Plaka okuyucu için kendini yazılı komut kurulmasında onun desteği için Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Avusturya tarafından desteklenen "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) ile saatleri (P24189) ve doktora programı "DK moleküler Enzimologiya" (W901) için PM.

1. tasarım, hazırlık ve lux Operon Escherichia coli olarak ifade
Not: Tablo malzemeleri ticari kitleri bu bölümde kullanılan hakkında bilgi için bkz.
<ol><li>Lux operon E. coli aktarmak için uygun kısıtlama siteleri ve antibiyotik direnci gen (Örneğin, pET28a; ilgi ile standart bir evde beslenen hayvan vektör seçin NcoI, XhoI, sefaloridin).</li>
	<li>Parçaları tasarım ve astar Photobacterium mandapamensis 27561 DNA sıralamasına dayanan Gibson derleme için üst üste (GenBank: DQ988878.2).</li>
	<li>Bir standart PCR reaksiyon tasarlanmış astar ve Photobacterium mandapamensis 27561 izole genomik DNA ile şablon olarak ayarlayın (astar ve koşullar için Tamamlayıcı bilgileri konusuna bakın). Not: Yalıtım ilgili bakteriyel baskı genomik DNA PCR etkinliğini artırır.</li>
	<li>Spin-sütun arıtma üzerinden PCR ürün arındırmak.</li>
	<li>NcoI ve XhoI ile izole pET28a vektör 37 ° C'de bir kısıtlama hazım için 45 dk gerçekleştirin.</li>
	<li>Doğrusallaştırılmış vektör arındırmak ve PCR parçaları ile özel Jel Elektroforez ve sonraki spin-sütun arıtma.</li>
	<li>Her parça ve Doğrusallaştırılmış vektör DNA konsantrasyonu belirlemek ve derleme iletişim kuralı20,21göre en uygun miktarlarını hesaplamak. Not: Derleme etkinliğinin parçası boyutu ve sayısı üzerinde bağlıdır ve üreticinin iletişim kuralı20,21göre ayarlanması gerekir.</li>
	<li>Tüm parçaları ve PCR tüp arabellekte birleştirerek sonra 1 h 50 ° C'de bir PCR makinesi montaj karışımı kuluçkaya.</li>
	<li>E. coli bakteri plazmid dönüşümü içine uygun bir E. coli için Standart dönüştürme protokolleri göre monte vektör ürün dönüşümü sistemi yüksek verimli plazmid çoğaltma (Örneğin, E. coli TOP10 için veya XL-1)</li>
	<li>Koloniler dönüştürme plaka ve DNA izolasyonu için yeni plakalar üzerinde çizgi seç.</li>
	<li>Standart protokolleri göre plazmid DNA izole et.</li>
	<li>Bütün parçaları dahil olmak üzere plazmid doğru Meclisi doğrulamak için ilk birleştirilmiş her parçası için astar özel kullanarak standart iletişim kuralları göre bir koloni PCR gerçekleştirin.</li>
	<li>Ayrıca koloni PCR ve sonraki özel Jel Elektroforez için tüm izole montaj vektörel çizimler doğru montaj ve doğru DNA dizileri doğrulamak DNA sıralama için hazır olun.</li>
	<li>E. coli bakteri plazmid dönüşümü içine uygun bir E. coli için Standart dönüştürme protokolleri göre doğrulanmış plazmid dönüşümü sistemi için yüksek verimli protein üretim (coli e.g.,E. BL21). Not: doğrudan ifade iletişim kuralıyla aşağıdaki devam. Daha uzun depolama için bir gliserol hisse senedi hazırlanması tavsiye edilir.</li>
</ol>2. değiştirilmiş E. coli suşlarının ifade
<ol><li>Bir gecede Kültür (Onkoloji) tarafından uygun bir farenin LB orta aşılama ifade için hazırlamak (Örneğin, 100 mL) önceden hazırlanmış gliserol hisse senedi monte plazmid ile ya da doğrudan doğruya--dan dönüştürülüyordu E. coli BL21 hücre ile bir dönüştürme plaka. 100 µL sefaloridin (50 mg/mL; pET28a antibiyotik direnci gen) ekleyin ve 37 ° C ve bir kuluçka Shaker 120 rpm ONC gecede kuluçkaya.</li>
	<li>ONC 8 mL ile (Örneğin, 800 mL LB orta) ana ifade kültürü aşılamak ve 800 µL sefaloridin (50 mg/mL) ekleyin.</li>
	<li>Hücre yoğunluğu 0,6 - bir OD600 ulaşıncaya kadar 37 ° C ve bir kuluçka Shaker 120 rpm Ana kültür kuluçkaya 0,8 (yaklaşık 2,5 h).</li>
	<li>İnkübasyon sıcaklığı 28 ° C'ye azaltmak</li>
	<li>Protein ifade 0,1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyerek teşvik. Not: 28 ° c sıcaklık azalma yüksek ışık şiddeti verdi ampirik testler gösterdi.</li>
	<li>(Yaklaşık 1 h) parlayan başlamak kadar hücreleri gözlemlemek. Not: Bağlı olarak ifade amacı, hücreleri ertesi güne kadar yetişkin ve o zaman hasat veya hücreler olabilir (en fazla 48 h) parlayan vardır sürece sallayarak devam etti. Hücreleri ve arıtma herhangi bir proteinlerin hasat standart prosedürler göre yapılabilir.</li>
</ol>3. bakteriyel kollarındaki suşları ifadesidir
Not: Bakteriyel kollarındaki suşları belirli büyüme orta/yapay deniz suyu orta büyüme ve ışık üretimi için gereklidir.
<ol><li>Yapay deniz suyu orta, iki ayrı ayrı hazırlanan orta bileşenlerden oluşan hazırlayın. Not: Yapay deniz suyu orta hazırlanması orijinal Protokolü22uyarlanmıştır. 1 L sıvı orta veya 1 L agar orta için aşağıdaki tutarlardır.<ol>
<li>Yapay deniz suyu orta için aşağıdaki tuzları tartmak: 28.13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1.60 g CaCl2 · 2H2O, 4.80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3ve 3.50 g MgSO4 · 7H2O.</li>
		<li>1 L distile su ekleyin ve tüm bileşenleri geçiyoruz.</li>
		<li>LB orta için aşağıdaki maddeler içinde ağırlık: 10 g maya ekstresi, 10 g pepton ve ağar kaplamalar, bir ek 20 g agar için.</li>
		<li>Musluk suyu 250 mL ekleyin ve bileşenleri geçiyoruz.</li>
		<li>Otoklav her iki medya ayrı ayrı 121 ° C'de 20 min için hazır.</li>
		<li>Ağar kaplamalar, 250 mL LB orta yapay deniz suyu orta 750 mL ile doğrudan ısıyla sonra birleştirmek ve tabak hazırlamak.</li>
		<li>Sıvı orta için 250 mL LB orta ısıyla hemen sonra ya da soğuduktan yapay deniz suyu orta 750 mL ile birleştirin. Not: Yapay deniz suyu orta tuz yağış bulanık alabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakteriyel kollarındaki suşları yapay deniz suyu orta agar plakalar üzerinde çizgi ve gecede 24-30 ° C'de kuluçkaya Not: Uzun zaman depolama bakteri suşlarının normalde gliserol stokları bakteriyel kültürünün dondurma aracılığıyla elde edilir. Suşların her zaman ilk kullanım nedeniyle çözdürme sonra büyüme gecikme aşamasında sıvı kültürleri için önce tüm suşları için Tekdüzen başlangıç koşulları sağlamak için agar plakalar üzerinde çizgili.</li>
	<li>Bir Onkoloji 100 mL yapay deniz suyu orta bir koloni plaka ile aşı hazırlayın. 24-30 ° C ve bir kuluçka Shaker 120 rpm ONC gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Yapay deniz suyu orta 800 mL ONC 8 mL ile aşılamak.</li>
	<li>24-30 ° C ve bir kuluçka Shaker 120 rpm bakteri hücreleri kuluçkaya. Not: Işık şiddeti profil kollarındaki bakterilerin şiddetle sıcaklık ile değişir. İlgili bakteriyel zorlanma ışık üretimini düzenleyici mekanizmaları bağlı olarak, ışık emisyon yaklaşık 1-6 h sonra başlayabilir.</li>
	<li>(Yaklaşık 1-6 h) parlayan başlamak kadar bakteri hücre kültür gözlemlemek. Not: Bağlı olarak ifade amacı, hücreleri ertesi güne kadar yetişkin ve o zaman hasat veya hücreler olabilir onlar parlayan vardır sürece sallayarak devam etti. Hücreleri ve arıtma herhangi bir proteinlerin hasat standart prosedürler göre yapılabilir.</li>
</ol>4. Vivo içinde faaliyet tahlil bakteriyel kollarındaki suşları ve değiştirilmiş E. coli suşları için
Not: Uzun süre suşları normalde gliserol stokları bakteriyel kültürünün dondurma ile acieved saklanmasıdır. Suşların her zaman ilk kullanım nedeniyle çözdürme sonra büyüme gecikme aşamasında sıvı kültürleri için önce tüm suşları için Tekdüzen başlangıç koşulları sağlamak için agar plakalar üzerinde çizgili.
<ol><li>Çizgi istenen kollarındaki bakteriyel zorlanma veya değiştirilmiş E. coli agar plaka üzerinde gerginlik ve 28 ° C'de gecede kuluçkaya. Not: Kuluçka sıcaklık zorlanma zorlanma değişebilir ve ampirik olarak değerlendirilmek üzere vardır. Değiştirilmiş ve kollarındaki bakteri suşları karşılaştırmak için E. coli suşları, büyüme koşullar aynı olması gerekir.</li>
	<li>Bir koloni bir agar plaka ile ilgili zorlanma ile orta 3 mL aşılamak ve 28 ° C ve yaklaşık 1-2 h için bir kuluçka makinesi Shaker 180 rpm hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>1:10 hücre yoğunluğunu ölçmek seyreltme sıvı kültür, 650 nm. Oranı ve birim 0,05 OD650 ile 1 mL kültür için hesaplar. Not: Sonraki plaka okuyucu tahlil 650, hücre yoğunluğu belirleyecek nm suşları ışık emisyon tarafından önlemek için.</li>
	<li>Cam alt ile 24-şey siyah duvarlı plaka içine kültür ve orta hesaplanan hacmi pipette. Değiştirilmiş E. coli için zorlanma, sefaloridin (pET28a vektör antibiyotik direnci) 1 µL ve IPTG (gen ekspresyonu İndüksiyon) 1 µL örnekleri için ekleyin. Ölçümler sırasında buharlaşma önlemek için plaka üzerinde bir kapak koyun. Not: bütün lux operon içeren pET28a vektör E. coli kültüründen kaybolmak değil ki sizi temin ederim ki, sefaloridin E. coli örnekleri E. coli ışık üretim temin etmek için ve plaka Wells için eklemeniz gerekir hücreleri ölçülebilir, gen ekspresyonu IPTG tarafından indüklenen gerekir. Çapraz karışma ve ölçüm girişimi engellemek için en iyi sonucu cam alt ve şeffaf kapak ile iyi tabak siyah duvarlı gösterdi. Yine de, crosstalk gözlenen ve iyi pozisyonlar özenle seçilmiş zorunda.</li>
	<li>Ölçüm bir plaka okuyucu olarak başlatın. Not: Özel olarak geliştirilen bir el yazısı plaka okuyucu Protokolü dayanmaktadır Bu tahlil için (bkz. Ek malzeme) bu iki ölçüm, absorbans ve bioluminescence birleştirir. Veri noktaları ile kalıcı sallayarak ölçümleri ve 28 ° c sabit sıcaklık arasında her 10 min toplanır</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widder, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+in+the+Ocean:+Origins+of+Biological+Chemical,+and+Ecological+Diversity.">Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity.</a> Science. 328 (5979), 704-708 (2010).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence,+Microbial.">Bioluminescence, Microbial.</a> Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).</li><li>Ulitzur, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+tetradecanal+as+the+natural+aldehyde+in+bacterial+bioluminescence.">Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).</li><li>Kurf&#252;rst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+postulated+structure+of+the+primary+emitter+in+the+bacterial+luciferase+reaction.">Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence.</a> Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Bioluminescence:+Organization,+regulation,+and+application+of+the+lux+genes.">Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes.</a> FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+Photobacterium+leiognathi+non-fluorescent+flavoprotein+with+limited+sequence+identity+to+bacterial+luciferase.">Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase.</a> J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+flavoprotein+related+to+the+subunits+of+bacterial+luciferase.">Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase.</a> EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+structural+features+of+the+luxF+protein+and+the+subunits+of+bacterial+luciferase:+Evidence+for+a+(&#946;&#945;)8+fold+in+luciferase.">Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (&#946;&#945;)8 fold in luciferase.</a> Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+refinement+of+the+non-fluorescent+flavoprotein+from+Photobacterium+leiognathi+at+1.60+&#197;+resolution.">Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 &#197; resolution.</a> J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).</li><li>Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+flavoprotein+FP390+from+a+luminescent+bacterium+Photobacterium+phosphoreum+refined+at+2.7+&#197;+resolution.">Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 &#197; resolution.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).</li><li>Bergner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biochemical+properties+of+LuxF+from+Photobacterium+leiognathi.">Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi.</a> Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).</li><li>Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+quorum+quenching+in+Vibrio+harveyi:+Lessons+learned+from+in+vivo+work.">Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work.</a> ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).</li><li>Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Genetics of bacterial bioluminescence.</a> Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).</li><li>Kelkar, M., De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+based+in+vivo+screening+technologies.">Bioluminescence based in vivo screening technologies.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).</li><li>Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+luciferase+reporters:+The+Swiss+army+knife+of+molecular+biology.">Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology.</a> Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).</li><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioluminescence living lights, lights for living. , (2013).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).</li><li>Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

P. mandapamensis 27561 bütün lux-kaburga operon birçok parçalardan oluşan dört parçaları içeren bir ifade plazmid inşaatı Gibson klonlama elde edildi. Bu dayalı E. coli lux gen ekspresyonu E. coli hücreleri ışık yayılmasını sağlamak sağlar. Yönetmelik ve standart olmayan büyüme koşulları algılama çekirdek kaçınarak bu sistemin önemli avantajlar vardır.
Gibson klonlama strateji kullanmanın yararları birden çok doğrusal DNA parçalarının, yüksek düzeyde esneklik ve belirli kısıtlama siteleri18,19,20gerek yok kolay montaj vardır. Bu yöntem tek gen veya gen kümeleri hariç veya yeni genlerin tanıtan veya başka bir ile bir zorlanma gen alışverişi lux operon, kolayca değiştirmenizi sağlar. Durumu ilgili lux operon gen dizisinin bu yöntemin uygulanması için bir önkoşuldur. Sadece az sayıda kollarındaki bakteri için ilgili lux operon tam DNA dizisi bilinen ve/veya kullanılabilir. Çünkü onlar av tüfeği sıralama kullanarak oluşturulan bu dizilere çoğunun parçalanmış. İncelenen P. mandapamensis durumunda 27561 lux operon tam DNA dizisi bilinen ve NCBI gen veritabanı edinilebilir (GenBank: DQ988878.2).
Gibson derleme protokolündeki bir kritik adım tek parçaları DNA konsantrasyon hesaplaması olur. Üreticinin Bu 0,2 - kullanmak için tavsiye edilen derleme protokolündeki 0.5 pmols ve 4-6 parçaları20,2120 µL toplam hacmi. Nerede luxCDABFEG-ribEBH 4 parçaları oluşur, bizim durumumuzda konsantrasyonları ve toplam birimleri 0.1 pmol ve 45 µL, sırasıyla, PCR ürünleri verim bağlı olarak idi. Bir yandan, konsantrasyonu azalır gerekiyordu ve öte yandan, birimin artmış gerekiyordu. Yine de, derleme çok iyi çalıştı ve DNA sıralama ilk girişiminde doğru ekleme doğruladı. Bu bulgu Gibson derleme kolayca tarihinde18,19,20olabilir araştırmalarımız için sağlam ve uygun bir yöntem olarak doğruladı.
Yeni kurulan plaka okuyucu tahlil yöntemi işlemek bir kolay. Yeni basit bir birincil analizini etkinleştirir veya (BM-) bilinen kollarındaki bakteri suşları ve verir zaten hafif üretim (Örneğin, düşük hücre yoğunluğu, ışıma lag) düzenleyici mekanizma bir ilk ipucu. Ayrıca, ışık üretimi ile birlikte büyüme koşullarına kolayca sadece büyüme orta veya sıcaklık değiştirerek değerlendirilebilir.
Ölçümleri plaka okuyucu ile 28 ° C'de gerçekleştirilmiştir Bu alışılmadık ayarı nedeni 30 ° C üzerindeki sıcaklıklarda daha az hatta yok büyüme ve / veya ışık emisyon için nereye kollarındaki bakteri suşları, sıcaklık hassasiyeti var. Unutmayın, plaka okuyucu tanımlanmış bir sıcaklık kayıp bir sınırlama ile zaman içinde aktif soğutma sistemi saklamaktan yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, ortam sıcaklığı ölçümü sıcaklık altında olmalı.
Kavramının bir kanıtı olarak E. coli yapı kollarındaki zorlanma ile karşılaştırılması P. mandapamensis (Şekil 5) bir yandan ve başvuru ölçümleri (Şekil 4) öte yandan gerçekleştirilen ve onaylamak Bu yeni kurulan sistemin güvenilirliği. Ayrıca, uzun vadeli ölçüm ışık emisyon (Şekil 6) uzun ömürlü güvence verdi. Ama OD değerleri güvenilir bir optik belirli yoğunluk, nerede uygun bir seyreltme gerekli bir ölçüm için kullanılan ölçüm cihazı (yaklaşık 15 h mevcut durumda) özelliklerine bağlı olarak yukarıda değildir düşünün zorunda Dedektör doğrusal dizi. Bu yüksek farklarını OD değerleri bu uzun zaman ölçümleri değil güvenilir olun. Bu nedenle, 10 h gibi daha kısa ölçümleri deneysel kurulumu kullanarak rapor burada tavsiye edilir.
Şekil 7' de kurulan plaka okuyucu tahlil sınırlamaları görülebilir. Zorluk ölçü uygun bir ortam bulmak mümkün. 'Kazanç değeri' fotoğraf çarpanı tüp (PMT) duyarlılığını ayarlar. Daha yüksek bir kazanç faktörü sinyali artacaktır anlam Devresel_ödeme, sinyalin amplifikasyon kazanç olduğunu. Kazanç çok düşük ayarlanmışsa, sinyal-gürültü oranı daha büyük olur ve "düşük" parlayan kollarındaki bakteri ışık yoğunluklarda olamaz sıfıra, değil gösterilen veriler yakın herhangi bir daha fazla (sinyal) ölçülür. Kollarındaki tahlil mücadelesine ölçüm sonuçları tüm bakteri suşları için araç aralığında kalmak kazanç ayarlamaktır. Ayrıca, ışıma ölçüm aralığı ölçüm aralığı zaman bağlıdır (Örneğin, en fazla 1 için 2.000.000 s).
Kazanç için 2800, hangi ampirik olarak test edilmiş ve bu yöntem kurulması için kullanılan özel plaka okuyucu için seçilen kuruldu. Kullanılan kazanç ayarı en fazla verilmiş ışık kayıt kollarındaki tarafından sağlayan E. coli sistemi, P. mandapamensis 27561 ve P. mandapamensis S1 bir taşma olmadan, ama suşları P. mandapamensis TH1 ve için Harveyi V. 14126 kazancı çok yüksek. Bu nedenle, bu ikinci suşları algılama sınırını aşan ve gerçek maksimal ışık şiddeti ölçülemez. Bu teknik sınırlama büyüme koşulları ve hücre yoğunluğu karşılaştırılabilir olabilir, ancak yüksek çeşitleri içinde en fazla ışık emisyon, göstermek kollarındaki bakteriler, karşılaştırılması engelleyebilir.
Ampirik olarak değerlendirilmek üzere kullanılan iyi tabak içinde analiz bakteri suşlarının konumlandırma vardır. Her ne kadar iyi pilakalar siyah ve cam dipleri kullanıldı, crosstalk örnek arasında gözlendi. Belirli suşları ışık yoğunluğu çok yüksek, tüm komşu wells yanlış pozitif ışık emisyon (Örneğin, boş) gösterecektir. Bu nedenle, iki farklı suşları ayrı ayrı ya da birbirlerine belirli bir uzamsal ayırmalı ölçmek önemlidir.
Zaten birçok lux operon bölümlerini içeren bilinen E. coli suşları ve esas olarak uygulama odaklı15,16,17değiştirilebilen vardır. Yöntem tanımlamak burada, temel araştırma, örneğin her lux gen ayrı ayrı analiz imkanı nişan al. Bioluminescence araştırma uzun bir geçmişi olmasına rağmen hala birçok açık sorular vardır. Hariç veya genlerin lux operon tanıtmak, başka bir soy genler ile luxAB gen alışverişi veya protein analizi kompleksleri, gömülü kolay E. coli sistem ve daha fazla uygulama plaka işlemek için okuyucu tahlil, düzenleyici işlemler ve lux genlerin fonksiyonları hakkında daha fazla bilgi elde etmek olasılığı vardır.

Işık yaşayan organizmalar (bioluminescence) tarafından emisyon bakteriler, mantarlar, böcekler, nematod, balık ve mürekkep1bulunan büyüleyici bir süreçtir. Kollarındaki ışık emisyon chemiluminescent bir tepki içinde kimyasal enerji dönüştürülür (kısmen) ışık enerjisi ("soğuk ışık") çıkar. Kollarındaki bakterilerde heterodimeric enzim luciferase uzun zincirli, alifatik aldehitler, tetradecanal, 490 nm2, maksimum ışık emisyon eşliğinde karşılık gelen asitler için gibi monooxygenation tromboksan. 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2.jpg"> Resim 1 : Bakteriyel luciferase düzeninin genel tepki. Bakteriyel luciferase (LuxAB) uzun zincirli monooxygenation tromboksan tarafından kullanan aldehitler (CH3(CH2)nCHO) azaltılmış flavin mononucleotide (FMNH2) ve moleküler oksijen (O2), ürünlerin verimli uzun zincir asitler (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), su (H2O) ve 490 merkezli ışık emisyon nm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu oksidasyon sırasında enerji FMN-4a-ışık yayan biyoluminesans4hizmet veren hidroksit, heyecanlı bir duruma neden olur. Bakteriyel bioluminescence, yani LuxCDABEG, yer alan proteinler lux operon tarafından kodlanmış ve çeşitli bakteri suşları2,5üzerinde son derece korunmuş. Genler luxA ve luxB için heterodimeric luciferase kodlamak; luxC'ın, luxD'ınve luxE'ın gen ürünleri bir yağ asidi alfa redüktaz karmaşık bileşenleridir; ve luxG için flavin redüktaz6kodlar. Kollarındaki Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bir dizi ek luxF gen taşımak. Bu LuxF sıradışı flavin türev 6-(3'-(R)-myristyl bağlar bir homodimeric protein olduğunu bildirildi)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Ek genler riboflavin sentezi (Örneğin, ribEBH) için sorumlu olan tespit edilmiştir ve ayrıca düzenleme genler bildirilmiştir, bu çekirdek algılama düzenleme bioluminescence, özellikle Vibrio için bir rol oynamaktadır fischeri ve Vibrio harveyi6,13. Son derece korunmuş gen sipariş rağmen büyüme davranış, ışık emisyon yoğunluğu veya düzenleme bioluminescence2,5,14, gibi özellikleri yüksek varyasyonları kollarındaki bakteri gösterir .
Birkaç suşları veya bölümü içeren plazmid değiştirilmiş veya bioluminescence muhabir sistemleri olarak istismar bütün lux operons bilinir. Organizatörü etkinlik, belirleme gibi çeşitli uygulamalar ortamda ya da gıda örnekleri, Bioluminescence rezonans enerji transferi (BRET), bakteriyel contaminations izlenmesi ökaryotik organizmalarda enfeksiyonların vivo içinde görüntüleme pyrosequencing ve benzeri kurulan15,16,17yaşındaydın. İlginçtir, üç kollarındaki muhabir sistemleri Kuzey Amerika ateş böceği (Photinus pyralis), nematodlar (Photorhabdus luminescens) enterik patojen ve deniz hercai menekşe (Renilla elde edilen en sık kullanılan reniformis). Bu sistemlerin hiçbiri bakteriyel bir kaynağı vardır, ama lux genler ve bakteriyel kökenli operons için uygulamalı araştırma16daha fazla ilgi kazanıyor. Bakteriyel kaynaklardan bioluminescence proteinlerin uygulama daha az bol esas olarak daha düşük istikrar nedeniyle ve deniz habitatlarını ilgili Işıksaçan proteinler bakteriler uzun ömürlü türetilmiş. Kollarındaki bakteri deniz alanları Standart laboratuvar koşullarında cultivable değildir. Bu bakterilerin belirli büyüme medya ve yapay deniz suyu orta ve düşük büyüme/kuluçka sıcaklıkları (Örneğin, 28 ° C) gibi koşulları gerektirir.
Genlerin farklı kollarındaki bakteri suşları, lux operon ifade ve analiz standartlaştırmak için bir yöntem bir dizi karşılaştırma lux operon özellikleri veya tek lux basitleştirmek için bir ön koşul olduğunu. Böylece, bütün lux-kaburga operon standart-araştırma bakteri Escherichia coli (e.coli) entegre fikri ortaya çıktı. Bu amaçla, Gibson derleme bir ifade vektör belirli kısıtlama siteleri için gerek kalmadan birden çok doğrusal, çakışan parçaları bütünleştirmek için yararlı bir araç olduğu ortaya çıktı. Bu yöntem ayrıca DNA ekler çok büyük olduğunda uygundur (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon boyutu) PCR ile kuvvetlendirilmesine. Lux operon birden çok örtüşen parçalara ayrılmış, daha sonra bir ifade plazmid monte edilebilir ve nihayet sıra derleme ürün doğrudan uygun bir E. coli dönüştürülmüş doğrulanmadı için yüksek verimli sistem protein ifade18,19,20. Kolay yanı sıra dayalı E. coli lux gen ekspresyonu, hücre büyümesi ve kollarındaki ışık emisyon kayıt birleştirerek basit bir yöntem kurulacak kaldı. Burada açıklanan yöntemi in situ ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon sağlar.
Analiz lux genler ve lux operon düzen ve düzenleme çeşitli kollarındaki bakteri ile bir yandan, bir yapay kollarındaki E. coli , s. bütün lux-kaburga operon içeren sistem mandapamensis ve 27561, diğer yandan, hücre yoğunluğu ve ışık emisyon, in situ kayıt birleştirerek yeni geliştirilen plaka okuyucu tahlil çeşitli bakteri lux sistemleri hakkında daha fazla bilgi elde etmek için yardımcı olur. Bu temel karakterizasyonu ve luciferases ve ilgili enzimler karşılaştırılması alternatifler zaten kurulmuş muhabir sistemleri için geliştirilmiş istikrar ve etkinlik neden olabilir.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>E2621S</td><td>for 10 rxn&lt;br/&gt; dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad</td></tr><tr><td>Phusion Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0721</td><td>for 50 rxn</td></tr><tr><td>Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193S/R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>for 250 rxn</td></tr><tr><td>Monarch DNA Gel Extraction Kit&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>#T1020S</td><td>for 50 rxn</td></tr><tr><td>GeneJet Plasmid Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td>for 250 rxn</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>24-well black sensoplate with glass bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>662892</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Omega plate reader&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA/Mars Analysis Software</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Version 2.20</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard Incubator Shaker</td><td>Infors AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ measurement and correlation of cell density and light emission of bioluminescent bacteria

Işık yayan yetenekli önemli sayıda bakteri. Hepsi aynı gen küme, yani lux operon paylaşmak. Bu benzerlik rağmen bu bakterilerin büyüme davranış, ışık emisyon yoğunluğu veya bioluminescence düzenlenmesi gibi özellikleri aşırı farklılıklar gösterir. Burada sunulan hücre büyümesi ve kollarındaki ışık emisyon yoğunluğu kayıt plaka okuyucu kullanmak zaman içinde birleştiren yeni geliştirilen bir tahlil yöntemidir. İlgili bakteriyel gerginliği, yönetmelik algılama çekirdek gibi önemli özellikleri elde edilen büyüme ve ışık emisyon özelliklerini bağlanabilir. Kollarındaki bakteri bir dizi ekimi özel bir ortam (Örneğin, yapay deniz suyu orta) gerektirir ve sıcaklıklar tanımlanan. Kolay, kollarındaki standart-araştırma bakteri Escherichia coli (e.coli), öte yandan, ucuz laboratuvar ölçekte yüksek miktarlarda ekili. Bütün lux içeren bir plazmid tanıtarak E. coli istismar operon deneysel koşullar basitleştirebilir ve ayrıca gelecekteki uygulamalar için birçok olanaklar açar. Bir E. coli ifade zorlanma kullanan tüm lux genlerin ifade bir ifade plazmid Gibson klonlama yoluyla inşaatı ve yedi lux genler ve üç kaburga genler içeren dört parçalarının ekleme tarafından elde edildi lux-kaburga operon pET28a vektör içine. Dayalı E. coli lux gen ekspresyonu indüklenen ve kollarındaki E. coli sonuçlanan izopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ek üzerinden kontrol hücreleri. Bu sistemin çekirdek düzenleme kısıtlamaları ve karmaşık orta besteleri ile birlikte standart dışı büyüme koşulları, gibi algılama önlemek için sıcaklıklar tanımlanan avantajları. Bu sistem lux operon üzerinden ilgili gen dışlanma veya başka bir tarafından bir bakteriyel zorlanma luxAB gen alışverişi roman genlerin bile ek çözümleme lux genler ve onların etkileşim sağlar veya luxCDEgibi protein kompleksleri analiz.

Lux operon - luxCDABFEG - gen sırasını çeşitli suşları2,5,14üzerinde son derece korunmuş. Plazmid tasarım, sırası bilgi kollarındaki bakteriyel zorlanma Photobacterium mandapamensis 27561 çekildi ve gen siparişi aynı tutuldu ve, Ayrıca, arasında tek gen kodlamayan diziler kabul edildi. Uygulamalı Gibson klonlama strateji şematik bir bakış Şekil 2' de tasvir edilir. Toplam, luxCDAB, luxF, luxEG, ve ribEBH, dört parçaları ile 20-40 baz çifti dizileri örtüşen üretildi. Gibson derleme20tüm adımları uyguladıktan sonra DNA sıralama bütün parçaları dahil olmak üzere plazmid, doğru Meclisi doğruladı. Lux-kaburga operon içeren vektör Haritası son montaj ürün pET28a Şekil 3' te tasvir edilir. Kullanımı bu değiştirilmiş pET28a vektör önemli bir avantaj olduğunu E. coli büyüme koşulları standart ve indüksiyon IPTG ile kontrol edilir.
Kollarındaki bakteri ve ilgili hücre yoğunluğu ışık emisyon ölçmek için bir plaka okuyucu müstenit yöntem geliştirilmiştir. Plaka okuyucu için yöntem ışık yoğunluğu ve hücre yoğunluğu için tek ölçüm komut dosyaları birleştirerek oluşturuldu. Bu yeni komut dosyası OD650 ölçümü etkin ve zaman dilimi, oluşturma süresi (Örneğin, 10 h) ilgili çözümlemesi için kullanılan bakteri için ayarlanacak olan ışık şiddeti her 10 min için bir Kullanıcı tanımlı. Optik yoğunluğu ölçümü 650 gerçekleştirildi nm ışık emisyon girişimi engellemek için. Bir kanıtı kavramı ve sağlık ve E. coli hücrelerinin doğru büyüme davranışı sağlamak için olarak, başvuru ölçümleri yapıldı. Şekil 4 E. coli BL21 hücreleri, bir boş pET28a vektörü içeren E. coli BL21 hücreler ve E. coli BL21 hücreleri içeren pET28a vektör lux-kaburga operon ile karşılaştırılması Ekle sunulmaktadır. İkinci baskı için hiçbir IPTG leakiness nedeniyle ışık emisyon T7 düzenleyicinin analiz etmek için eklendi. Tüm üç başvuru ölçümleri üç büyüme fazları (gecikme, üstel ve sabit faz) ile sigmoidal büyüme eğrisi göster. Sadece pET28a vektör ışık yayması için lux-kaburga operon Ekle başlaması ile birlikte, ama aksine ölçümleri içeren E. coli BL21 hücreler nerede ifade IPTG ve ışık eklenmesi tarafından indüklenen 30 dk sonra sigara kaynaklı hücreler duyulur sadece yaklaşık 5 h sonra parlaklık ve bir çok daha düşük ışık emisyon göstermek başlar (ca. 4-fold) indüklenen sisteme göre.
Şekil 5 büyüme eğrilerinin karşılaştırılması ve E. coli ve kollarındaki bakteriyel zorlanma P. mandapamensis 27561, LB orta veya yapay deniz suyu orta ifade lux operon ışık yoğunluklarda verir, Roman kullanarak situ yöntemi kurulmuş. Bu bakterilerin karşılaştırmak için ölçümler bir kuluçka 28 ° c sıcaklığında yapıldı Bu sıcaklık azalır değiştirilmiş E. coli büyüme hızının zorlanma LB orta yanı sıra yapay deniz suyu orta ama kollarındaki bakteri suşları daha düşük sıcaklıklar için büyük önem taşımaktadır. P. mandapamensis 27561 E. colidaha çok daha yüksek bir hücre yoğunluğu gösterdiği gibi bu sıcaklık bağımlılık Şekil 5'A, görünür. Bundan başka E. coli suşları için üretimi LB orta bırakmak için doğal kollarındaki bakteri suşları, daha yüksek hücre yoğunluğu, yapay deniz suyu orta tercih edilen ve bioluminescence için gerekli. Kaydedilen hücre yoğunluğu ile ilgili hafif yoğunluklarını, Şekil 5' teBgösterildiği gibi aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Önemli, kollarındaki E. coli hücreleri ulaşmak benzer ışık emisyon maxima her iki LB orta hem de yapay deniz su ortamı, her ne kadar en yüksek yoğunluklarda farklı zaman noktalarda kaydedildi. Bu gözlem, aksine P. mandapamensis 27561 LB orta son derece düşük büyüme oranları ile uygun ama bakteri hücreleri tüm (Şekil 5B) ışık yayarlar değil. Yapay deniz su ortamı, P. mandapamensis 27561 1 x 10-4 sayıları yaklaşık 200 E. colidüşük bir faktör olan saniye başına en fazla ışık emisyon gösterir. Şekil 5 C bioluminescence OD tarafından nerede normalleştirilmiş göreli ışık birimleri temsil eder. Bu sonuçlar doğrulama sadece yapıldı bir plazmid ekleme içeren lux operon E. coli başarılı ve fonksiyonel, ama aynı zamanda bu E. coli değiştiren yük daha yüksek ışık emisyon ile geçerli bir alternatif olduğunu verimleri ve karmaşık bir deniz suyu gibi marina bakteriler bakteri biyolüminesans sınırlama olmaksızın Orta ve düşük sıcaklıklarda.
Ayrıca, dayalı E. coli lux-kaburga gen ekspresyonu 24 h üzerinden uzun vadeli bir ölçü belgili tanımlık uzun yaşam ışık emisyon (Şekil 6) çözümlemek için gerçekleştirildi. Işık emisyon 19.5 saat sürdü, çok daha uzun daha bakteri suşları (örn., P. mandapamensis 27561) kademeli bir düşüş nerede çok düşük ışık emisyon 10 h sonra sonuçlanan gözlendi.
Gelişmiş tahlil sınırlarını göstermek için Şekil 7 üç kollarındaki bakteri suşları, yani Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 ve Vibrio ölçüm sonuçlarını gösterir harveyi 14126. İlk zorlanma (S1) için bu yöntem çok iyi çalışıyor ve yaklaşık 2 x 106maksimal bioluminescence yoğunluğunu gösterir. Diğer iki suşları (TH1 ve 14126), her iki tarafından üretilen ışık şiddeti kullanılan araç ayarları algılama sınırını aştığından maksimal ışık şiddeti belirlenemiyor. Gelişmiş yöntemi (komut dosyası) bu iki suşlar için tanımlanan kazanç değeri çok yüksek ayarlandı. Yine de, bioluminescence etkinlik başlangıcı birbirleriyle karşılaştırılabilir. P. mandapamensis TH1 ve P. mandapamensis S1 başlatmak yaklaşık 1 saat ve bir OD650 değerini 0.1 sonra parlayan - 0.2, anılan sıraya göre. Buna ek olarak, harveyi V. 14126 1.0 bir OD650 değeri yaklaşık 5.5 saat sonra ışık yayması başlar. Işık emisyon gözlenen baslangici yanı sıra bioluminescence OD üstel artış eşlik ediyor. V. harveyi 14126 biyolüminesans yönetmelik algılama çekirdek altında yatan ve bu nedenle belirli bir hücre Şekil 713' te açıkça görülebilir lux operon aktivasyonu sağlayan yoğunluğu bilinmektedir. Bu roman situ ile plaka okuyucu tahlil kolayca kollarındaki bakteri karşılaştırmak ve aynı zamanda kabaca bir düzenleyici mekanizma bu suşların yönetmelik algılama bir çekirdek olup olmadığını belirleyerek tanımlamak mümkün olabilir bu sonucu gösterir ya da değil görülmektedir.
Şekil 8 E. coli BL21 hücreleri indüksiyon ile IPTG sonra lux operon içeren birleştirilmiş pET28a plazmid barındıran bir ifade kültürünün bir örneği gösterilir. İndüksiyon sonra yaklaşık bir saat sonra E. coli hücreleri mavi-yeşil renk ile parlayan başlamak. Şekil 8 A kültür fotoğrafı ışık ve Şekil 8B verir aynı kültür karanlıkta E. coli ifade gösterir. Şekil 8 C bir agar plaka P. mandapamensis S1 bakteriyel bioluminescence için aynı mavi-yeşil renk karakteristik karanlıkta parlayan ile yapay deniz su ortamının gösteriyor.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3.jpg"> Resim 2 : Strateji klonlama uygulanan Gibson şematik gösterimi. Adım (ı): (renkli oklar; ca. 20-40 baz çifti üst üste) Overlapping astar tasarlanmıştır. Üst üste gelen astar tavlama sıraları oluşan bir parçasının ilgili 5' ve 3' bölge ve bitişik kesiminin ilgili 3' ve 5' bölge içerir. Adım (II): Derleme için tasarlanmış parçaları standart PCR reaksiyonları ile oluşturulur. Adım (III): Hedef vektör (Örneğin, NcoI, XhoI) kısıtlama sindirim tarafından Doğrusallaştırılmış. Adım (IV): Tüm parçaları ve Doğrusallaştırılmış vektör DNA konsantrasyonları Gibson derleme (göre üreticinin iletişim kuralı) için uygun toplama ayarlamak kararlı olmak zorunda. Adım (V): Tüm parçaları ve en iyi duruma getirilmiş DNA konsantrasyonları ile Doğrusallaştırılmış vektör Gibson derleme ana karışımı ile (T5 eksonükleaz aktivitesi, DNA polimeraz ve DNA ligaz) birleştirilir ve 1 h için 50 ° C'de inkübe adım (VI): derleme ürün dönüştürüldükten uygun bir E. coli içine standart protokolleri göre yüksek verimli plazmid çoğaltma (Örneğin, E. coli TOP10 veya XL-1) için zor. Adım (VII): Plazmid doğru Meclisi doğrulamak için birleştirilmiş plazmid DNA sıralama yapılması gerekiyor. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2.jpg"> Şekil 3 : Lux-kaburga operon içeren vektör harita pET28a. P. mandapamensis 27561 lux-kaburga operon pET28a orijinal gen sırayla (luxCDABFEG-ribEBH) birden çok klonlama sitenin eklenir. Klonlama için kullanılan kısıtlama siteleri NcoI ve XhoI vardır. Operon Gibson montaj için kullanılan luxCDAB turuncu, yeşil luxF , luxEG mavi ve ribEBH lavanta oluşuyor; genlerde bir parçası ayrı bir kutu gösterilir. Arasında operon her gen kodlamayan diziler uygulanan klonlama stratejisinde yer almaktadır. Bütün lux-kaburga operon içeren son plazmid pET28a 14,625 baz çifti uzunluğundadır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2.jpg"> Şekil 4 : Büyüme eğrileri ve başvuru suşlarının ışık yoğunluklarda karşılaştırılması. OD, 650 nm ve sayıları saniyedeki bioluminescence şiddeti her 10 min 10 h 28 ° C'de üzerinden ölçülen Tüm ölçümler ile dört teknik çoğaltır her üç biyolojik çoğaltır ortalama değerleridir. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. E. coli BL21 hücreleri (gri kareler), boş bir pET28a içeren E. coli BL21 hücreler (gri daireler) vektör ve E. coli BL21 hücreleri içeren pET28a vektör lux-kaburga operon eklemek (siyah elmas) ile analiz edildi E. coli hücrelerimizin davranışını doğru büyüme sizi temin ederim. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2.jpg"> Şekil 5 : Büyüme eğrilerinin karşılaştırılması ve lux operon ışık yoğunluklarda 27561 (daireler) LB Orta (açık sembolleri) veya yapay deniz suyu Orta (dolgulu semboller) ifade E. coli (kare) ve P. mandapamensis . Tüm ölçümler ile dört teknik çoğaltır her üç biyolojik çoğaltır ortalama değerleridir. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Tüm deneylerin bir kuluçka 28 ° c sıcaklığında yapıldı (A) optik yoğunluk (OD) ölçülerde 650 nm gerçekleştirilen her 10 min için 10 h. E. coli lux operon ifade (sol panelde) P. mandapamensis için 27561 (doğru kapı aynası) LB orta ve yapay deniz su ortamda karşılaştırılır. Hücre yoğunluğu belirlenir 650 nm bioluminescence girişimi engellemek için. (B) 10 h. E. coli lux operon ifade (sol panelde) P. mandapamensis için 27561 (doğru kapı aynası) içinde LB karşılaştırılır için ışık şiddeti (bioluminescence [sayar/s]) ölçümü her 10 min gerçekleştirildi orta ve yapay deniz su orta. (C) göreli ışık yoğunluklarda (RLU/OD) E. coli (sol paneli) ve P. mandapamensis 27561 (doğru kapı aynası) ifade lux operon bioluminescence hücre yoğunluğu için normalleştirme tarafından belirlenir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2.jpg"> Şekil 6 : Büyüme eğrilerinin karşılaştırılması ve E. coli ışık şiddetlerde göre lux gen ekspresyonu 24 h için OD, 650 nm ve sayıları saniyedeki bioluminescence şiddeti her 10 min 24 h 28 ° C'de üzerinden ölçülen Tüm ölçümler ile dört teknik çoğaltır her üç biyolojik çoğaltır ortalama değerleridir. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Ayrıca, nerede bioluminescence hücre yoğunluğu tarafından normalleştirilmiş göreli ışık yoğunluklarda (RLU/OD) temsil edilir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2.jpg"> Şekil 7 : Potansiyel çekirdek yönetmelik algılama değerlendirmek için karşılaştırma kollarındaki bakteri. Işık emisyon ve hücre yoğunluğu her 10 min 10 h için ölçülür ve dört teknik çoğaltır her ile üç biyolojik çoğaltır Ortalama değerlerini temsil eder. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Photobacterium mandapamensis TH1 ölçümleri (siyah kareler), Vibrio harveyi 14126 (gri daireler) ve Photobacterium mandapamensis S1 (gri elmaslar) karşılaştırıldığında birbirine; (A) tasvir optik yoğunluğuna (OD) 650 nm, (B) ışık yoğunluğu (bioluminescence [sayar/s]) ve (C) göreli ışık yoğunluklarda (RLU/OD). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig8.jpg"> Şekil 8 : Bioluminescence sıvı medya ve ağar kaplamalar. (A) 5 L şişe 2 L LB orta ile aşılanmış ışığında fotoğrafı pET28a lux operon plazmid ifade E. coli BL21 hücreleri ile. (B) karanlıkta fotoğrafı aynı Kültür (A) olduğu gibi. Fotoğraf A ve B yaklaşık 2 h ifade indüksiyon sonra çekildi. (C) yapay deniz suyu orta agar plaka karanlıkta fotoğraflandı P. mandapamensis S1 çizgili kültürü ile. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57881/57881fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria at JoVE.com

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Kollarındaki bakteri gibi çekirdek algılama mekanizmaları, çeşitli aracılığıyla ışık üretim düzenler. Bu roman yöntemi bioluminescence in situ incelenmesi ve hücre yoğunluğu için ışık emisyon korelasyon sağlar. Bir yapay kollarındaki Escherichia coli sistemi sağlar lux operons, Lux proteinler ve onların Interplay karakterizasyonu.

Situ Ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

in-situ-measurement-correlation-cell-density-light-emission

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

11.5K Görüntüleme.  Graz University of Technology. Kollarındaki bakteri gibi çekirdek algılama mekanizmaları, çeşitli aracılığıyla ışık üretim düzenler. Bu roman yöntemi bioluminescence in situ incelenmesi ve hücre yoğunluğu için ışık emisyon korelasyon sağlar. Bir yapay kollarındaki Escherichia coli sistemi sağlar lux operons, Lux proteinler ve onların Interplay karakterizasyonu.

Video: In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Genetik

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Biyoloji

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Sirkadiyen Ritim Çalışmaları için İnsan Bağırsak Enteroidlerinin Optimize Edilmesi

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Yazar Spotlight: Çok Hücreli Sistemlerde Sirkadiyen Ritimlerin İn Vitro Araştırmaları

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

Situ Ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler 'Bioluminescent' Muhabir Faj

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi