Yazar Ulusal son finansmanı için Sağlık Enstitüleri ve teşekkür Michael R. Green oligonucleotides sentezleme için.

Not: Resim 1 phosphorothioate mutagenesis genel bir bakış sağlar ve işleminin temel adımları özetlemektedir.
1. nesil bir kütüphane mutantların — DNA şablon vahşi türü nükleotit ile Doping
<ol><li>T7 astar sentez (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından.</li>
	<li>Katkılı oligonükleotid (iplikçik) protein bağlayıcı siteye karşılık gelen bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından sentez. Phosphoramidites uygun bir karışımı olarak vahşi türü nükleotit (bkz: Bu oran daha fazla ayrıntı için temsilcisi sonuçları) doping (X aşağıdaki) her site vahşi tipi nükleotid olarak % 90'a ve T % 10 oranında için kimyasal sentez sırasında kullanın. Not: Katkılı oligonükleotid dizisi 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 burada '. Altı çizili sıra SXL protein bağlayıcı sitesi, artı faydalı kontroller RNA her değişiklik için yükleme kontrolleri olmasının yanı sıra bağlayıcı etkiler onaylayan sağlamak ek nükleotit bağlama sitesi dışında ters tamamlayıcıdır Karşılaştırma ve normalleştirme nükleotit bağlama site içinde. SXL-bağlama sitesi sıra trafo pre-mRNA14,15,16,17' mevcut olan UUUUUGUUGUUUUUUUU, önerilen metodoloji hazırlamak için kullanıldı. İtalik sırayla T7 astar dizisine tamamlayıcı ve vitro transkripsiyon T7 organizatörü.</li>
</ol>2. RNA sentezi
<ol><li>
Yukarıda açıklanan18olarak 20 µL transkripsiyon tepki RNA sentez.
	<ol>
<li>Mix T7 transkripsiyon tampon ve 1 µM T7 oligonükleotid, 1 µM katkılı oligonükleotid, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM ATP, CTP ve UTP (guanozin, adenozin, sitidin ve üridin trifosfat) ve 2 U/µL T7 RNA polimeraz.</li>
		<li>Ekleme, iki ayrı microcentrifuge tüplerde 0,167 mM α-thio ATP veya 0.05 mM α-thio UTP (bkz: Şekil 2' deki şemaları) phosphorothioates RNA'ların dahil etmek. Not: alternatif iletişim kuralları için 0.2 mM α-thio CTP veya 0.2 mM α-thio GTP nükleotit oyuncu değişikliği kalan iki test etmek için bir katkılı oligonükleotid içeren uygun transkripsiyon reaksiyon ekleyin.</li>
		<li>RNA sentezi tepki karışımı 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.5 µL ısı değişken alkalen fosfataz ve 2.5 µL 10xphosphatase tampon RNA örnek ekleyin. Bu 25 µL reaksiyon 10 – 30 dk 37 ° C'de 5' fosfatlar kaldırmak için kuluçkaya.</li>
	<li>Alkalen fosfataz enzim Isıtma için 2-5 dk 80 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>5' ucuna dephosphorylated RNA'ın radiolabel (5 pmole) 1 µL T4 polinükleotit kinaz ve 1 µL γ -32P ATP 10 µL tepki birimindeki kullanarak. Reaksiyon karıştırmak için 30-60 dk 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>T4 polinükleotit kinaz enzim Isıtma için 20-30 dk 65 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>Jel Elektroforez % 10 polyacrylamide jel denaturing tarafından RNA arındırmak. RNA üzerinde jel autoradiography tarafından bulun. Radiolabeled RNA içeren jel dilim tüketim, pipet ucu ile duvarlara basarak microcentrifuge tüpte ezmek ve İndinavir K (PK) arabellek (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, % 1 Sodyum Lauryl Sülfat) emmek. Gece için 2 h oda sıcaklığında tüp döndürün.</li>
	<li>Jel Bulamaç santrifüj kapasitesi, jel atmak ve arabellek çözüm toplamak.</li>
	<li>Fenol kloroform eşit hacmi ile iki kez ve bir kez kloroform ile çözüm ayıklamak ve sulu faz toplamak.</li>
	<li>Sodyum asetat, pH 5.2, taşıyıcı 3 M sulu faz 0.1 birim eklemek tRNA veya glikojen ve etanol 2.5 hacmi. Örnek 1 h için-80 ° C'de tutun.</li>
	<li>Örnek için bir yüksek hızlı microcentrifuge 16,873 x g, 5-10 dk santrifüj kapasitesi. Arabellek/etanol çözüm RNA Pelet bozmadan dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Pelet % 70 etanol ile yıkama ve 2-5 dk. Kaldır etanol için dikkatle santrifüj kapasitesi. Pelet hava kuru.</li>
	<li>Pelet 20 – 50 µL dietil pyrocarbonate (DEPC) resuspend-tedavi su. -20 ° C'de kullanmak kadar saklamak. Not: radyoaktivite korumak için uygun önlemleri ve Pleksiglas kalkan kullanarak radiolabeled RNA ile tüm adımları gerçekleştirin. Halen, spin sütunları jel arıtma RNA'ın alternatif olarak adi radyoaktivite, daha yaygın olarak kullanılan ve kaldırmak daha kolay olur.</li>
</ol>3. protein bağlayıcı tepki ve bağımlı RNA ayrılması
<ol><li>Rekombinant protein hızlı ve E. coliarındırmak.</li>
	<li>Rekombinant protein konsantrasyonu spectrophotometry veya bir SDS-polyacrylamide jel bir bilinen protein standart, Sığır serum albumin (BSA) yanındaki ayıran tahmin ediyoruz. Faiz ve standart BSA proteini jel Coomassie parlak mavi R-250 ile boyama tarafından görselleştirin. İle karşılaştırıldığında BSA dilutions aynı jel üzerinde bilinen miktarda protein quantitate. Not: 0.2 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), % 0.05, - 80 ° C kadar kullanım ve 20 mm 4-(2-Hydroxyethyl) seyreltik piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES), pH 8.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), Rekombinant protein depolamak NP-40, % 20 gliserol. Kullanım 0.5-1.0 mM proteaz inhibitörü phenylmethane Sülfanil florür (PMSF) isteğe bağlı.</li>
	<li>RNA-bağlama tepki (20-100 µL) 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 olarak gerçekleştirmek, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 birim/µL RNase inhibitörü, 0.09 µg/µL acetylated Sığır serum albümin, 1 mM EDTA, 0.15 µg/µL tRNA, 5'-son radiolabeled RNA ve uygun konsantrasyon (bir 6 µL konsantrasyon RNA'ın % ~ 50 protein bağlar) protein. Not: Bu bağlayıcı arabelleğe üç RNA – proteinler için çalışır (SXL, U2AF65ve PTB), faiz bir protein için standart olacak ama. Protein konsantrasyonu ampirik olarak, yaklaşık 50 %'si almak için gereken bir verilen protein hazırlık için çeşitli dilutions kullanarak tahmin RNA bağlama. Bu koşul veya Kd RNA-bağlama eğrisi en hassas bölümünü temsil eder.</li>
	<li>20-30 dk 25 ° c (veya buz) protein bağlayıcı tepki kuluçkaya.</li>
	<li>
Protein bağımlı RNA kesir iki yaklaşımdan birini kullanarak ilişkisiz kesir ayırmak:
	<ol>
<li>Nitroselüloz filtre bağlama<ol>
<li>Bağlama reaksiyon (20-100 µL) Oda sıcaklığında bir vakum manifold bağlı nitroselüloz filtre uygula. Not: Sadece RNA-protein kompleksi üzerinde filtre korunur ve RNA akar filtreden ilişkisiz. Filtre bağlama yaklaşım bağımlı RNA'ın yüksek kurtarma sağlar ve jel hareketlilik üst karakter tahlil için daha hızlı ve daha basit, karşılaştırılır. DEAE membran altında nitroselüloz filtre yerleştirerek ilişkisiz RNA kesir toplamak veya ilişkili kesir ile karşılaştırma için RNA ücretsiz mümkündür.</li>
			<li>Tutulan içeren nitroselüloz filtre bölümünü kesip radyoaktif RNA küçük parçalara microcentrifuge tüp içine sığacak şekilde filtre parçaları sokmak için yeterli PK arabellekte (300-500 µL içeren 10-20 µg PK) emmek ve RNA filtresinden elute 2-3 saat veya gece boyunca için.</li>
			<li>Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, yıkama, Kuru ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jel hareketlilik üst karakter<ol>
<li>Hazırlamak ve % 5 yerli polyacrylamide jel polimerize (60:1 Acrylamide:bis-akrilamid) 0.5 içinde filtre bağlama yöntemi alternatif olarak bağlama tepki başlamadan önce x TBE (Standart Tris-bor-EDTA arabellek).</li>
			<li>15dk için jel 250 V (4 ° C) soğuk bir odada önceden çalıştırın.</li>
			<li>Her bağlama reaksiyon (üstte) Yukarıdaki ön çalışma jel ayrı kuyu yükleyin. Not: Örnek yükleme kuyu içine için yeterli gliserol protein depolama arabellek sağlar.</li>
			<li>Jel Elektroforez belirli protein ve RNA boyutu bağlı olarak 1-2 h için 250 V soğuk bir odada tarafından protein bağımlı RNA ayırın.</li>
			<li>Autoradiography tarafından RNA-protein kompleksi jel üzerinde konumunu bulun. RNA-protein kompleksi içeren jel dilim tüketim. Jel dilim kırma ve PK arabellekte nemlendirici jel dilim üzerinden RNA elute.</li>
			<li>Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, hava kuru, yıkama ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analiz Mutant nükleotit pozisyonlar algılanması için iyot i ciddi Phosphorothioate ürünlerin
<ol><li>1 mM iyot bir 20 µL DEPC tedavi su ilâ 10 µg taşıyıcı içeren eklemek tRNA phosphorothioate birleşme yerlerinde (ilişkili ve toplam RNA'ların) RNA'ların ayırmak için. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: Daha fazla iyot bölünme biraz farklı koşulları ile ilgili ayrıntılar — %7 (v/v) iodoethanol, 95 ° c 3 dk Isıtma — Gish & Eckstein 198819' bulunabilir.</li>
	<li>İ ciddi RNA sodyum asetat/etanol, ekleyerek yukarıda açıklandığı gibi çökelti. Jelleri denaturing için bir yükleme boya resuspend. Isı ve örnek tarafından % 15-20 denaturing polyacrylamide jel elektroforez RNA parçaları ayırmak için yük.</li>
	<li>Polyacrylamide jel bir röntgen filmi için maruz.</li>
	<li>Grup autoradiography kullanma toplam havuz ile ilişkili kesir tespit edebilir. Not: bir yormak kukuleta iyot ile tüm adımları gerçekleştirin. Burada gösterilen RNA ayrılması için bir kama şeklindeki jel, istihdam hangi tarafından iki katına her iki çubukları alt jel plakaların kalınlığı jel alt kısmında bir ekstra inç uzunluğundaki spacer ekleyerek elde edilir. Bu şekli daha kısa RNA parçaları arasında daha fazla tek tip veya daha yakın aralığını sağlar. Alternatif olarak, bir phosphorimager algılama ve radyoaktivite Nefelometri için röntgen filmleri yerine kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects.">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li><li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila.">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li><li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+germ+cells+choose+their+sex?+Drosophila+as+a+paradigm.">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li><li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary.">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li><li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline.">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li><li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins.">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520 (2007).</li><li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo.">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li><li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology.">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li><li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila.">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li><li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells:+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination.">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li><li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B.">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary.">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis.">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal.">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li><li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection.">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li><li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA.">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li><li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry.">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li></ol>

Yazar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirir.

Mutagenesis uzun protein bağlayıcı siteleri niteleyen kullanılmaya başlanmıştır. İlk olarak, mutantlar bir dizi inşa ve deneyleri benzeşme bağlama üzerinde onların etkilerini incelemek için bağlama içinde tek tek test. Ise standart mutagenesis yaklaşım çeşitli serileri analiz etmek için bir yol sağlar, birden çok adımı mutantlar oluşturmak ve tepkiler her mutant için bağlayıcı bir dizi performans gibi standart yaklaşım, dahil, zahmetli ve zaman alıcı ve olmayabilir özellikle uzun seril...

Gen düzenlemesi, biyolojide önemli bir rol oynar. Genlerin transkripsiyon, pre-mRNA'ın porno versiyonunu, 3' uç oluşumu, RNA verme, çeviri, mRNA yerelleştirme, çürüme, translasyonel modifikasyon/istikrar, vb her iki DNA ve RNA bağlayıcı proteinler gen anahtar rol oynarlar düzeyinde düzenlenmiş olması Yönetmelik. Moleküler Genetik analizlerle çok sayıda düzenleyici proteinler belirledik iken, yalnızca küçük bir alt kümesini ile karakterize tamamen hücresel işlevlerinin veya bağlama siteleri içinde vivoiçin. Filogenetik dizi analizi ve mutagenesis DNA veya RNA protein etkileşimleri niteleyen tamamlayıcı yaklaşımlar sunuyor.
RNA bağlanıcı proteinler cinsel farklılaşma da dahil olmak üzere gelişim süreçlerinde önemli. Drosophila protein seks-öldürücü (SXL) veya ana seks-anahtar protein yoktur erkek, ama şimdiki içinde dişi. Uridine zengini diziler veya pirimidin-yolları aşağı akım pre-mRNA hedefler (trafo, seks öldürücüve erkek özgü lethal2) somatik hücreler1,2'deki belirli splice sitelere bitişik tanır ,3,4. Buna ek olarak, uridine zengini Poliadenilasyon artırıcı dizileri artırıcı, ilkel (e(r)) transkript5,6bağlama yaparak geçiş Poliadenilasyon sitesi düzenler. SXL büyük olasılıkla olmak üzere kalan kadın germline ek hedefleri düzenleyen1,7,8,9,10,11, tespit 12 , 13.
Genellikle, bir bağlama sitesini karakterizasyonu mutagenesis, örneğin, silme veya değiştirme tek veya birden çok nükleotit tarafından içerir. Her mutant bağlama siteye göre yaban tipi RNA dizisinin sonra onun bağlama benzeşme belirlemek için bir dizi protein konsantrasyonları kullanılarak analiz (Kd veya denge ayrılma Sabit) protein ilgi; Kd protein konsantrasyonu % 50 RNA bağlama almak için gerekli olduğunu. Detaylı mutagenesis Bu emek yoğun işlem üretimi ve çok sayıda mutantlar analizini içerir — üç vahşi türü nükleotit bağlama sitedeki her pozisyon için. Böylece, daha basit ve ucuz doygunluk mutagenesis protein bağlayıcı sitelerin RNA için alternatif bir yaklaşım için bir ihtiyaç vardır.
Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore&#160;25&#160;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dephosphorlyation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates

Gen düzenlemesi gelişiminde önemli bir rol oynar. Çok sayıda DNA ve RNA bağlayıcı proteinler onların hedef sıraları gen ekspresyonu denetlemek için yüksek özgüllük ile bağlayın. Bu düzenleyici proteinler gen ekspresyonu ya DNA (transkripsiyon) düzeyinde veya RNA (pre-mRNA'ın porno versiyonunu, Poliadenilasyon, mRNA taşıma, çürüme ve çeviri) düzeyini kontrol eder. Düzenleyici diziler tanımlaması sadece açık veya kapalı bir gen nasıl açık, ama hangi aşağı akım genler tarafından belirli bir düzenleyici protein Ayrıca düzenlenir anlamanıza yardımcı olur. Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

Doping kullanarak doygunluk mutagenesis prensibi:
Eğer sadece analiz edilecek bir konumdur bir uygun molar oranı vahşi-türü ve diğer nükleotit için tüm dört nükleotit eşit bir karışımı kullanın. Ancak, aynı anda birden fazla pozisyonları incelenir, oranı, non-vahşi türü yaban tipi nükleotit için ayarlanması gerekir, azaltılmış yani . Aksi takdirde, hangi isteniyorsa, tek oyuncu değişikliği e...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates at JoVE.com

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

a-novel-saturation-mutagenesis-approach-single-step-characterization

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

6.5K Görüntüleme.  University of Colorado at Boulder. Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Video: A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler