Name: spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון בסיסי למדע (IBS-R015-D1), על-ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1A6A1A03015642).

כל הניתוחים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת Sungkyunkwan.
1. הכנת הדוגמא
הערה: תא לחץ כל מכשירי ניתוח לפני לטיפול בבעלי חיים. לנהל את כל הביצועים כירורגית בחדר המוקדש ניתוחים. השמלות כירורגי סטרילי וכפפות לענידה על ידי כל אנשי הצוות בחדר ניתוח בכל עת.
<ol><li>
קיבוע הרקמה
	<ol>
<li>להכין שני מזרקים 10 מ ל שכל מלא באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ו- 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS.</li>
		<li>עזים ומתנגד עכבר 7-שבוע בן 12, (C57BL/6J או שורות עכבר עם או מגדר) על ידי מתן תערובת של zoletil ו חריגות השירותים הווטרינריים (1:1, 20 מ"ג/ק"ג כל אחד) או משטר של הרדמה חלופי מתאים (למשל, תערובת של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים) עם זריקה בקרום הבטן.</li>
		<li>ברגע העכבר הגיע מטוס כירורגי של הרדמה (שימוש בשיטת קמצוץ-תגובה הבוהן), חושפים את הלב שתורידו את העור ואת הצלעות עם מספריים.</li>
		<li>לגזור אטריום ימין עם מספריים קטנות כדי לנקז את הדם perfuse את הפתרון PBS, כדורגלן ברצף דרך החדר השמאלי עם מחט (קצב זלוף = 4 mL/min, נפח = 10 מ"ל עבור כל הפתרונות). הערה: העכבר הופך נוקשה אם התהליך הושלם בהצלחה. השימוש של העין משחה או עיקור אין צורך כפי שנהוג מסוף. אולי תדלג על ההליך קיבעון. עם זאת, השלב זה מומלץ כדי למזער את העיוותים מבניים כולל נזק לרקמות מכני ונפיחות עצב איסכמי. פרטים נוספים על קיבוע הרקמה, להפנות המאמר על ידי גייג ', ג'יי ג'י. et al. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של הפרוסה המוח
	<ol>
<li>לערוף את העכבר עם מספריים כירורגיים דרך הגחון החזה, הגב והבטן.</li>
		<li>הסר את עור הקרקפת ואת קרום העצם בעזרת מספריים קטנות כראוי עד מלא חושפת את הגולגולת.</li>
		<li>לשבור את העצם הקדמית, לחתוך את הגולגולת לאורך התפר המשונן של עצם העורף באמצעות מספריים קטנות עם טיפול שלא יגרמו נזק למוח.</li>
		<li>הסר בעדינות את הגולגולת ואת קרום הדורה ברצף בעזרת מלקחיים משובחים.</li>
		<li>לחלץ באמצעות כף פלסטיק רך, דואגת שלא יגרמו נזק לרקמת המוח.</li>
		<li>שוטפים ומשרים המוח שחולצו בפתרון PFA 4% למשך 30 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>פורסים את המוח קבוע למקטעים מיקרומטר 100 – 150 באמצעות של vibratome. הערה: לקבלת פרטים נוספים על הכנת הרקמה, להפנות המאמר על-ידי. שגב ואח 11. להליכי עוקבות, הרקמה צריך להיות חתוכים למקטעים דק יותר עובי מרווח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הרכבה של הפרוסה המוח
	<ol>
<li>היכונו כל פרוסה רקמות שקופית 1 כוס ו- 2 כוסות שער מרובע (22 × 22 × 0.17 מ מ).</li>
		<li>חותכים חצי אחד של המשקפיים שער מרובע (שתי חתיכות מלבניות) על-ידי שימוש לחיתוך זכוכית.</li>
		<li>לצרף שתי כוסות כיסוי חצויים באמצעות דבק סופר על הזכוכית שקופיות. הערה: הרווח בין שתי הכוסות חצויים צריך להיות מעט גדול יותר מהגודל של הפרוסה רקמות.</li>
		<li>לקצור את הפרוסה המוח בעזרת מברשת או פיפטה ולהניח את הרקמה על הזכוכית שקופיות בין מרווח. . שמור על עצמך לא לקפל את הרקמה.</li>
		<li>לוותר על μL 100 ל- PBS על פני הרקמה.</li>
		<li>המקום השני מרובע כיסוי הזכוכית על הרקמה. הימנע ההכללה של בועות אוויר בשלב זה.</li>
		<li>חותם סביב הזכוכית המכסה באמצעות של לק (או לחלופין מתאימים דבקים) כדי למנוע אידוי של PBS, זיהום על ידי אבק במהלך הפגישה הדמיה עוקבות. הערה: הנסיין עלול להיעצר בשלב זה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. כיול
<ol><li>. הפעילי את המיקרוסקופ לפחות שעה לפני ההדמיה כדי לאפשר תרמי מייצב לייזר מקור (ראה טבלה של חומרים). לאחר מכן, הפעל את התוכנה עבור ספקטרלי סריקה (ראה טבלה של חומרים), ולחץ על הלחצן ידרשו בראש GUI (איור 3 א).
</li>
	<li>הפעל את התריס תוכנה כדי להפוך את הלבן-אור לייזר (יקלו) שפופרת האופטיקה (PMT) (איור 3 א).</li>
	<li>בחר את מצב xyΛ ברשימה הנפתחת במצב רכישהולאחר מכן, מצב הקלט של לייזר משתנה אוטומטית מ אחוז קבוע כוח קבוע. בטל את תיבת הסימון של תנועה SP אוטומטי. ולאחר מכן, הגדר את חלון ספקטרלי של הלייזר קלט 470 – 670 nm והגודל ספקטרלי שלב 4 nm בΛ-עירור לסרוק למדא הגדרות (איור 3b).</li>
	<li>הגדר את טווח ספקטרלי של PMT 450-690 על-ידי לחיצה כפולה או הזזת הסרגל התאמה עבור טווח הספקטרום (איור 3 c). הערה: טווח הספקטרום הזה צריך לכלול את רוחב הפס מלא של מקור קלט.</li>
	<li>בחר עדשה המטרה טבילה במים, כראוי עם צוהר מספרית גבוהה (NA > 0.7) ולתת ערך כלשהו לשלטון PMT ולייזר להפעלת לחצן לחיות לסרוק וקביעת תצורה של AOBS . לעבור בנתיב האופטי על ידי בדיקת שיקוף במעבר התצורה AOBS (איור 3d).</li>
	<li>הר ראי התייחסות (ראה טבלה של חומרים) על הבמה מיקרוסקופ. צריך לעמוד בפני השטח מראה מול העדשה אובייקטיבי. אם זה לא קל לשים את המראה על הבמה מיקרוסקופ, בונד מראה על צלחת שטוחה (למשל . שקופית זכוכית).</li>
	<li>לשלוט על הבמה מיקרוסקופ כדי ליישר את מטוס מוקד השטח מראה.</li>
	<li>להתאים את עוצמת הלייזר בהתחשב הטווח הדינמי של הגלאי ורווח PMT ולאחר מכן שנה את מצב הקלט של לייזר מ אחוז קבוע לשלטון מתמדת. הערה: כאשר הוא אופייני, PMT לקבל 500 (V) ומשמשים כוח לייזר היחסי של 0.1%-570 ננומטר.</li>
	<li>לאשר במצב צבע מדומה כדי לבדוק שאין לא רוויה לאורך כל טווח אורך הגל. אם נצפית רוויה, הנמך את עוצמת הלייזר (איור 3 א).</li>
	<li>הפעל את הרכישה למדא לסרוק .</li>
	<li>להסיר את השיקוף מן הבמה וחזור הרכישה אותו ללא דגימה לצורך קבלת ההפניה כהה (קרי, היסט כהה).</li>
	<li>לשמור את הנתונים בתבנית Multistacked TIF .</li>
</ol>3. ייבוא תמונות SpeRe
<ol><li>במקום הרקמה רכוב על הבמה מיקרוסקופ. ליישור בערך הרקמה למישור המוקד של העדשה המטרה, השתמש במצב רחב-שדות קרינה פלואורסצנטית דרך עין-קטע.</li>
	<li>גרה סרוק על, לשלוט השלב מיקרוסקופ כדי ליישר את מטוס מוקד לאזור של עניין בתוך הרקמה. כדי למנוע את רעשי הרקע תגית כיסוי, בחר את אזור המטרה לפחות 15 עומק μm מממשק זכוכית-רקמות.</li>
	<li>רוכשים של אוסף התמונות ספקטרלי לאזור היעד באמצעות ההליך אותו כמתואר בצעדים 2.1 – 2.10.</li>
	<li>לשמור את הנתונים הרקמה, ההיסט כהה בפורמט Multistacked TIF . הערה: הנסיין עלול להיעצר בשלב זה.</li>
</ol>4. התמונה עיבוד וניתוח
<ol><li>לפתוח את הנתונים ספקטרלי (טיף multistacked) עבור המראה התייחסות ו על רקמת המוח ב- ImageJ.</li>
	<li>בחר את ROIs (אזורים מעניינים) עבור אוספי תמונות נפתח — אזור מרכזי עבור המראה הפניה, על הקטע של סיב האקסון רקמת המוח.</li>
	<li>לרכוש ספקטרום raw עבור ROIs שנבחרו על ידי פועל התמונה ← ערימות ← מגרש ציר z פרופיל בתפריט ImageJ.</li>
	<li>פתח את נתוני היסט כהה, אחד נלקח במראה של ההפניה, אחרים שנלקחו עבור רקמת המוח.</li>
	<li>לרכוש הספקטרום עבור ההיסטים כהה על ידי פועל התמונה ← ערימות ← מגרש ציר z פרופיל בתפריט ImageJ.</li>
	<li>שמור כל ספקטרום שנרכשו על-ידי שימוש באפשרויות העתק והדבק . הערה: עבור הדמיה SpeRe, שימוש בתחום הדימות המרכזי כדי למזער שיבושים אופטי מהציר מומלץ. הסיבים האקסון עשוי להיות הטרוגניות מבחינה מבנית לכל אורכם. לפיכך, בחירת רועי בקטע האקסון קטן, בדרך כלל < 5 מיקרומטר, כדי למזער את החפץ בנפח חלקי מומלץ.</li>
</ol>5. הבסיס תיקון וניתוח האות SpeRe
<ol><li>להחסיר ספקטרום ההיסט של הספקטרום של המראה התייחסות ל רקמות המוח.</li>
	<li>לנרמל בכל קשת על-ידי חלוקת העוצמה המרבית של הספקטרום.</li>
	<li>לחלק את קשת המנורמל האקסון על ידי הקשת המנורמל של השיקוף הפניה ולחסר DC היסט מהספקטרום מנורמל.</li>
	<li>למדוד את תדירות מספר גל על ידי התאמת הקשת רכשה את sinusoidal עקומת (ראה טבלה של חומרים) ולאחר מכן להמיר את מספר גל רכשה תקופתיות על-ידי לוקח הדדיים.</li>
	<li>להמיר את תקופתיות מספר גל קוטר האקסון בעזרת המשוואה איור 4ג'.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath.">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li><li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction.">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices.">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system?.">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?.</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li><li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath.">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo.">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li></ol>

המחברים להכריז על אינטרסים כלכליים מתחרים: ג'יי קוואן וצ'וי מ הם הממציאים של טכנולוגיית פטנט המתוארות במאמר זה.

SpeRe הוא חדש ללא תווית הדמיה מודאליות בהתבסס על אינטרפרומטריה ספקטרלי, המציעה בפעם הראשונה, את המידע הננומטרי בשידור חי ו דנדריטים. בפרוטוקול הנוכחי רכישה, הרזולוציה המרחבית עבור קוטר האקסון הוא מסדר 10 ננומטר. יתר על כן, SpeRe מנצל הזמנות-הגודל של ערכים מינון אור נמוך יותר בהשוואה microscopies סופר ?...

במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק גיאן מהירה ותקינות עצב על-ידי enwrapping הסיבים האקסון עם מעילי פרווה עלי הלוואי קרומיים מרובה שכבות. מבנהו מרובה שכבות מורכב לסירוגין הננומטרי דק-סרטים של ממברנות פלזמה (~ 5 nm), ציטוזול (~ 3 ננומטר), ורווחים חוץ-תאית (~ 7 ננומטר)1,2. מיקרוסקופ אופטי, כולל את מיקרוסקופ ברזולוציה-העל האחרונה, אינם מתאימים להתבוננות הדינמיקות המיאלין הננומטרי בשל הרזולוציה שלהן לא מספיק בשל עקיפה אופטי3,4,5. למרות מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לספק פרטים עדינים של ננו-מבנה המיאלין, זה לא תואם עם המערכות הביולוגיות חיים עקב ההכנות מדגם פולשני ביותר מעורבים קיבוע כימי ו ultrasectioning6,7 . עד לאחרונה היו לא טכניקה ישים להתבונן הננומטרי דינמיקת ו דנדריטים באתרו בתוך.
. Schain et al. דיווח בעבר ו דנדריטים התערוכה השתקפות אור צבעוני8. על ידי אימוץ הניתוח spectroscopic על האור המוחזר, אנחנו תכנן מודאליות הדמיה חדשה עבור ננו הדמיה של ו דנדריטים, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe)9. SpeRe מבוסס על ההפרעות סרט דק המתרחשים במבנה רב שכבתית של למעטפת מיאלין (איור 1). על ידי הדמיה אופטיים על אקסונים שונים, נחשפו כי הקשת השתקפות היא פונקציה מחזורית של מספר גל תקופתיות שלה (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) הוא ביחס הפוך ל קוטר האקסון (d). מערכת היחסים הזו פשוטה (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) מציע נתיישב כימות של קוטר האקסון של הנתונים SpeRe. ניצול זה, חשפנו את האקסון ונפוצים בולטות תחת פציעת מוח טראומטית קלה בדוח הקודם שלנו.
מערכת SpeRe מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית מורכב מקור לייזר מיוחדים, מסננים (איור 2). מקור קלט הוא לבן-אור לייזר, מתן הפס הרחב פלט ספקטרלי הגלויים לאזורים אינפרא-אדום. עבור הסריקה ספקטרלי, המערכת הינו מצויד עם שני התקנים אקוסטו אופטי: אקוסטו אופטי tunable מסנן (AOTF) להעברת אורך גל שנבחרו מן המקור פס קלט של הפיצול קרן אקוסטו אופטי (AOBS) עבור המנחה שנבחר משתקפת גל את הגלאי. התוכנה עבור היפרספקטרליות מיקרוסקופיה קונפוקלית (ראה טבלה של חומרים) מספק אפשרות להתאמה אישית סריקה ספקטרלי לרכוש ברצף התמונות השתקפות קלט באורכי גל שונים. בנוסף, אברציה כרומטית יכול להתערב באורח קשה במדידה ספקטרלי; לכן, השימוש העדשה המטרה עדשה אפוכרומטית מומלץ.
ראוי לציין, אור לבן לייזרים לייצר פלט ספקטרלי לא אחידה, רכיבים אופטיים גם להשפיע על הפרופיל ספקטרלי. לכן, ספקטרום רכשה לכייל לניתוח כמותי עוקבות. מראה כסוף מוגן משמש בדרך כלל כנקודת התייחסות, אשר מספק של השתקפות כמעט קבוע (> 97%) השתלטה על האזור מלא גלוי. ספקטרום שנרכשו לאחר מכן מחולקים לפי ספקטרום הפניה מן המראה.
גודל הצעד ספקטרלי עבור הסריקה ספקטרלי קובעת את מהירות הרכישה; לכן, זה צריך להיות מותאם. כמו האקסון גדולים יותר יש תקופה ספקטרלי גבוה יותר, זה דורש עדין ספקטרלי הדגימה. לדוגמה, האקסון בקוטר של 10 מיקרומטר, אחד האקסונים הפיזיולוגיות הגדול, יש תקופה ספקטרלי של ~ 8 nm. על-ידי החלת קריטריונים הדגימה של נייקוויסט, אנחנו מועסקים את מרווח הדגימה ספקטרלי של 4 nm כדי לכסות כל האקסונים הפיזיולוגיות ברקמות העכבר לחוץ. גישה זו נמשכת בדרך כלל במשך מספר שניות לקבלת סריקה מלאה ספקטרלי, ולכן הוא לא מתאים ליישומי ויוו , איפה הפיזיולוגיות תנועה (למשל נשימה ואת קצב לב) משבש את רכישת ספקטרלי יציב. בעבר פתרנו בעיה זו על-ידי instrumenting מיקרוסקופ זקופה המותאמת אישית, שנועדה להשיג את ספקטרום מלא עבור כל נקודה באמצעות ספקטרומטר של המערך (≈ מהירות של רכישת 30 ms לפיקסל).
בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט על ההדמיה SpeRe על פרוסה המוח קבוע, אשר ניתן לבצע במיקרוסקופ היפרספקטרליות המסחרי (ראה טבלה של חומרים). כך, הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי ניסויים ללא התמחות במכשור אופטי. אנחנו גם לכסות את בעיות אפשריות לפתרון בעיות עבור רכישת וניתוח של נתונים SpeRe.

<table><tbody><tr><td>Glass cutter</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Apochromat objective 40&amp;times;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Water-immersion type</td></tr><tr><td>Fluoromyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Refer to the &quot;Configuration of microscope&quot; in Introduction Section for details.</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Coated with protected silver.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td></tr><tr><td>Slide glass</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Thickness: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000 DUAL</td><td>-</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td>-</td></tr><tr><td>White-light laser</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.</td></tr></tbody></table>

spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ

במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק בידוד חשמלי על-ידי enwrapping הסיבים האקסון ספירלה מרובה שכבות. בהשראת הארכיטקטורה subcellular-מאורגן, לאחרונה פיתחנו מודאליות הדמיה חדשה, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe), המאפשרת הדמיה ננו ללא תווית חסרת תקדים של חיה ו דנדריטים בתוך באתרו. העיקרון הבסיסי הוא לקבל מידע nanostructural על-ידי ניתוח הספקטרום השתקפות של המבנה subcellular מרובה שכבות. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לביצוע של הדמיה SpeRe בסיסיים של רקמות עצבים משתמש מסחרי במערכת מיקרוסקופיים קונאפוקלית, מצוידים לייזר אור לבן, מסנן tunable. אנחנו מכסים את תהליכי הכנת הדוגמא, רכישת נתונים ספקטרלי, עיבוד להשגת מידע nanostructural תמונה.

לפי הפרוטוקול, פרוסה המוח קבוע הוכן עם צביעת אקסוגני, fluorophore של פילוח מיאלין (ראה טבלה של חומרים). הדמיה SpeRe בוצעה על הפרוסה המוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי היפרספקטרליות מסחרי בשיתוף עם פלורסצנטיות קונאפוקלית הדמיה (איור 4a). עבור SpeRe, עוצמת קלט או?...

Watch this Scientific Journal Video about Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ at JoVE.com

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

מיקרוסקופ Reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר

כאן, אנו מציגים עבור הדמיה ו דנדריטים בפרוסה המוח קבוע באמצעות ננו ללא תווית הדמיה הטכניקה מבוססת על reflectometry ספקטרלי פרוטוקול צעד אחר צעד.

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

spectral-reflectometric-microscopy-on-myelinated-axons-in-situ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

7.3K Views.  Sungkyunkwan University. כאן, אנו מציגים עבור הדמיה ו דנדריטים בפרוסה המוח קבוע באמצעות ננו ללא תווית הדמיה הטכניקה מבוססת על reflectometry ספקטרלי פרוטוקול צעד אחר צעד.

Video: Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Bioengineering

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to the maintenance of neuronal polarity by sorting somato-dendritic cargo. A membrane periodic skeleton (MPS) comprising periodic actin rings provides a scaffold for anchoring various AIS proteins, including structural proteins and different ion channels. Although recent proteomic approaches have identified a considerable number of novel AIS components, details of the structure of the MPS and the roles of its individual components are lacking. The distance between individual actin rings in the MPS (~190 nm) necessitates the employment of super-resolution microscopy techniques to resolve the structural details of the MPS. This protocol describes a method for using cultured rat hippocampal neurons to examine the precise localization of an AIS protein in the MPS relative to sub-membranous actin rings using 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM). In addition, an analytical approach to quantitively assess the periodicity of individual components and their position relative to actin rings is also described.

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy 3D-SIM

The present protocol describes a method to visualize and measure actin rings and other components of the membrane periodic skeleton of the axon initial segment using cultured rat hippocampal neurons and 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM).

תכונות מדידה של השלד התקופתי של הממברנה של המקטע ההתחלתי של אקסון באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית בתלת-ממד (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...