Name: levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions at JoVE.com

Biz Dr Mark M. zengin ve Daniel Miranda Editöryel Yorum için Ahmad Khedraki mali destek (A.A.V. için başlangıç Fonu) için bu tekniği ve Wright Devlet Üniversitesi kurmak yardım ettiğin için teşekkür ederim.

Tüm hayvan yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi Wright Devlet Üniversitesi uygun olarak yapıldı.
1. fare ötenazi
<ol><li>Bir duman başlık, hava geçirmez bir cam odası anesthetizing fareyi getirin.</li>
	<li>Fareyi isoflurane (doyurarak veya ~ % 25) ölümcül bir doz için inhalasyon yoluyla ortaya çıkarmak. Nefes gözlenen kadar odasında fareyi bırakın.</li>
	<li>Fare odasından kaldırın ve ötenazi, ikincil yöntem olarak yerindençıkmasına servikal gerçekleştirmek.</li>
</ol>2. kaldırma saç baş, boyun ve sırt Dorsal yüzeyinden
<ol><li>Bir Elektrikli tıraş makinesi saç baş, boyun ve fare arkasında dorsal yüzeyi çoğunluğu kaldırmak için kullanın. Ayrıca, çevresinde ve sol kulak saç kaldırmak. Not: dikkat çekmek ne zaman tıraş kulak çevresindeki deri, deri tıraş bıçakları yakayı ele ve temel kas dokusuna zarar verebilir.</li>
	<li>Saç dökücü krem bir pamuk bez ile kalan saç kaldırmak için traş bölgeye uygulanır. Yaklaşık 1 dakika bekleyin ve krem saç kaldırma sıkmak yıkama şişe kullanarak su ile durulayın sonra uzak kalan herhangi bir krem veya pamuklu çubukla kullanarak saç fırça ve cilt kuru pat.</li>
</ol>3. deri Levator Auris Longus kas ortaya çıkarmak için kaldırmak
<ol><li>Stereo diseksiyon mikroskop altında fare scapulae düzeyde arkasında küçük bir insizyon attım (Cilt için sadece derin yeterli) olun. Şekil 1A-Bgösterilen yolunu izleyerek mikro diseksiyon makası kullanarak deriyi kesme.</li>
	<li>(No 5 gibi) iyi forseps kullanarak, scapulae yakın kesme boyunca cilt kaldırın. Bahar makas kullanılarak, bağ dokusu deri kulak yaklaşırken temel kas dokusundan ayırmak için kesme. Önemlisi, bağ dokusu maruz kalan kas dokusunun yanlışlıkla kesme önlemek için deri içine sivri Bıçaklar ile kesti.</li>
	<li>Düzenli olarak maruz kalan kas (mM) oluşur aşağıdaki Na+ dış arabellek gibi bir fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu ile sıvı: 144 NaCl, 4 KCl, 1.2 CaCl2, 0.6 MgCl2, 5 glikoz, 1 NaH2PO4, pH 7.4 NaOH ile ve bir osmolalite 300 ± 5 mmol/kg vardır. Bir kez cilt tamamen fare kaldırmak ve onu atmak için kulak çevresindeki deri kesilmiş sol kulak için bağ dokusu kesilmiş oldu. Not: LAL kulak tabanına verdiği ve cilt kaldırılırken kolayca zarar görebilir. Yaklaşık 1 mm LAL kesme önlemek için kulak tabanı etrafında deri bırakmak iyidir.</li>
</ol>4. kaldırma Levator Auris Longus kas ve çevresindeki doku
<ol><li>Hangi omurga arasında scapulae bağlanmak için LAL, aşağı kesim kasları tarafından bahar makas kullanarak başlatın. Sadece orta hat, sağına doğru kürek başlangıç ve orta hat sağ tarafında kalan süre rostral fareyi, sonuna doğru kesti. Devam sonuna kadar kas dokusu sonuna kadar kafatası üzerinde kesme. Not: LAL kulak ve orta hat, medial tarafına bağlı en yüzeysel kas Şekil 2' de gösterildiği gibidir. Diğer resimleri, AK Greene17 tarafından bir kitap LAL mükemmel, çizilmiş görüntüleri gösterir.</li>
	<li>Forseps orta hat, hemen sağındaki kesme doku kapmak sonra yavaşça kaldırın ve doku sol kulak doğru sol LAL aşağı olan birkaç kat kas kaldırmak için kafatası karşı baskı makas bıçaklı kesme başlamak için kullanın. Tüm geçici olarak yanlışlıkla LAL kaldırma sırasında kesme önlemek için bağlı katmanların bırakın.</li>
	<li>Bıçaklar ile paralel olarak kesmek ve belgili tanımlık kulak kanal kaydırılır ve kas kulak medial tarafında girer LAL innervates sinir kesme önlemek için kafatası karşı baskı. Kadar mümkün olduğunca bağlı sinir tutmak belgili tanımlık kulak kanal içinden devam. Not: LAL sağlayan sinir uzakta-in yüz sinir dalları ve daha sonra yordamda kullanılacaktır olarak muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Şekil 1B adımında kulak ventrolateral kısmı üzerinde gösterilen aynı yol boyunca kulak kanalına geçince mi yağlı doku kes. Ayrıca, sol kürek kemiği kas tamamen fare kaldırmak için sağ tarafta olduğu gibi kesti.</li>
</ol>5. Levator Auris Longus kas yalıtım
<ol><li>LAL ve çevresindeki doku, bir konteyner içine yerleştirin. Bir konteyner içinde disseke doku gibi bir petri silikon elastomer alt ile altına tutturulmuş kullanın. Banyo ve doku bir fizyolojik serum çözümde sık sık yıkayın.</li>
	<li>Boyunca Bankası için LAL bağlı kulak kıkırdak parçası bırakarak kulak, kulak pinna kesti. Böylece aşağı yüzün (LAL çanak alt) yukarı dönük kas çevir.</li>
	<li>Hazırlık tutmak için belgili tanımlık kulak kanal aracılığıyla bir böcek pin gibi bir iğne yerleştirin. O zaman daha küçük iğne, PIN LAL midline karşı tarafta kalan doku kullanarak. Forseps kullanarak, yavaşça deri yan kısmındaki kas germek dışarı ve bir iğne deri yoluyla yerleştirmek için kulak çekin. Şekil 3' te gösterildiği gibi iyi yemek için güvenli dokudur kadar bu adımı yineleyin. Not: Küçük diseksiyon pimleri akupunktur iğneleri ipuçları için istenilen uzunluğa kesim tarafından yapılabilir. Bu küçük pin doku hasarı en aza indirmek ve su-daldırma mikroskop objektif uzun çalışma uzaklıkları ile birlikte kullanılabilir.</li>
	<li>Begin, kasları (gösterildiği şekil 4) kaldırma bu LAL (auricularis üstün, kaçıran auris longus ve interscutularis) kapsayan ve bu LAL için bağ dokusu ile bağlı ve özellikle dar yakınındaki orta çizgi, No 5 forseps ve bahar makas kullanarak.</li>
	<li>Yukarı çekmeye forseps kullanarak örten kas katmandaki bağ dokusu ile varlık makara kas katmanı doğru odaklı bıçaklar ve kesme veya LAL nicking önlemek için dikkat ediniz. Orta çizgi doğru kesme ve orta hat giderken yaklaşık dörtte üçü kesmeyi bırak. Sonra her kas katmanı kaldırmak için orta hat için paralel kesti. Kadar sadece LAL kalır kas tabakaları kaldırma devam et.</li>
	<li>Elektrotlar kazığa oturtma içinde AIDS LAL kapsayan kalan bağ dokusu bazılarını kaldırın. Yavaşça No 5 forseps bağ dokusu LAL uzak çekmek ve uzak bahar makas kullanarak kesmek için kullanın. Sadece o kadar kolay sürecinde LAL zarar riski olmadan yapılabilir doku kaldırın. Nöromüsküler kavşak görselleştirme engel LAL alt yüzeyinde kalan aşağı kas tabakaları innervate herhangi bir büyük sinirler kaldırın.</li>
</ol>6. sinir yalıtım
<ol><li>Sinir Stimülatörü kullanarak LAL innervates sinir belirle (örneğin, iki Platin teller bağlı bir darbe üreteci); kulak kanalına kaslar için çalışan birkaç sinirler bulunur. Sinirleri bazı akım sağlayan sinir Stimülatörü ile touch (geçerli V 5 civarında değişir). Ne zaman kas sözleşmeleri, doğru sinir olduğu belirlendi.</li>
	<li>Dikkatle doku sinir yakınındaki kapmak ve bahar makas sinir kulak çevreleyen dokusundan ayırmak için kullanın. Hasarı en aza indirmek için daha sonra kayıt çanak sinir güvenliğini sağlamak için kullanılan bazı çevreleyen doku gömülü sinir çoğunu tutun. Not: LAL innervates motor sinir medial ve açılış belgili tanımlık kulak kanal tarafında bulunur.</li>
	<li>İki kutuplu bir uyarıcı elektrot kullanarak, sinir, kas distal bölgenin etrafında sadece çevreleyen doku kaldırın. Emme bir elektrot kullanarak, sinir kesme sonundaki çevreleyen doku kaldırın. Not: Bu iyi durdurma noktadır. Bu bir iyi durdurma noktadır. Eğer bir ara disseke LAL hazırlık bir fizyolojik çözüm ya da bir kaç saat zararlı metabolitleri değil birikir sağlamak için sürekli perfüzyon sürdürülebilir. Çözüm ya da sabit perfüzyon büyük miktarda zararlı metabolitleri değil birikir emin olmak için kullanın.</li>
	<li>Ardından, çözme ve perfüzyon odasına dik bir bileşik mikroskop altında Elektrofizyoloji deneyler için kas transferi. Not: Kullanım ile yumuşak bir alt doku güvenli bir şekilde olabilen bir perfüzyon Odası (şekil 5A) tutturulmuş.</li>
	<li>İğne ucunda (kulak ve orta hat) ve kas kenarı boyunca kas. Sinir kas lifleri dikey konumlandırma ve sinir sonunda sağlam kaldı bazı aşırı doku ile çanak dibine pin. Her zaman bir fizyolojik serum çözümde banyo doku tutun. Not: Yükseltilmiş malzeme doğrudan altında LAL kas lifleri yuvarlak yararlıdır. Bu ekstra destek elektrot kazığa oturtma AIDS ve yan tarafında yalan bir 50 mL konik tüp döküm silikon elastomer küçük bir bölümünden yapılabilir. Elastomer yuvarlak bölümünü taze silikon az miktarda kullanarak perfüzyon odası altına güvenli. Perfüzyon odası bir diyagram şekil 5B-Cile gösterilir. Kas lifleri (ki çok hidrofobik) yeni oyuncular silikon elastomer için çok sıkı uygun ve daha da zarar görebilir. Ceket için yararlıdır veya blok yeni protein, bir immunoblot engelleme adımına benzer silikon döküm. Bunu engellemek için biz yeni oyuncular silikon sığır serum albümin konsantre bir çözümde gecede inkübe.</li>
</ol>7. Elektrofizyoloji ekipman kurulumu
<ol><li>Hazırlamak veya aliquots gibi ışığa duyarlı ve ışıktan uzak muhafaza edilmelidir mitokondrial boya 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, nöromüsküler kavşak görselleştirme yardım etmek için bir boya, buzlarını. Ayrıca, elektrot çözümleri çözme. Girdap tüm solutes çözüm olduğundan emin olmak için tüm aliquots. 1 µM içeren bir fizyolojik serum çözüm hazırlamak µ-Conotoxin GIIIB (μ-CTX) ve 80 µM BTS (isteğe bağlı).</li>
	<li>Perfüzyon odası mikroskop sahneye LAL ile güvenli. 3 M agar Köprüsü üzerinden kayıt odası'na bağlı KCl Place referans elektrot bir bardağa dolu. Referans elektrot amfi üreticinin yönergelerini başına bağlayın.</li>
	<li>Bu noktada, sinir uyarıcı elektrot sinir üzerinde konumlandırın. De sinir stimülasyonu için çalışırken bir emme elektrot veya küçük bir iki kutuplu elektrot kullanın.<ol>
<li>Uyarıcı elektrot gibi kas uyarımı yapı kayıtları sayısını en aza indirmek için mümkün olduğunca uzak getirin. Not: Uyarıcı elektrot gerilimi genlik gerektiği gibi kontrol edebilirsiniz bir uyarıcı yalıtım birimi ile kontrol edilmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaş yavaş kasılmalar gözlenen kadar uyarıcı yalıtım birimi üzerinde gerilim düğmeyi çevirerek gerilim yükseltmek. Hangi ilk daralma gözlenmiştir eşik noktasıdır. Bir kez tanımlanan eşik, gerilim uyarıcı yalıtım birimi üzerinde 1,5 ayarla * eşik (veya deneme tarafından tanımlandığı gibi). Not: Şekil 6 dik bir mikroskop ve Bugi manipülatör kullanarak sinir yerleştirilmiş küçük iki kutuplu elektrot altında kurmak kas hazırlık göstermektedir. Hala yeterince eşiğin olurken mümkün uyarılması için en düşük fiyat voltajı için olumlu. Daha düşük bir uyarıcı gerilim kayıtları sırasında stimülasyon yapı sayısını azaltır. Ayrıca, uzak Kas uyarıcı elektrot yerleştirme stimülasyon obje boyutunu azaltır. Bazen sinir Stimülatörü nereye yerleştirileceğini ile deneme gerekli olabilir bu yüzden sinir sonu diseksiyon zarar görür.</li>
	<li>Banyo tuzlu çözüm kaldırın ve 5 µM 4-Di-2-Asp ile değiştirin. LAL Hazırlık'a 4-Di-2-Asp nöromüsküler kavşak görüntüleme (Şekil 7) için yeterli Floresans elde etmek 10 min için maruz.</li>
	<li>İki elektrot çözümleri, 3 M KCl ve K+ iç çözüm (mM) oluşan 75 aspartat, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP disodyum, 5 phosphocreatine disodyum, 5 glutatyon, 20 BEZLERİ, 30 EGTA, pH 7.2 KOH ile hazır olun. Not: Çözümleri önceden hazırlanmalı; K+ iç çözüm aliquots-20 ° C'de depolanan</li>
	<li>Dolgu çekti cam ile 3 M KCl. gerilim algılamalı elektrot için kılcal K+ iç çözüm (hazırlanan adım 7,6) akım geçen elektrot için kullanın; 1 mL şırınga bağlı bir Ametal dar iğne (~ 34 ölçer) kolayca cam kılcal doldurmak için kullanın. Yavaşça hava kabarcıkları kaldırmak için kılcal dokunun; Dolgulu elektroda direnci 10-15 MΩ olduğundan emin olun. Not: Kontrol ve veri toplama yazılımı kullanarak her iki elektrot direnç not edin.</li>
	<li>10 dakika sonra normal Ca2 + çözüm 4-Di-Asp Çözümle değişimi.</li>
</ol>8. nöromüsküler kavşak Floresans kullanarak tanımlaması
<ol><li>Standart parlak alan ve floresan aydınlatma ile dik bir mikroskop kullanarak, floresan yeşil nöromüsküler kavşak dikey şekil 7Aiçinde gösterildiği gibi hazırlık boyunca kas lifleri için çalışan bir parlak bant arayın. Nöromüsküler kavşak tanımlamak için bir düşük büyütme su-daldırma hedefi (~ 10 X) kullanın Not: Mikroskop FITC küp ile donatılmış olmalıdır (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50) ve bir LED, lazer, halojen lamba veya civa lamba floresan için. Fotoğrafı beyazlatma, alan parlak ve floresan aydınlatma arasında geçiş yapar en aza indirmek için. Not: Bu genellikle daha proksimal orta hat kulağa tabanına grubudur. Grup nöromüsküler kavşak en yoğun olduğu bölgedir.</li>
	<li>Daha yüksek bir büyütme su-daldırma amaç (~ 40 X) geçin ve Elektrofizyoloji (şekil 7B) ile incelemek için bir nöromüsküler kavşak kas üst tabakası üzerinde tanımlamak.</li>
	<li>Başına üretici yönergelerine uygun headstages pipet tutucular içine doldurulmuş Pipetler güvenli. Yukarıda tanımlanan nöromüsküler kavşak (şekil 7C) 100 µm içinde kas membran elektrotlar yerleştirmek için micromanipulators kullanın. Öncelikle alan parlak mikroskobu kullanılarak elektrotlar yerleştirmek; Floresans elektrotlar nöromüsküler kavşak göreli konumunu doğrulamak için kullanın.</li>
	<li>Öncelikle, bir düşük büyütme (~ 10 X) hedefi elektrotlar bulun ve sonra son elektrotlar konumlandırma için daha yüksek bir büyütme (~ 40 X) amaç için geçiş yapmak için kullanın. Elektrotlar kasına bu noktada kazığa oturtmak değil, ilk elektrotlar radyo istasyonu ayarlayın.</li>
</ol>9. Aksesuar ve elektrotlar Impaling
<ol><li>Elektrotlar istenen fiber konumlandırılmış bir kez sıfır ve köprü Dengeleme (ya da benzer bir yaklaşım) gerilim algılamalı elektrot ayarlamak ve üretici yönergelerine başına elektrot kapasitans nötralize. Ayrıca, akım geçen elektrot sıfır.</li>
	<li>Her iki elektrot lif yüzeyinin aşağı getir. Yavaş yavaş böylece elektrotlar nöromüsküler kavşak ile ilgili olarak odaklı kalır lif aşağı yolda elektrotlar konumunu 8.3 ve 8,4 adımlarda açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
	<li>Sonra her iki elektrot kas lif yüzeyine temas etmiş, künt akım geçen elektrot ilk kazığa oturtmak. Elektrot kazığa oturtma kolaylaştırmak için buzz (aşırı kapasite tazminat kısa bakliyat), kısa geçerli bakliyat veya hafifçe dokunarak tablo gibi teknikleri kullanın.<ol>
<li>Elektrot Impaled gösterir negatif membran potansiyeli tespit kadar bir osiloskop veya osiloskop protokolü veri toplama yazılımı kullanarak olan sinyali, izlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daha net voltaj algılamalı elektrot Impaled akım geçen elektrot seviyesine kas üzerine bunalıma girmek. Her iki elektrot doğrultusunda bir başka bir kez, akım geçen elektrot ile uygulanan aynı teknikleri kullanarak gerilim algılamalı elektrot kazığa oturtmak.</li>
	<li>Başarılı kazığa oturtma, denetleyicinin amplifikatör için kullanarak üzerine sürekli negatif elektrot kazığa oturtma nedeniyle Membran zarar telafi etmek için geçerli geçen elektrot ile güncel tutan bir uygulanır. Hücre-80 doğru yavaş yavaş şarj etmek Başlarken mV, holding olarak geçerli gerekli istenen istirahat için potansiyel cep getirmek için artış (Yani,-80 -85 için mV). Not: kayıt gerektiren bir holding liflerinden önlemek geçerli mutlak değerde sağlıksız liflerinden kayıt olasılığını en aza indirmek için-25 nA vahşi tipi kas daha büyük.</li>
	<li>Fiber için birkaç dakika istenen dinlenme potansiyel, stabil sonra kas zarı özellikleri veya nöromuskuler iletim kayıt için devam etmek.</li>
</ol>10. kayıt postsinaptik membran özellikleri ve sinaptik iletimi
<ol><li>Geçerli-kelepçe kayıtları ile eşit sayıda motor endplate Riçinde ve τmbelirlemek için kullanılan karşılık gelen membran gerilim yanıtları ölçmek için pozitif ve negatif geçerli adımları uygulayarak başlar. Pasif özellikleri sağlamak için kararlı bir duruma ulaşmak ve bir doğrusal gerilim-akım ilişki16,19,20küçük gerilim yanıt kullanın. Kayıt ile bozuk veya sağlıksız Sinir liflerinden önlemek, mEPP frekans böyle lifleri var > 3 Hz.</li>
	<li>Sonra iki elektrot gerilimi-kelepçe üretici yönergelerine başına girin. Gerilim Tipi Kelepçe lifler -85 membran potansiyelini, mV. Gerilim Tipi Kelepçe ayarlar mEPCs olarak algılanmasını sağlayan sinyal noise oranları elde etmek. Not: Bakımı yeterli gerilim kontrolü bir sorun olabilir. Bu sorunları en aza indirmek için iki yöntem kullanabilirsiniz. İlk olarak, lifler motor endplate 100 µm içinde daha önce açıklandığı gibi bu lifler21uzunluğu sabit içinde olduğu Impaled. İkinci olarak, biz amplifikatör DC geri yükleme özelliğini kullanın. Bu özelliği bir çok yüksek voltaj-kelepçe kazanç ayarlar. Önceki çalışmalarımız bu yöntem ayrıntılı olarak açıklanan ve gerilim klempe endplate16değerlendirmek için bir yöntem sıraladı.</li>
	<li>Bir kez kayıt gerilim-kelepçe, sinaptik akımları (mEPCs ve eEPCs) çeşitli sinir stimülasyonu protokolleri kullanarak deneme gereksinimlerini temel alarak.<ol>
<li>Kayıt kendiliğinden mEPCs ve bir kayda EPCs sinaptik Modülasyon (kolaylaştırma veya modülasyon) quantal içerik değerlendirmek için olmadan sağlayan bir düşük frekanslı sinir stimülasyonu Protokolü (≤0.5 Hz) kullanarak EPCs. Sinaptik kolaylaştırma veya depresyon değerlendirmek için bir yüksek frekans sinir stimülasyonu Protokolü (50 Hz değerinde 10 bakliyat) kullanın.</li>
		<li>Veri toplama yazılımı ile kontrol edilir bir darbe Oluşturucu'yu kullanmamanızı tetiklenebilir bir uyarıcı yalıtım birimi üzerinden istenilen frekansta sinir uyarmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir kez gerilim tipi kelepçe kayıtları yapılır, amplifikatör bir akım tipi kelepçe ayara dönmek, Bütün akımlar off ve elektrotlar elyaf çıkarın. Elektrotlar değil tıkalı haline onay veya kayıt sırasında temel gerilim içinde drift. Not: lif kazığa oturtma önce ayarlanmış olarak drift ile ilgili elektrot gerilimi ekstraselüler çözümünde, 0 volt olmalıdır. Örneğin, kaydedilmiş Gerilim Gerilim deneme sırasında sürüklendi Eğer belirsiz olur.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li><li>Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+mouse+levator+auris+longus+muscle:+a+convenient+preparation+to+study+muscle+and+nerve+plasticity.">Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity.</a> J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).</li><li>Bertone, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+inhibitor+acetazolamide+shifts+synaptic+vesicle+recycling+to+a+fast+mode+at+the+mouse+neuromuscular+junction.">Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction.</a> Synapse. , (2017).</li><li>Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+of+Ca2++from+mouse+motor+terminal+mitochondria+via+a+Na+-Ca2++exchanger+increases+post-tetanic+evoked+release.">Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release.</a> J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Nadal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+muscarinic+acetylcholine+autoreceptors+(M1,+M2+and+M4+subtypes),+adenosine+receptors+(A1+and+A2A)+and+tropomyosin-related+kinase+B+receptor+(TrkB)+modulate+the+developmental+synapse+elimination+process+at+the+neuromuscular+junction.">Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).</li><li>Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-glia+interactions+are+governed+by+synaptic+and+intrinsic+glial+properties.">Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties.</a> Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).</li><li>Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neurotransmitter+release+at+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+polyglutamine+disease.">Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease.</a> J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).</li><li>Takeuchi, A., Takeuchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+analysis+of+relationship+between+end-plate+potential+and+end-plate+current.">Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current.</a> J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).</li><li>McLachlan, E. M., Martin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+linear+summation+of+end+plate+potentials+in+the+frog+and+mouse.">Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse.</a> The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).</li><li>Obis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+protein+kinase+C+epsilon+isoform+modulates+acetylcholine+release+in+the+rat+neuromuscular+junction.">The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).</li><li>Silveira, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+and+inositol+triphosphate+receptors+modulate+facilitation+and+tetanic+depression+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).</li><li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+factor+at+the+neuromuscular+junction.">Safety factor at the neuromuscular junction.</a> Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).</li><li>Miranda, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+Cl-+channel+defects+reveal+disrupted+skeletal+muscle+maturation+in+R6/2+Huntington's+mice.">Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice.</a> J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).</li><li>Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease+skeletal+muscle+is+hyperexcitable+owing+to+chloride+and+potassium+channel+dysfunction.">Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).</li><li>Khedraki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressed+Synaptic+Transmission+and+Reduced+Vesicle+Release+Sites+in+Huntington's+Disease+Neuromuscular+Junctions.">Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The anatomy of the rat. , (1955).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals.">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).</li><li>Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electric current flow in excitable cells. , (1983).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y(1)+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors.</a> Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).</li><li>Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+slow+mammalian+muscles+after+denervation.">Fast and slow mammalian muscles after denervation.</a> Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).</li><li>Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+types+of+calcium+channels+mediate+transmitter+release+during+functional+recovery+of+botulinum+toxin+type+A-poisoned+mouse+motor+nerve+terminals.">Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals.</a> Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).</li><li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+mobility+in+mouse+motor+nerve+terminals+with+and+without+synapsin.">Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin.</a> J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).</li><li>Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+ATPase+Inserted+into+the+Plasma+Membrane+of+Motor+Terminals+by+Exocytosis+Alkalinizes+Cytosolic+pH+and+Facilitates+Endocytosis.">Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis.</a> Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan hazırlık ve akım veya gerilim kelepçe koşullar altında nöromuskuler iletim ölçümü için fareyi LAL kas kullanımı olduğunu. LAL dissekan için göz önünde bulundurulacak birkaç önemli nokta vardır. Aşırı bağ dokusu kas AIDS olarak elektrot elektrot kazığa oturtma'dan temizlik bağ dokusu onları kazığa oturtma için yerleştirirken pürüzle. Ancak, sadece elinden alınan bağ dokusu kaldırmak kolayca kas zarar verme olasılığını sınırlandırmak için. Çünkü çok has...

Nöromusküler kavşakta sinaptik iletimi okuyan gergin ve iskelet kas sistemleri arasındaki dinamik ilişki içine anlayışlar sağlar ve sinaptik Fizyoloji incelenmesi için mükemmel bir model. Levator auris longus (LAL) kolayca görüntülenmeyecektir nöromüsküler kavşak için izin veren bir ince kas var. Önceki raporlar sinaptik uyuşturucu ve toksinler incelemek ve iskelet kas fiber türü özellikleri LAL1,2nitelendirmiştir LAL kullanma kolaylığı anlatmıştık. Çok sayıda çalışma LAL nöromüsküler fizyolojisi3,4,5,6,7,8incelemek için kullandık. Elektrofizyoloji için yetenek kolayca LAL nöromüsküler kavşak gözlemlemek için microelectrodes motor endplate, doğru yerleşimini sağlar ve sinaptik iletimi kayıt alanı kelepçe sorunları büyük ölçüde azaltır. Membran zaman sabiti (τm) ve (Riçinde) giriş direnci gibi kas membran özelliklerini geçerli-kelepçe kayıtları kolayca elde edilir. Ayrıca, bu özellikleri kas zarı özellikleri sinaptik işleve doğrudan karşılaştırması için izin nöromuskuler iletim kaydetmek için kullanılan aynı kas liflerinden ölçülebilir. Bu veri analizi birçok nöromüsküler hastalıklar ve Birleşik değişmiş faaliyet fiziksel mekanizmalarının içine anahtar anlayışlar verebilir.
Burada açıklanan tekniği önemli bir yönü olmayan linearities akım-kelepçe içinde karşılaşılan tabi değildir ve kas membran özelliklerini bağımsız sinaptik kayıtları için gerilim tipi kelepçe kullanımıdır. Nöromuskuler iletim incelemek için gerilim-kelepçe akım tipi kelepçe karşı kullanmanın yararları 1950'lerde9çabalarında öncü tarafından kuruldu. Geçerli-kelepçe altında 10-15 mV genlik içinde aşan EPPs mEPP genlik9doğrusal bir ürün değildir. Örneğin, ortalama mEPP 1 mV, bir EPP 5 mV 5 mEPPs 5 (QC); ürün olarak kabul Oysa, bir EPP 40 mV 40'tan fazla mEPPs ürün olacak. Membran potansiyeli ve asetilkolin reseptörü denge potansiyeli arasındaki farktır EPP için sürüş zorlamak için daha büyük EPPs, bu non-lineer oluşur (~ -10 mV), büyük EPPs sırasında önemli ölçüde azaltır. Çünkü kas membran potansiyeli gerilim tipi kelepçe deneyler sırasında değişmiyor bu sorun gerilim tipi kelepçe deneylerde önlenmiş olur. Bir dezavantajı gerilim tipi kelepçe deneyler daha geçerli-kelepçe kayıt tamamlamak teknik olarak daha zor olmasıdır. Bunu aklýnýzda tutarak, Sigara linearities akım tipi kelepçe kayıtları EPPs10hesapları basit bir matematiksel düzeltme McLachlan ve Martin geliştirdi. Düzeltmeleri de11,12,13iş ama önemlisi, kas zarı özellikleri değil kesintiye varsayıyorum.
Kas zarı özellikleri koşulları ya da kas bozabilir hastalık durumlarında eğitim düşünün özellikle önemlidir. Örneğin, Huntington hastalığı R6/2 transgenik modelinden kas iskelet dinlenme klorür ve potasyum akımları14,15hyperexcitable bir progresif azalma nedeniyle olur. Sonuç olarak mEPPs ve EPPs R6/2 iskelet kas güçlendirilmiş. Kesinlikle, Ek etkenler mEPPs ve EPPs değiştirebilir. SNARE-proteinler8' e ilgili gibi görünüyordu EPPs değişiklikleri bulunan farklı bir model Huntington hastalığı fare (R6/1) ile çalışma. Neden değiştirilmiş nöromuskuler iletim mekanizmaları değerlendirmek için gerilim tipi kelepçe kullanarak değiştirilmiş kas zarı özellikleri etkilerini ortadan kaldırmak faydalı olacaktır. Bir son çalışmada, R6/2 nöromuskuler iletim burada açıklanan tekniği kullanarak her iki akım ve gerilim kelepçe koşullar altında incelenmiştir. Motor endplates tamamını gerilim-% 1 hata klempe ile daha az iki microelectrodes endplate16uzunluğu sabit içinde yerleştirerek. Bu gerilim tipi kelepçe gösterildi ve R6/2 kas nöromuskuler iletim zıt ölçümleri vermiştir akım tipi kelepçe kayıtları düzeltti. Bu kas zarı özellikleri üzerinde değişiklik yapılmış Eğer EPPs sigara linearities düzeltmek zor olabileceğini vurgular ve kas membran özelliklerini bağımsız voltaj-kelepçe kayıtlarını edinme yararları göstermektedir. Burada sunulan Protokolü koşulları veya sinaptik iletimi ve postsinaptik membran özelliklerini etkileyen hastalık durumlarında incelenmesi için idealdir.

<table><tbody><tr><td>Olympus Compound Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x Objective</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Santa Barbara Instruments Group</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Generator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex Stimulus Isolator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Concentric Bipolar Electrode</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Ball-joint Manipulator</td><td>Narishige&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-metalic Syringes 34 Gauge</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>No. 2 Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Cream</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Stimulator</td><td>Grass Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model P-1000 Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low Pass Bessell Filter</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Left-handed Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Right-handed Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Single Motion Controler</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>Crossed Roller Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller</td></tr><tr><td>All chemicals were orded from Fisher except,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher</td></tr></tbody></table>

levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions

Bu iletişim kuralı geçerli-kelepçe ve gerilim-kelepçe koşullar altında nöromüsküler kavşak üzerinden kayıt sinaptik iletimi için bir teknik anlatılmaktadır. Çünkü bu motor endplate, elektrot kazığa oturtma için nöromüsküler kavşak kolay görselleştirme sağlar bir ince kas levator auris longus (LAL) ex vivo hazırlanması kullanılır. Bu yöntem için kayıt spontan minyatür endplate potansiyelleri ve akımlar (mEPPs ve mEPCs), endplate sinir uyarılmış potansiyeller ve akımlar (EPPs ve EPCs), aynı zamanda motor endplate membran özelliklerini tanır. Bu yöntem elde edilen sonuçları quantal (QC), vezikül yayın siteleri (n) sayısı, vezikül yayın (prel), sinaptik kolaylaştırma ve depresyon yanı sıra kas zarı zaman sabiti (τ olasılığı içerik m) ve giriş direnci. Bu tekniğin uygulamaya fare modelleri insan hastalık hastalığı Birleşik Devletleri anahtar patolojiler vurgulayın ve roman tedavi stratejileri belirlemek. Tam voltaj-tek bir synapse sıkma tarafından bu yöntem bir sinaptik iletimi şu anda mevcut en ayrıntılı analizlerini sağlar.

Şekil 8 geçerli bakliyat (şekil 8A) ve bir LAL fiber akım tipi kelepçe altında gerilim yanıtlarının (şekil 8B) bir 12-hafta-yaşlı vahşi türden R6/2 fare gösterilmektedir. Bu kayıtlar motor endplate alınmıştır mEPPs varlığını gösterir. Kayıtları normal fizyolojik serum çözümde elde edilmiştir. Bu akım tipi kelepçe kayıtları Riçinde ve τm bu li...

Watch this Scientific Journal Video about Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions at JoVE.com

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

levator-auris-longus-preparation-for-examination-mammalian

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

9.3K Görüntüleme.  Wright State University. Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.

Video: Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Biyokimya

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Biyoloji

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Nörobilim

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Bir<em&gt; İn Vitro</emKas afferentlerin tahrik Properties incelenmesi için&gt; Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and latency detect chronic axon loss and demyelination, respectively. Axonal excitability techniques &#34;by threshold tracking&#34; expand upon these measures by providing information regarding the activity of ion channels, pumps and exchangers that relate to acute function and may precede degenerative events. As such, the use of axonal excitability in animal models of neurological disorders may provide a useful in vivo measure to assess novel therapeutic interventions. Here we describe an experimental setup for multiple measures of motor axonal excitability techniques in the rat ulnar nerve.
The animals are anesthetized with isoflurane and carefully monitored to ensure constant and adequate depth of anesthesia. Body temperature, respiration rate, heart rate and saturation of oxygen in the blood are continuously monitored. Axonal excitability studies are performed using percutaneous stimulation of the ulnar nerve and recording from the hypothenar muscles of the forelimb paw. With correct electrode placement, a clear compound muscle action potential that increases in amplitude with increasing stimulus intensity is recorded. An automated program is then utilized to deliver a series of electrical pulses which generate 5 specific excitability measures in the following sequence: stimulus response behavior, strength duration time constant, threshold electrotonus, current-threshold relationship and the recovery cycle.
Data presented here indicate that these measures are repeatable and show similarity between left and right ulnar nerves when assessed on the same day. A limitation of these techniques in this setting is the effect of dose and time under anesthesia. Careful monitoring and recording of these variables should be undertaken for consideration at the time of analysis.

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

Axonal excitability techniques provide a powerful tool to examine pathophysiology and biophysical changes that precede irreversible degenerative events. This manuscript demonstrates the use of these techniques on the ulnar nerve of anesthetized rats.

Vivo Aksonal uyarılabilirlik test ile sıçan Ulnar sinirin Elektrofizyolojik ölçüm

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Levator Auris Longus Kasında Elektroporasyon ve Sinir Hasarı

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many organisms. At the NMJ, a presynaptic motor axon terminal contacts a muscle postsynaptic domain and is covered by terminal Schwann cells. The integrity and function of the NMJ is compromised under several conditions, including aging, neuromuscular diseases, and traumatic injuries. To analyze the potential contribution of muscle-derived proteins to NMJ maintenance and regeneration, an in vivo gene transfer strategy has been combined with the denervation of the cranial levator auris longus (LAL) muscle after mechanical nerve injury. Previous findings showed that the forced expression of control fluorescent proteins does not alter NMJ organization or neurotransmission. This procedure aims to describe a detailed method of in vivo electroporation of the LAL muscle followed by transection or crushing of the specific branch of the facial nerve innervating cranial muscles, leading to NMJ denervation and reinnervation, respectively. The combination of these experimental strategies in the convenient LAL muscle constitutes an efficient method to study the potential contribution of muscle protein overexpression or silencing in the context of short-term NMJ reinnervation.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Sinir Yaralanması Sonrası Nöromüsküler Kavşakta Kas Proteinlerinin Rejeneratif Rolleri

Here, we present a protocol that combines in vivo electroporation and denervation of the cranial levator auris longus (LAL) muscle. This procedure enables the study of the potential role of muscle-derived proteins in the regeneration of the neuromuscular synapse.

Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...