyquist örnekleme ölçüt uygulayarak, çalıştırmaya başladık spektral örnekleme aralığı 4 nm fare sinir dokularında fizyolojik aksonlar kapsayacak. Bu yaklaşım genellikle birkaç saniye boyunca tam spektral tarama devre dışı bırakır ve böylece nerede fizyolojik hareket (Örneğin solunum ve kalp atışı) istikrarlı spektral edinme müdahale vivo uygulamaları için uygun değildir. Daha önce bu sorunu bir dizi spektrometre (satın alma hızı ≈ 30 ms her piksel için) kullanarak her noktası için tam spektrum elde etmek için tasarlanmış özelleştirilmiş dik mikroskop, işaretleme tarafından çözüldü.
Bu raporda, biz SpeRe görüntüleme bir ticari hyperspectral mikroskobu gerçekleştirilebilir bir sabit beyin dilim üzerinde detaylı bir protokol tanımlamak ( Tablo malzemelerigörmek). Böylece, protokol Denemecileri optik Araçları'nda uzmanlık olmadan tarafından tamamlanabilir. Biz de olası sorunları ve satın alma ve SpeRe veri analizi için sorun giderme kapsar.

<table><tbody><tr><td>Glass cutter</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Apochromat objective 40&amp;times;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Water-immersion type</td></tr><tr><td>Fluoromyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Refer to the &quot;Configuration of microscope&quot; in Introduction Section for details.</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Coated with protected silver.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td></tr><tr><td>Slide glass</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Thickness: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000 DUAL</td><td>-</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td>-</td></tr><tr><td>White-light laser</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.</td></tr></tbody></table>

spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ

Memeli bir sinir sisteminde miyelin axon lifler çok katmanlı bir sarmal içinde enwrapping tarafından bir elektrikli yalıtım sağlar. Son derece organize hücre altı mimarisi esinlenerek, biz son zamanlarda geliştirilen canlı myelinated akson içinde in situbenzeri görülmemiş etiket ücretsiz Nano görüntüleme sağlayan spektral reflectometry (SpeRe), adlı yeni bir görüntüleme yöntemidir. Temel prensibi çok katmanlı hücre altı yapısı yansıma spektrum analiz ederek nanostructural bilgi elde etmektir. Bu makalede, biz bir temel SpeRe görüntüleme bir beyaz ışık lazer ve ayarlanabilir bir filtre ile donatılmış bir ticari confocal mikroskobik sistemiyle sinir dokuları gerçekleştirmek için ayrıntılı adım adım protokol tanımlamak. Biz numune hazırlama, spektral verileri ve görüntü nanostructural bilgi almak için işleme yordamları kapsar.

Protokole göre bir sabit beyin dilim eksojen boyama ile miyelin hedefleme fluorophore hazırlanan ( Tablo malzemelerigörmek). SpeRe görüntüleme (Şekil 4a) görüntüleme confocal floresan ile birlikte ticari hyperspectral confocal mikroskop kullanarak beyin dilim üzerinde gerçekleştirildi. SpeRe için giriş optik yoğunluğu 5 µW/µm2 ~ 1 µs piksel topla temas süresi ile ayarlandı. Bu hafif doz bir-in-büyüklük üze...

Watch this Scientific Journal Video about Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ at JoVE.com

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Myelinated akson in Situ üzerinde spektral Reflectometric mikroskobu

Burada, myelinated aksonlar üzerinde spektral reflectometry dayalı teknik görüntüleme bir etiket ücretsiz Nano kullanarak sabit beyin dilim içinde görüntüleme için adım adım bir iletişim kuralı mevcut.

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

spectral-reflectometric-microscopy-on-myelinated-axons-in-situ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

7.3K Görüntüleme.  Sungkyunkwan University. Burada, myelinated aksonlar üzerinde spektral reflectometry dayalı teknik görüntüleme bir etiket ücretsiz Nano kullanarak sabit beyin dilim içinde görüntüleme için adım adım bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Nörobilim

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Lisolesitin Odak Enjeksiyon Deneysel Demyelizasyon ve Kemirgen Omurilik remiyelinizasyon

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Biyomühendislik

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to the maintenance of neuronal polarity by sorting somato-dendritic cargo. A membrane periodic skeleton (MPS) comprising periodic actin rings provides a scaffold for anchoring various AIS proteins, including structural proteins and different ion channels. Although recent proteomic approaches have identified a considerable number of novel AIS components, details of the structure of the MPS and the roles of its individual components are lacking. The distance between individual actin rings in the MPS (~190 nm) necessitates the employment of super-resolution microscopy techniques to resolve the structural details of the MPS. This protocol describes a method for using cultured rat hippocampal neurons to examine the precise localization of an AIS protein in the MPS relative to sub-membranous actin rings using 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM). In addition, an analytical approach to quantitively assess the periodicity of individual components and their position relative to actin rings is also described.

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy 3D-SIM

The present protocol describes a method to visualize and measure actin rings and other components of the membrane periodic skeleton of the axon initial segment using cultured rat hippocampal neurons and 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM).

Akson Başlangıç Segmentinin Membran Periyodik İskeletinin 3D Yapılı Aydınlatma Mikroskobu (3D-SIM) Kullanılarak Ölçüm Özellikleri

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Beyin Dilimlerinde Miyelinasyon Görüntüleme için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...