Name: single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry at JoVE.com

Aimee Pugh-Bernard onun fikri girdi ve yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Boettcher Vakfı Webb Waring Biyomedikal Araştırma Ödülü ve Ödülü K23-1K23AR070897 arasında sayı NIH Elena W.Y. Hsieh tarafından desteklenmiştir. O da ödül sayısı çocuk sağlığı ve insan gelişimi ve Lucile Packard Vakfı tarafından K12-HD000850 Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı, Stanford CTSA UL1 TR001085 ve çocuk sağlığı araştırma için destekli yapıldı. Enstitüsü Stanford Üniversitesi.

Tüm yöntem tanımlamak burada Colorado birden çok kurumsal İnceleme Kurulu (COMIRB tarafından), Colorado Üniversitesi onaylanmış olması. Aşağıdaki tüm açıklanan yordamlar steril doku kültürü mahallede, filtre uygulanmış pipet ipuçları ile belirtilmedikten gerçekleştirilmesi gereken ve tüm reaktifler filtre.
1. hazırlanması reaktifler periferik tam kan işleme için
<ol><li>Ruxolitinib hisse senedi aliquots (10-15 kişilik μL/flakon) 10 mM üretici yönergelerine (mağaza-80 ° c) göre DMSO içinde reaktif lyophilized sulandrarak hazırlayın. DMSO konsantrasyonu % 0,2 (vol/vol) aşağıda unstimulated denetimleri de dahil olmak üzere tüm deneyleri unutmayın.</li>
	<li>R848 hazırlamak (resiquimod) stok aliquots (10-15 kişilik μL/flakon) 1 μg/μL steril su lyophilized reaktif sulandrarak tarafından üretici yönergelerine başına. Mağaza-80 ° C'de</li>
	<li>Lipopolysaccharide (LPS) hisse senedi aliquots (sadece bir süre için şişe başına 5 μL) 1 μg/μL, steril su üretici talimatları uyarınca lyophilized reaktif sulandrarak hazırlayın. Mağaza-80 ° C'de</li>
	<li>PBS, % 0.5 BSA ve %0.02 NaN3kullanarak hücre boyama medya (CSM) hazırlayın.</li>
	<li>Alacak ve protein taşıma inhibitörü (PTI) kokteyl (Tablo reçetesi) hazır tutun.</li>
	<li>Çözülme ve ruxolitinib hisse senedi flakon (10 mM) 1: 10'steril PBS (1 mM) oranında seyreltin. Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.</li>
	<li>Çözülme ve R848 hisse senedi flakon (1 μg/µL) 1:10 steril PBS seyreltik (0,1 μg/µL). Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.</li>
	<li>Çözülme ve LPS hisse senedi flakon (1 μg/µL) 1: 100 steril PBS içinde seyreltik (0.01 μg/µL). Doku kültürü başlıklı oda sıcaklığında bir kenara koyun.</li>
	<li>Steril RPMI (yok L-glutamin) bir standart 37 ° C su banyosu (için en az 10 dk) önceden ısıtmak.</li>
	<li>1:5 filtre uygulanmış GKD2O (çalışma konsantrasyonu) (steril olması gerekmez) benchtop tarafından lyse/düzeltme arabellek sulandırmak. Not: tam kan 1 mL 20 mL çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabellek gerektirir.<ol>
<li>Parçalayıcı/düzeltme arabellek tam kan her (en az 100 mL), 1 ml 5 koşulları için yapmak. Lyse/düzeltme arabellek çalışma konsantrasyonu tam kan (keep lyse/düzeltme çözüm gerekinceye kadar 37 ° C'de) mililitre başına 50 mL konik tüpler içine aliquot 20 mL. Aşağıdaki gibi koşullar/düzeltme arabellek içeren konik tüpler koşullara etiket: T0 (zaman sıfır), T6 + 5R (zaman 5 ile 6 h uM ruxolitinib), T6 + R848 (zaman 6 h ile 1 μg/mL R848), T6 + LPS (zamanla 6 h 0,1 μg/mL LPS), T6 (6 h zaman).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiket yuvarlak kapaklar ile alt steril polistren tüpler ve 1 mL microcentrifuge tüpleri ile adım 1,10 olduğu gibi aynı adlandırma.</li>
</ol>2. stimülasyon ve periferik tam kan (Şekil 1) işlenmesi
<ol><li>Etiketli alt polistren tüpler adım 1,11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) bir raf üzerinde yuvarlak yerleştirin. Not: Aşağıdaki adımların tümünü Aksi belirtilmediği sürece bu tür tüp içinde gerçekleştirilir. Tüpler doku kültürü hood ve kısırlık korumak için inkübatör transfer ederken kap.</li>
	<li>37 ° C RPMI (yok L-glutamin) 1 mL tüpler (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) için ekleyin. Kan toplama tüp birkaç kez ters çevir, her tüpün tam kan 1 mL ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kez RPMI ile iyice karıştırın (RPMI ile seyreltme engeller kanı 6 h kuluçka döneminde topaklanma).</li>
	<li>1:10 10 μL eklemek ruxolitinib T6 + 5R. P1000 pipet ile iyice karıştırın. 37 ° C'de kuluçka tüpler rafa yerleştirin ve kuluçka zamanlama başlar (T = 0).</li>
	<li>T0 örnek aşağıdaki gibi işlem.<ol>
<li>T0 tüp tüm içeriğini 37 ° C çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabelleği 20 mL içeren etiketli bir konik tüp pipette. Hücre kurtarma en iyi duruma getirmek için çalışma konsantrasyonu parçalayıcı/düzeltme arabellek ile tüp durulayın. Konik tüp ters çevirme karıştırın.</li>
		<li>Lizis ve fiksasyon için izin vermek 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Fiksasyon, benchtop, tüm sonraki adımları uygulayın. 500 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak. Buz soğuk PBS Pelet kadar kırmak için 1 mL hücrelerde resuspend sonra konik bir 15 mL birime PBS ile doldurun.</li>
		<li>500 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant dikkatle boşaltmak. Granül kırmızı PBS yıkama (adımları 2.4.3–2.4.4) işlemini yineleyin. CSM Pelet kadar kırmak, sonra antikor boyama için etiketli microcentrifuge tüp (adım 1.11) aktarmak için 1 mL hücrelerde resuspend. Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 µL örnek almak. Not: tüm hücreleri bu noktada sabitlenir beri bu canlılığı leke eklemek gerekli değildir.</li>
		<li>500 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. Pelet rezidüel hacim ~ 60 µL içinde bırakarak süpernatant, Aspire edin. Diğer koşullar örnekleri işlem tamamlanıncaya kadar bu pelet buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 dk, T = tüp raf (adım 2.3) doku kültürü hood taşımak ve aşağıdakileri gerçekleştirmek.<ol>
<li>0,1 μg/μL 10 μL eklemek R848 T6 + R848. P1000 pipet ile iyice karıştırın.</li>
		<li>0,01 μg/μL LPS 10 μL T6 + LPS ekleyin. P1000 pipet ile iyice karıştırın.</li>
		<li>Protein taşıma inhibitörü (500 X hisse senedi) 4 μL eklemek T6, T6 + 5R ve T6 + LPS (ama değil T6 + R848) ve örnekleri için kuluçka T kadar dönmek 6 h. Mix P1000 pipet her 2 h ile iyice =. Not: R848 bir endoplasmic TLR agonist ve bu nedenle onun hedef reseptör erişimi için izin vermek için protein taşıma inhibitörü eklenmesi geçici gecikmeden gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 h, T = 4 μL protein taşıma inhibitörü kokteyl (500 X hisse senedi) eklemek T6 + R848 tüp. Tüm örneklerini P1000 pipet ile karıştırın ve raf için kuluçka T kadar dönmek 6 h =.</li>
	<li>Örnekleri ile bir P1000 t bir kez daha karıştırın 4 h =.</li>
	<li>T = 6 h, proses T6, T6 + LPS, T6 + R848 ve T6 + 5R kan örnek tüpler açıklandığı gibi adım 2.4 T0 örnek için.</li>
	<li>Hücre topakları kalan CSM birim gelecekteki bir tarihte işlemeye-80 ° C'de depolayın. Alternatif olarak, barkod ve antikor depolamadan boyama devam edin.</li>
</ol>3. kan hücrelerinin Lysed/Sabit barkod
<ol><li>Buz üzerinde yavaş yavaş-80 ° C depodan lysed/sabit hücre örnekleri çözme; en fazla 20 örnekleri ile benzersiz barkod etiketli ve bu sistemi kullanarak havuza alınmış. 1:10 PBS ile 10 X barcoding perma arabellek seyreltik; ~ 3 mL örnek başına için yeterli arabellek olun.</li>
	<li>Bir non-steril yalak CSM ve 1 X barcoding perma arabellek ile doldurun. Buz 1 mL ekleyin taze çözülmüş örnekleri, soğuk CSM bir pipet ile iyice karıştırın ve transfer için ilgili önceden etiketli Polipropilen küme tüpler.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 μL örnek almak. 1,5-2 katı örnek her küme tüp başına 106 hücre hücre sayısı normale: kaldırmak ve 2 x 106 hücre yukarıda aşırı hücre hacmi atın.</li>
	<li>600 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi. 1 X barcoding perma arabelleği bir çok kanallı pipet ve oda sıcaklığında 5 min için 600 x g, santrifüj ile 1 mL hücrelerde resuspend. Süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Küme tüpler aynı sırada bir raf üzerinde barkod anahtar örnek onun barkod ile eşleşecek şekilde gösterildiği gibi hizalayın. Barkodlama perma arabellek X 800 μL 1, hücre kaybı azaltmak pipet uçları-(asla karıştırma) ile hücre Pelet dokunmadan küme tüpler tüm örnekleri tarafından çok kanallı pipet ekleyin. Raf kümesi tüp ile bir kenara.</li>
	<li>-20 ° C ve çözülme oda sıcaklığında 20-plex Pd barkodlama Kit tüp şeritler kaldırın. 1 X barcoding perma arabelleği 100 μL eklemek, iyice karıştırın ve karşılık gelen hücre örnekleri küme tüpler içine resuspended barkod karışımı 120 μL transfer.</li>
	<li>Böylece hiçbir çapraz bulaşma ayrı ayrı barkodlu örnekleri arasında çok kanallı pipet tarafından iyice karıştırın. Küme tüpler hücreleri etiketlemek barkodlar izin vermek için oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin, sonra 1 mL CSM resuspend.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi ve CSM içinde tekrar adım 3.8 olduğu gibi resuspend. Not: Her örnek şimdi benzersiz bir barkod ile etiketlenir ve örnekleri havuza alınmış hazır.</li>
	<li>600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Tek bir pipet ve aynı ucu kullanarak, tüm hücre topakları ~ 70 – 80 aktarım μL kalan birime bir polistren tüp. Değil pipet ucu dışarı atmak; Bu uç ile tek pipet kenara.</li>
	<li>Bir çok kanallı pipet ve yeni ipuçları, ~ 100 μL CSM hücre kurtarma en üst düzeye çıkarmak için her özgün küme tüp ekleyin. Bir kenara koyun ucu tek pipet ile aynı polistren tüp ~ 100 μL artık birimdeki tüm hücre topakları aktarın.</li>
	<li>CSM polistren tüp (~ 3 mL) kapalı dön ekleyin. Sayısı ve kayıt havuza alınan barkod hücre sayısını ayarlayın. 600 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Aynı gün barkodlu örnekleri boyama için devam edin. Not: ~ 20-%30 hücre iletişim kesilecek barkodlama sürecinde normaldir.</li>
</ol>4. boyama barkodlu Lysed/kan hücreleri ve analiz için hazırlık kitle sitometresi araç üzerinde sabit
Not: antikor boyama her 1 X titresi (antikor 100 başına 1 μL tepki boyama μL), genellikle 3-4 x 106 hücre leke olabilir. Ne zaman tüm barkodlu örnekleri bir tüpün içine birikmiş, bu nedenle, antikor miktarı ölçekli olmalıdır. 20 barkodlu örnekleri tutarı 30 x 106 hücreler ve her 1 X titresi için 3-4 x 106 hücre leke olabilir, barkodlu örnek, ancak bir antikor (başına 1 X 20 X miktarda gerektiren tek tek, her örnek boyama aksine bir 10 X titresi, gereksinimi bireysel tüp). Cep numarası için antikor konsantrasyonu (burada tartışılan değil) her bireysel antikor için kokteyl dikkatle titre.
<ol><li>Antikorlar (Tablo reçetesi) kullanarak hücre yüzey boyama ve sitokin indüksiyon için leke.<ol>
<li>Yüzey boyama kokteyl tutarın eklendi ve muhasebe için pipetting hata olmasını hesaplayarak yapmak (yani, 2 x 106 hücre her örneğinde, 20 barkodlu örnekleri boyama 10 X titresi leke ise gerekli son hacim hesaplamaları için; Pipetting hata için bir 10,5 X son çözüm boyama yaparak telafi etmek).</li>
		<li>10 X barkodlu hücre Pelet birime boyama yüzey ekleyin. Aynı ucu hücre kaybı azaltmak için mix ve yüzey lekeleri ve hücre Pelet sesini ölçmek.</li>
		<li>Hücrelerin ve kokteyl boyama birimde dayanarak, CSM sayısına göre hücre örnekleri (el 20 örnekleri, X 20 = 1 mL 50 μL çalışsayani) 50 μL son boyama hacmi ekleyin. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Örnek her 15 dk bile boyama tanıtmak için tahrik.</li>
		<li>Yüzey leke kuluçka sırasında O. Prepare birimleri için permeabilization 2 mL ve 5 mL yıkama sulandrarak 1:10 süzülmüş GKD2perma/yıkama arabellek (Tablo reçetesi) hazır olun. 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.</li>
		<li>CSM ile tüp boyama yüzey kapalı üst ve vasıl 600 x g 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj süpernatant Aspire edin. Barkodlu örnek 4 ° C, 1:10 2 mL resuspend seyreltme perma/yıkama arabellek. 20-30 dk tam hücreleri permeabilize 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.</li>
		<li>Hücre içi boyama için (gelince yüzey boyama) benzer boyama adımları izleyin. Ancak, 4 ° C, 1:10 kullanın seyreltme perma/yıkama arabellek CSM cilt hücreleri, hücre içi boyama boyunca permeabilizing bir ortamda kadın boyama toplam yapmak yerine.</li>
		<li>Hücre içi antikor yüzeye kokteyl lekeli ve hücre Pelet (adımları 4.1.2–4.1.17) permeabilized ekleyin. Hücre örnekleri sayısı başına 50 μL birime boyama toplam getir. 4 ° C'de 60 dk için kuluçkaya Örnek her 15 dk bile boyama emin olmak için tahrik.</li>
		<li>Hücre içi boyama sırasında hazırlamak enterkalatörün çözüm: filtre uygulanmış PBS + filtre uygulanmış %16 100 μL 900 μL PFA (son konsantrasyonu % 1.6 PFA) + 0.2 μL 500 enterkalatörün boya (Tablo malzemeler), uM.</li>
		<li>Kapalı hücre Pelet + hücre içi antikor soğuk 1:10 ile kokteyl perma/yıkama arabellek üst.</li>
		<li>600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. CSM ile boyama tüp kapalı üst. Saymak ve telefon numarası kaydedebilirsiniz. 600 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. 1 mL enterkalatörün çözeltisi adım 4,9 hücrelerde resuspend. Tam enterkalasyon için oda sıcaklığında en az 20 dk için kuluçkaya, veya bir gece 4 ° c (enterkalatörün çözüm örnekleri 4 ° C'de onları kitle sitometresi araç üzerinde çalıştırmadan önce 1 hafta kalabilir).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri toplu sitometresi enstrüman için hazırlayın.<ol>
<li>«Ana sayfa» kapalı süzülmüş GKD2O 3 mL ve 4 ° C'de 5 min için 600 x g, santrifüj tüpü Filtre uygulanmış GKD2O. geçmek 3 mL hücrelerde bu süspansiyon herhangi bir enkaz veya potansiyel olarak kitle sitometresi enstrüman yapışmasına neden toplamları kaldırmak için 100 mikron filtre resuspend.</li>
		<li>Say ve hücre sayı sonrası filtrasyon kaydetmek. 4 ° C'de 5 min için 600 x g, santrifüj</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:10 süzülmüş GKD2O. sulandrarak kalibrasyon boncuk çözüm (Tablo reçetesi) hazırlamak</li>
	<li>Lekeli resuspend 1:10 gerekli cilt hücrelerinde hücre konsantrasyonu 106 hücre/mL x 1 ~ ulaşmak için kalibrasyon boncuk çözüm seyreltilmiş. Not: 45 µL/min bir CyTOF1 için önerilen optimum 5 x 105 hücre/mL olduğunu; 30 µL/dk, 7.5 x 105 hücre/mL Helios için.</li>
	<li>Kitle sitometresi enstrüman9tarihinde örneği çalıştırmak için devam edin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Walsh, S. J., Rau, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+diseases:+a+leading+cause+of+death+among+young+and+middle-aged+women+in+the+United+States.">Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States.</a> American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).</li><li>Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+trend+of+survival+and+damage+of+systemic+lupus+erythematosus:+meta-analysis+and+meta-regression+of+observational+studies+from+the+1950s+to+2000s.">Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s.</a> Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).</li><li>Kaul, A., Gordon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).</li><li>Annunziato, F., Romagnani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+effector+CD4++T+cells.">Heterogeneity of human effector CD4+ T cells.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 11 (6), 257 (2009).</li><li>Peck, A., Mellins, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+T-cell+phenotype+and+function:+the+T+helper+type+17+example.">Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example.</a> Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).</li><li>Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+stories+on+Th17+cells.">More stories on Th17 cells.</a> Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).</li><li>Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry.">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).</li><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Mass+Cytometry+of+Differential+Immune+and+Drug+Responses+Across+a+Human+Hematopoietic+Continuum.">Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.</a> Science. 332 (6030), 687-696 (2011).</li><li>Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometry:+Technique+for+Real+Time+Single+Cell+Multitarget+Immunoassay+Based+on+Inductively+Coupled+Plasma+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry.">Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).</li><li>Rahman, A., Isenberg, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).</li><li>O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems-level+analysis+of+human+Toll-like+receptor+activation+defines+a+chemokine+signature+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).</li><li>O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+identifies+a+distinct+monocyte+cytokine+signature+shared+by+clinically+heterogeneous+pediatric+SLE+patients.">Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients.</a> Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).</li><li>Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).</li><li>Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations.">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li><li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li><li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation.">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li><li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li><li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference.">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada biz bir roman, tek hücreli, proteomik yaklaşım aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli "patojenik" periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak açıklar. Bu yöntemi periferik tam kan analitik araç ve toplu sitometresi bağışıklık hücresel fenotipik ve fonksiyonel anormallikler değerlendirilmesi için araç olarak kullanır. Yöntem insan ve fare çalışmaları21' e ko...

Otoimmün hastalıklar morbidite ve mortalite nüfusun % 3-8 etkileyen önemli bir nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri'nde önde gelen genç ve orta yaşlı kadınlarda ölüm nedenleri otoimmün hastalıklar arasındadır (Yaş < 65 yaş)1,2. Otoimmün hastalıklar türdeş olmayan klinik sunum ve çeşitli temel immünolojik süreçleri ile karakterizedir. Heterojenite yelpazesi de romatoid artrit (RA) eklem tutulumu ve nörolojik hastalığı multipl skleroz (MS) gibi farklı bozuklukları arasında temsil edilir. Ancak, bu düzeyde heterojen da sistemik lupus eritematozus (SLE) gibi tek bir bozukluğu içinde örneklenir: Diğer hematolojik veya eklem tutulumu3acı çekerken bazı hastalar böbrek patolojisi ile takdim edebilir miyim.
Otoimmün hastalıklar temel immunopathogenesis auto - ve hiper-harekete geçirmek-in birden fazla doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri ve eşlik eden dysregulated sitokin üretim ile ilgili klinik heterojenite yansıtır. Sitokinler otoimmün hastalık patogenezinde önemli rol oynarken, hastalığın mekanizması içindeki belirli rolü anlamak zor olduğu ispatlanmıştır. Sitokinler tarafından Pleiotropi ile karakterize (bir sitokin farklı hücre tipleri üzerinde birden fazla etkileri olabilir), (birden çok sitokinler aynı etkisi olabilir) artıklık, ikilik (bir sitokin pro veya anti inflammatory etkileri farklı koşullar altında olabilir), ve plastisite (sitokinler kalıp içine bir rol farklı ortama bağlı "orijinal" onun bir)4,5,6. Sonuç olarak, nüfus düzeyinde yöntemleri aynı "sitokin ortamın" türdeş olmayan hücresel yanıt ayırt edemez. Benzer şekilde, çalışma (bir tek hücre türü veya sitokin) bağışıklık sisteminin bir belirli konu üzerinde odaklanmak tasarımları, karmaşık otoimmün hastalığı dahil tüm öğeleri genel bir değerlendirmesini sunuyor musunuz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz.
Son zamanlarda, aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli "patojenik" periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak için bir tek hücreli proteomik yaklaşım geliştirdik. Burada açıklanan iş akışı bozulmamış çevre tam kan örnekleri, izole periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) karşı kullanımı ile karakterizedir. Bütün kan periferik sistemik immün aracılı hastalığı otoimmün hastalığı (yani, nötrofiller, trombosit) ve 2) plazma kez dahil 1) Sigara-mononükleer kan hücreleri de dahil olmak üzere, eğitim için en fizyolojik ilgili araç temsil eder. Nükleik asitler, immün kompleksler ve sitokinler, gibi faktörler dolaşan olan bağışıklık aktive rollere sahip. Yakalamak için "içsel patojenik" dysregulated sitokin üretim, periferik kan örnekleri hemen sonra kan alımı (T0, sıfır) ve 6 h, 37 ° c (fizyolojik vücut ısısı) bir protein taşıma ile kuluçka sonra işlenir inhibitörü "içsel" hastalık durumu (Şekil 1) yansıtacak sitokin üretim (birikimi, T6-T0) tespit etmek için herhangi bir eksojen uyarıcı durumu (T6, saat 6 h), yokluğunda. (6 h kuluçka protein taşıma inhibitörü ile 37 ° C'de) üzerinden yansıtmak dysregulated işlemler veya periferik kan örnekleri olan yolları bağışıklık yanıtı hastalığa, ilgili yer işaret altında aktif çalışmaya bir eksojen ile tedavi Nükleik asitler yanıt yansıtacak sitokin üretim algılamak için geçiş ücreti-gibi-reseptör (TLR) agonistler SLE (T6 + R848, zaman 6 1 µg/mL ile R848 s), söz konusu olduğunda gibi hastalık patogenezinde yansıtır koşulu uyarıcı (T0 vs T6 vs T6 karşılaştırma + R848, Şekil 1). Onlar kesin bağışıklık dysregulated işlemler için belirli hasta ilgilendirmeyen olarak kullanılabilir therapeutics ex vivo, etkileri immunomodulatory eğitim için periferik kan örnekleri bir JAK inhibitörü ile ilgili, terapötik değerlendirilir konsantrasyonu (burada, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, süre 5 ile 6 h uM ruxolitinib), "iç" hastalık durumunda ilaç (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Şekil 1) karşılık olarak değişiklikleri algılamak için. JAK inhibitörleri gibi ra otoimmün hastalıkların tedavisinde başarılı olduğu gösterilmiştir çünkü bir JAK önleyici bu çalışma için seçildi
Aynı anda birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri, SLE periferik kan örnekleri yukarıda açıklanan dysregulated işlemleri değerlendirmek için hasta ve sağlıklı kontrol yukarıda açıklandığı gibi işlenen ve kitle sitometresi tarafından analiz. 7,8,9spektral konularda örtüşme olmadan kitle sitometresi, olarak da bilinen sitometresi-zaman--uçuş, 40'tan fazla parametreleri tek hücre analizi sunmaktadır. Bu tekniği nadir toprak metal izotoplar çözünür metal iyonları şeklinde Etiketler antikorlar, fluorophores10yerine bağlı olarak kullanır. Kitle sitometresi teknolojik platform (Yani, ayar ve kalibrasyon, örnek alma) ile ilgili ek ayrıntılar bulunabilir Leipold vd ve McCarthy vd. 11 , 12 yüksek-boyutluluk kitle sitometresi, tek hücreli taneciklik (Malzemeler tablo) ile aynı anda birden fazla sitokinler doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri boyunca ölçümü sağlar.
Geçerli geleneksel klinik ve laboratuvar parametreleri hassas veya devam eden hastalık aktivitesi veya belirli immunomodulators13daha iyi temel bağışıklık betimlemek gerek yansıtan, cevaben algılamak için belirli genellikle değildir flare-up sürücü değişiklikleri. Sitokin bozukluk kapitalistleri otoimmün hastalığı göz önüne alındığında, antikorlar veya sitokinler hedefleme veya sinyal proteinleri sitokin üretiminin yönetmelikte yer alan küçük moleküler inhibitörleri kullanın tedavi yaklaşımları bir bolluk var Son zamanlarda ortaya çıkan. Temel biçimiyle, burada açıklanan periferik kan analitik yaklaşım hastaya özgü dysregulated hücre alt kümeleri ve anormal sitokin üretim sistemik bulgular ile otoimmün hastalık tanımlamak için bir platform sağlar. Bu metodoloji tedavi seçenekleri kişiselleştirme için belirli dysregulated sitokinler belirlenebilir ve spesifik tedavi seçenekleri olabilir onların yetenek-e doğru immunomodulate değerlendirmek için ex vivo hasta belirli hastalık test sağlar işlem.

<table><tbody><tr><td>Ruxolitinib</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-364729A</td><td>Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>Stock Conc: 1 &amp;mu;g/&amp;mu;L; Final Conc: 1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>Stock Conc: 1 &amp;mu;g/&amp;mu;L; Final Conc: 0.1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix Buffer</td><td>BD biosciences</td><td>558049</td><td>Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)</td></tr><tr><td>BD Phosflow perm/wash buffer I</td><td>BD biosciences</td><td>557885</td><td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>Stock Conc: &gt;99.9%; Final Conc: 0.0002</td></tr><tr><td>Protein Transport Inhibitor (PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>DNA Intercalator</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>Stock Conc: 500 &amp;mu;M; Final Conc: 0.1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Cell Staining Media (CSM)</td><td></td><td></td><td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td><td>Fluidigm</td><td>201057</td><td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>20-plex Pd Barcode Set</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td></tr><tr><td>EQ &lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Four Element Calibration Beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>16% MeOH-free Formaldehyde Solution</td><td>Thermo</td><td>28908</td><td>Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)</td></tr><tr><td>Sterile round bottom polystyrene tubes</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td></tr><tr><td>Polypropylene cluster tubes</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td></tr><tr><td>Helios CyTOF instrument</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 M&amp;Omega;.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies used for Mass Cytometry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surface markers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>Mass: 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>Mass: 144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>Mass: 174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>Mass: 149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>Mass: 142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>Mass: 209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>Mass: 152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>Mass: 115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>Mass: 154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>Mass: 165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>Mass: 163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>Mass: 141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>Mass: 155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>Mass: 172</td></tr><tr><td>CD45 total</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>Mass: 89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>Mass: 153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>Mass: 168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>Mass: 113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>Mass: 150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>Mass: 143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>Mass: 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>Mass: 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>Mass: 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>Mass: 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>Mass: 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>Mass: 167</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cytokines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&amp;alpha;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>Mass: 147</td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>H1b-98</td><td>Mass: 169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>AS17</td><td>Mass: 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>Mass: 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>Mass: 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>C8.6</td><td>Mass: 171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>BL168</td><td>Mass: 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>Mass: 176</td></tr><tr><td>MIP1&amp;beta;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>Mass: 158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>Mass: 170</td></tr><tr><td>IFN&amp;alpha;</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>LT27:295</td><td>Mass: 175</td></tr><tr><td>IFN&amp;gamma;</td><td>Biolegend</td><td>4S.B3</td><td>Mass: 165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>Mass: 159</td></tr><tr><td>TNF&amp;alpha;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>Mass: 166</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Note&lt;/strong&gt;: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling&amp;nbsp; Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry

Sitokinler, otoimmün hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sitokin düzeyleri ölçümü bir girişim self-tolerance ve sonraki otoimmünite dökümü yol açan kesin mekanizmalar anlamak için birden fazla çalışmaların odak noktası olmuştur. Yaklaşımlar şu ana kadar belirli bir yönü (tek veya birkaç hücre tipleri veya sitokinler) bağışıklık sisteminin çalışmaya dayanarak ve karmaşık otoimmün hastalık genel bir değerlendirmesini sağlamaz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz. Sitokin üretim faktörleri, dolaşan "içsel" hasta özel plazma bağlamında birden çok alt bağışıklık hücre kümeleri içinde değerlendirmek için kapsamlı bir tek hücreli yaklaşım burada açıklanmıştır. Bu yaklaşım sağlar hastaya özgü bağışıklık fenotip (yüzey işaretleri) izleme ve fonksiyonu (sitokinler), ya da onun yerli "içsel patojenik" hastalık devlet, veya terapötik ajanlar (içinde VIVO veya ex vivo) huzurunda.

İş akışı uyarılması için Şekil 1 gösterir ve kan örnek aliquots, tahsisi de dahil olmak üzere periferik kan örnekleri işleme zamanlama stimülasyon ajanlar, protein ek taşıma inhibitörü kokteyl ve kuluçka kez kırmızı kan hücresi (RBC) lizis ve fiksasyon kadar. Seçtiğiniz uyarıcı ajanlar bir değerlendirmesi için hedeflenir sinyal ve sitokin yollar bağlı olacaktır. Örneğin, burada açıklanan protokolünde TLR agonistler doğu?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry at JoVE.com

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

single-cell-analysis-immunophenotype-cytokine-production-peripheral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.4K Görüntüleme.  University of Colorado School of Medicine. Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Video: Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Biyomühendislik

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and biomarkers. Recently, it has been used in microbiology for the routine identification of bacteria grown from clinical samples, without preparation or fractionation steps. We and others have applied this whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry technique successfully to eukaryotic cells. Current applications range from cell type identification to quality control assessment of cell culture and diagnostic applications. Here, we describe its use to explore the various polarization phenotypes of macrophages in response to cytokines or heat-killed bacteria. It allowed the identification of macrophage-specific fingerprints that are representative of the diversity of proteomic responses of macrophages. This application illustrates the accuracy and simplicity of the method. The protocol we described here may be useful for studying the immune host response in pathological conditions or may be extended to wider diagnostic applications.

This protocol describes the use of whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry on eukaryotic cells. Here, we illustrate the accuracy of this technique by analyzing the multiple activation states of macrophages in response to their microenvironment.

Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Biyoloji

Mass Cytometry Analysis of Systemic and Local Immune Responses in Hepatocellular Carcinoma

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common and deadliest forms of liver cancer worldwide. Despite advances in treatment, the prognosis for HCC patients remains poor due to the complex interplay of genetic, environmental, and immunological factors driving its progression. Understanding the immune landscape of HCC is crucial for developing effective therapies, particularly in the field of immunotherapy, which holds great promises for improving patient outcomes. This study employs mass cytometry (cytometry by time-of-flight [CyTOF]) technology to investigate both systemic and local immune responses in patients with HCC. By analyzing peripheral blood and tumor samples, the research aims to identify unique immune cell populations, and their functional states associated with HCC progression. The findings provide a comprehensive overview of the immune landscape in HCC, highlighting potential biomarkers and therapeutic targets. This approach offers valuable insights into the immune mechanisms underlying HCC and paves the way for the development of more effective immunotherapies for this malignancy.

This protocol outlines a comprehensive mass cytometry (cytometry by time-of-flight [CyTOF]) analysis method for evaluating both systemic and local immune responses in hepatocellular carcinoma (HCC). The approach aims to provide insights into the immune landscape of HCC, offering a deeper understanding of the tumor microenvironment and the associated immune mechanisms.

Hepatosellüler Karsinomda Sistemik ve Lokal İmmün Yanıtların Kütle Sitometrisi Analizi

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common and deadliest forms of liver cancer worldwide. Despite advances in treatment, the prognosis for ...

A Flow Cytometry Assay to Identify Immune Cell Subsets in Peripheral Blood Mononuclear Cells

Source: Torchia, M. L. G., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58955">Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates a flow cytometry-based technique using two fluorochromes to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, natural killer (NK) cells, and monocytes in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Upon incubating the cells with fluorochrome-conjugated antibodies against the surface markers, the cell subsets are identified using an optimal flow cytometric gating strategy.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde İmmün Hücre Alt Kümelerini Tanımlamak için Bir Akış Sitometrisi Testi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
NOTE: This protocol has been tested ...