Alison kilise kuş, Auburn Üniversitesi Okul, hayvan hastalıklarıyla ilgili ilaç akış sitometresi NIH cep ve Auburn Üniversitesi Moleküler Biyoloji programı için EHS R15 R15 AI107773 ve fon için tesis, teknik yardım için minnettarız Yaz PBR için araştırma fonu için.

Tüm hayvan iş bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri için Kılavuzu'nda açıklanan önerileri doğrultusunda Auburn Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. kemik iliği toplama için hazırlık
<ol><li>Bir çözüm Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta % 10 fetal buzağı serum, 2 mM glutamin ve 0,22 µm vakum filtre kabı birim üst 50 µM 2-mercaptoethanol ile takıma ekleyerek 250 mL tam ortam hazırlamak ve vakum uygulanır. Not: Tam orta 4 ° C'de 2 aya kadar saklanır.</li>
	<li>% 70 etanol çözüm % 100 etanol 350 mL 150 mL steril H2O'bir 500 mL şişe ile karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>Set santrifüj ile 4 ° c</li>
	<li>Forseps, neşter ve makas % 70 etanol içinde sterilize.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, komple bir medya 5 mL üç 60 mm Petri yemekler için ekleyin.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, komple bir medya 30 mL 50 mL konik tüp ekleyin.</li>
</ol>2. fare kemik iliği hücre koleksiyonu
<ol><li>C57BL/6 fare tarafından CO2 narkoz ötenazi 2013 Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi Derneği (travma) yönergeler tarafından kurulan kurallarına göre ötenazi.</li>
	<li>
Kaldırmak ve arka ayakları şerit.
	<ol>
<li>Arka ayakları ve gövde % 75 etanol ile emdirmek ve kıvrımlı doku makasla kalça eklemi çevresindeki deri yoluyla sığ kesim yapmak. Forseps kullanarak, sıkıca kalça derisinden kas açığa ayak bileği doğru aşağı çekin. Makas Cilt kapağı kaldırmak için kullanın.</li>
		<li>Bütün arka bacak kemik hemen üstünde uyluk kemiği/kalça eklemi içinden çıkarın. Not: bölgeyi sterilize yanı sıra, etanol temiz kesim sağlanmasında yardım edecek ve saç örnekleri kirletici önlemek.</li>
		<li>Eğer bacaklar kemik iliği hasat için yeni bir konuma aktarılır, komple bir medya bacaklarda daldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril Biyogüvenlik kabini çalışma, bacaklar önceden hazırlanmış Petri yemekler birine aktarın.</li>
	<li>Sadece kesmek için makas kullanın aşağıda ayak bileği ve dikkatli bir şekilde mümkün olduğunca kas ve elastik bağ dokusu daha fazla kaldırmak. Temizlenmiş kemik için ikinci hazırlanmış Petri kabına aktarın. Not: tüm kas kaldırmak için gerekli olmasa da, çok fazla kalan doku kemik iliğini temizlemek zorlaştırabilir.</li>
	<li>
Uyluk, diz ve tibia ayırın.
	<ol>
<li>Forseps kullanarak, bacak diz tutun ve kemik iliği bulun. Not: kemik iliği üst femur ve tibia sonuna doğru kemik boşluğu içinde hafif bir kırmızı çizgi olarak görünür olmalıdır.<ol>
<li>Makas kullanarak, aşağıdaki gibi üç kesim yapmak.<ol>
<li>Hemen ilik sona erdirmek için görüntülendiği üzerinde tibia kesmek.</li>
				<li>Sadece diz eklemi kesti.</li>
				<li>Sadece diz eklemi kesmek.</li>
				<li>Kalça eklemi hala femur bağlı ise, sadece kalça eklemi kesti.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Üç parçaları Petri kabına dönmek ve diğer bacak bu işlemi yineleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Femur ve tibia floş kemik iliği.
	<ol>
<li>Bir 10 mL şırınga ile 50 mL konik tüp ve kap tam medyadan 23 G iğne ile doldurun.</li>
		<li>Üçüncü hazırlanmış Petri kabına yukarıda forseps ile kemik tutan, iğne kemik kanalı içine yerleştirin ve medya aracılığıyla, (ki sağlam bir "tak" veya çeşitli kümeleri olarak ortaya çıkabilir) hücreleri dışarı fışkırma itin. Daha fazla renk-ebilmek var olmak seen kemiğe kadar yineleyin. Şırınga ile kitle iletişim araçları gerektiği gibi doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Epifizleri ezmek.
	<ol>
<li>Hala ikinci Petri dish iken, diz kapağı sıkıca forseps ile tutun ve diz şırınga ucu ile püre. Epifizleri artık kırmızı kadar devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şırınga kullanarak, hücreleri 50 mL tüp ikinci ve üçüncü Petri kabına aktarın. Ayrılık kümeleri tarafından hafifçe yukarı ve aşağı pipetting kadar. Kabarcıklar oluşturmamanız çalışın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.</li>
	<li>
Kırmızı kan hücreleri parçalayıcı
	<ol>
<li>Serolojik pipet ile süpernatant kaldırmak, Pelet flicking tarafından çıkarmak ve ACK (amonyum klorür potasyum) lizis arabellek için oda sıcaklığında 1 dk 1 ml kuluçka tarafından kırmızı kan hücreleri parçalayıcı.</li>
		<li>Serolojik pipet kullanarak HBSS (Hanks dengeli tuz solüsyonu) arabelleği 40 mL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, hücreleri bir 70 µm hücre süzgeç rağmen bir yeni 50 mL konik tüp içine filtre. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, tam medya 40 mL süpernatant ve yıkama hücrelerle kaldırın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika. Not: Bu aşamada lineage olumlu lenfositler FACS veya manyetik sütun arıtma tarafından kaldırılabilir. Ancak, lenfositler kültür uzun vadede korunmaz. Lineage pozitif hücrelerinin çok sayıda Ly6C-CD115-nüfus kemik iliği ex vivoiçinde mevcut olmakla birlikte, neredeyse tüm eksik gün 5 (Şekil 2).</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve tam medya 10 ng/mL 1 x 106 hücre/mL yoğunluğu, rekombinant fare GM-CSF ile kemik iliği hücrelerinde kültür. Not: Genellikle, 4 x 107 toplam hücreleri kırmızı kan hücre lizis sonra hasat edilebilir. Ancak, 2 x 107 kadar az yeni başlayanlar için ve ilâ 5 x 107 hücreleri deneyimli biçerdöver için bekler.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak hücreleri doku kültürü tabakaları bana aktarmak ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. 24-şey plaka kullanarak tohum Eğer her hücre süspansiyon 2 mL ile iyi.</li>
	<li>Her 48 h, serolojik pipet medya yarısı kaldırmak ve taze tam medya ve GM-CSF ile değiştirmek için kullanın. Not: Kültürler için 9 gün tutulabilir. Ancak, kompozisyon zaman içinde değişir. Daha fazla bilgi için bkz: Bölüm 3.</li>
</ol>3. gün tür seçimi
<ol><li>Hücre nüfus besteleri zaman içinde değiştikçe, istenen hücre en yüksek sayısını verir bir günü seçin.</li>
	<li>Tablo 1 GM-CSF kültürü 1 x 107 hücre başına 3, 5 ve 7 gün sonra beklenen hücre verim post sıralama beher-in belgili tanımlık nüfus için bkz:.</li>
</ol>4. strateji boyama
<ol><li>Küçük aliquots hücre kontrol örnekleri hazırlamak için kullanın. Bir günahı denetimi, yalnızca bir floresan antikor ile her, lekeli tazminat kontrol örnekleri içerir ve floresan eksi bir bir, non-spesifik floresans o kanal için denetime dışında tüm hangi antikor eklenir kontrol eder. Yalnız, ikincil yalnız, birincil dolaylı etiketleme, kullanarak eklerseniz ve hem birincil ve ikincil. Not: Phycoerythrin (PE) ve allophycocyanin (APC) öğesini antikorlar en az kanama ile ayrı ayrımı üzerinden birlikte kullanıldığında sağlamak. Ancak, fluorochrome seçenekleri sınırlı değilse, Ly6C çok yüksek düzeylerde ifade edilir iken CD115 nispeten düşük bir seviyede gösterilir. Bu nedenle, daha parlak fluorochromes anti-CD115 için arzu edilir ve anti-Ly6C fluorochromes üzerinde kanama önlemek için seçilir.</li>
	<li>100 mL FACS yıkama arabellek (FWB) ile fetal buzağı serum 50 mL konik tüp içinde 3 mL 97 mL soğuk Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) karıştırılarak hazırlamak ve bir buz banyosu yerleştirin.</li>
	<li>Yumuşak, ama iyice, yukarı ve aşağı herhangi bir gevşek yapışık hücreleri çıkarmak için hücreleri pipet için bir pipet kullanın.</li>
	<li>
Serolojik pipet kullanarak, hücreleri 50 mL konik tüp aktarın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.
	<ol>
<li>Hücre hacmi 50 mL aşarsa, tüpler gereken sayıda hücre aktarmak ve boyama adımda birleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaşça süpernatant dökün ve FWB 30 mL serolojik pipet ile ekleyerek pelleted hücreleri yıkayın. 250 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve yıkama tekrarlayın. Not: Eğer yüksek hücre ölümü beklenen, hücreleri ile FWB ile yıkanabilir % 0.5 fetal buzağı serum (FCS) gibi düşük. Bu topaklanma Hücre engeller.</li>
	<li>
Askıya alma ve antikor üretici yönergelerine başına hücre leke.
	<ol>
<li>5 x 107 hücreleri FWB 1 ml askıya alma ve anti-Ly6C ve anti-CD115 (araştırmacı seçtikleri) fluorophores ile etiketli her 2 µg ekleyin. Cumhuriyetçi millet Partisi (her ikisi de Ly6C - ve CD115 - vardır) moDC daha fazla ayırt etmek için anti-CD11c antikorların 2 µg ekleyin (CMP CD11c olan-; moDC vardır CD11c+). Buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya. Not: Şekil 3 Ly6C-PE ve CD115-APC kullanarak oluşturulmuştur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, FWB ve santrifüj 10 mL 250 x g 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça süpernatant dökün ve FWB 30 mL serolojik pipet ile ekleyerek pelleted hücreleri yıkayın. 250 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve yıkama tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri askıya almadan önce iyice Pelet çıkarmak için tüp hafifçe vur. 1 x 107 hücre/mL FWB hücreleri askıya alma ve 35-µm hücre filtreden filtrelemek için serolojik pipet kullanın. Filtre uygulanmış hücreler Polipropilen tüp içine aktarıp sıralamak için hazır kadar buza koyun serolojik pipet kullanın. Not: Polipropilen kullanılamıyorsa, kaplı protein (yağsız Kuru süt veya FCS) polistren tüpleri bağlama azaltmak için kullanılabilir.</li>
</ol>5. kontrol örneklere dayalı Gates ayarla
Not: yüksek hızlı akım akışı baskısı nedeniyle hücre kesintileri önlemek için hücre sıralamak için 100-130 µm meme kullanın.
<ol><li>
Günahı denetimi çalıştırmasına (bkz. Adım 4.1) hücre sıralayıcısı aracılığıyla ve küçük enkaz (düşük ileri dağılım; dışlamak için bir kapı uygulamak FSC) ve son derece taneli (yüksek dağılım; SSC) parçacıklar.
	<ol>
<li>Yalnızca sonraki aşamalar (monosit, moMac/MoDP ve MoDC) çözümlemek için yalnızca daha büyük hücreleri (yüksek FSC) içerecek şekilde geçişi uygulayın.</li>
		<li>Canlılığı lekeleri kullanılıyorsa, bunlar lekeli, uygun olmayan olaylar ( Şekil 1' de bir örnek gösterilmiştir) dışarıda bırakmak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tek floresan kontrol örnekleri hücre sıralayıcısı çalıştırın ve değerini gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Çok etiketli örnek örneği çalıştırın. Dört ayrı nüfus gözlemlemek: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monosit), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) ve Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Her dört büyük nüfusun yalıtmak için bir kapı uygulanır. Not: Ly6C-CD115-fenotip CMPs ve moDC paylaşın. Ancak, CD11c ifade dayalı farklılaşmış: CMP eksikliği CD11c, MoDCs CD11c hızlı ise.</li>
</ol>6. izole nüfus topluluğu
<ol><li>En az %20 ulaşmak için yeterli FCS ekleyerek koleksiyonu tüpleri hazırlayın final toplama ne zaman tam. Örneğin, 5 mL tüpler kullanıyorsanız, sıralamadan önce FCS 1 mL ekleyin ve 5 mL toplam hacim ulaştığında tüpü çıkarması.</li>
	<li>
Membran ciro ve antikor alımını önlemek için sıralama boyunca 4 ° C'de (karışık ve sıralanmış) tüm örneklerini tutun.
	<ol>
<li>Bu mümkün değilse, mümkün olduğu kadar buz üstünde sıralanması ve aliquots sıralayıcısı için gerektiği gibi aktarmak için hücreleri içeren tüp tutun.</li>
		<li>Ayrıca, her 20-30 dk buz için sıralanmış örnekleri aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreler için istediğiniz sayıyı topladıktan sonra serolojik pipet hücreleri için yeni bir konik tüp aktarmak için kullanın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.<ol>
<li>Saflık sonrası sıralama analizi üzerinde toplanan her nüfusunun küçük aliquots ile onaylayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak için FWB ve santrifüj 250 x g 4 ° c de iki yıkar, toplam 10 dk. tekrar 10 ml askıya alma. Not: Tüm süpernatant Pelet kekii olmadan kaldırmak zor olabilir. Pipet Ucu bir vakum hattına ekleme kaldırma ile yardımcı olabilir. Bu yoksa, bu süpernatant Pelet ayrılma durumunda taze bir tüp toplanan önerilmektedir.</li>
	<li>Süpernatant sonra ikinci yıkama kaldırın.</li>
	<li>Hücreleri yeniden kültürlü kullanıcının deneysel tasarım belirler, 2.12-2,14 adımları. Hücreleri hemen analiz için kullanılacaksa, aksi takdirde, hücre istenen protokol göre hazırlayın. Not: Tipik fonksiyonel analiz örneği Şekil 4' e eklenmiştir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+development+and+function+of+dendritic+cell+subsets+by+GM-CSF:+more+than+a+hematopoietic+growth+factor.">The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor.</a> Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+cytokine,+GM-CSF,+alters+the+developmental+outcome+of+murine+dendritic+cells.">The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells.</a> Eur J Immunol. , (2012).</li><li>van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+development+by+GM-CSF:+molecular+control+and+implications+for+immune+homeostasis+and+therapy.">Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy.</a> Blood. 119, 3383-3393 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+dendritic+cells.">Myeloid dendritic cells.</a> J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+development+and+maturation.">Dendritic cell development and maturation.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).</li><li>Pierre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+MHC+class+II+transport+in+mouse+dendritic+cells.">Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells.</a> Nature. 388, 787-792 (1997).</li><li>Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells:+antigen+presentation,+accessory+function+and+clinical+relevance.">Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).</li><li>Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+Grown+Bone+Marrow+Derived+Cells+Are+Composed+of+Phenotypically+Different+Dendritic+Cells+and+Macrophages.">GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages.</a> Mol Cells. 39, 734-741 (2016).</li><li>Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+developmental+stages,+kinetics,+and+phenotypes+exhibited+by+myeloid+cells+driven+by+GM-CSF+in+vitro.">Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro.</a> PLoS One. 12, e0181985 (2017).</li><li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c(+)MHCII(+)+Macrophages+and+Dendritic+Cells.">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42, 1197-1211 (2015).</li><li>Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+maturation+and+cross-presentation:+timing+matters!.">Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!.</a> Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).</li><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions.">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).</li><li>Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Dendritic+Cell+Maturation+in+the+Induction+of+Insulin-Dependent+Diabetes+Mellitus.">The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus.</a> Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).</li><li>Shortman, K., Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+and+inflammatory+dendritic-cell+development.">Steady-state and inflammatory dendritic-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).</li><li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking.">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li><li>Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+pro-DCs+and+pre-DCs+in+vitro.">Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro.</a> Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).</li><li>Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+myeloid+dendritic+cells+in+mouse+bone+marrow.">Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow.</a> Int Immunol. 15, 515-524 (2003).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311, 83-87 (2006).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CD8{alpha}-Positive+Dendritic+Cells+from+a+Common+Myeloid+Progenitor.">Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor.</a> Science. 290, 2152-2154 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çakışma var.

Bu iletişim kuralı yalıtım GM-CSF-driven yaratıcı ve öncü hücre tiplerinin çeşitli biyokimyasal deneyleri, hücresel işlev içinde vitroveya korumak içinde vivodeneyleri de dahil olmak üzere analizleri için yeterli sayıda kolaylaştırır. Bu yöntem güvenilir izolasyon ve erken geliştirme hem de bu farklı hücre tipleri para nereye hücrelerinin kimlik daha yaygın olarak etkinleştirme monosit kaynaklı dendritik hücre gelişimi alanında önemli bir ilerleme temsil eder. önceki ?...

Sitokin ile fare kemik iliği hücre kültürü çalışmalarının granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) yaygın bir yöntem olarak monosit kaynaklı dendritik hücreler (moDC; da inflamatuar DC) çok sayıda 1'oluşturmak için kullanılır, 2,3,4,5. Bu hücreler içinde a değişiklik-in dendritik hücre (DC) işlevi 6,7,8çalışmaların son derece yararlı olmuştur. Genellikle, bu fare kemik iliği hücreleri 6-8 gün boyunca kültürlü ve daha sonra dendritik hücre işlevi 5çalışma için kullanılır. Bu kültürler uzun çoğunlukla farklılaşmış moDC çoğunluğu oluşan homojen olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu 6-8 gün kültür dönemin sonunda, orada gerçekten çok moDC, hem de büyük bir alt kümesini farklılaştırılmış monosit kaynaklı makrofajlar (moMacs) 9,10,11açık hale gelmiştir. Kendi çalışmaları diğer alt kümeleri moDC öncüleri (moDP) ve monosit, gibi daha az gelişmiş hücre kültürlerinde düşük frekansta sonra bile 107 gün kalmasını gösteren bu bulgular daha da genişletmiştir. Böylece, çalışmalar bu sistem tarafından oluşturulan hücreler kullanarak dendritik hücreler (DC) işlevinin yanıt-e doğru daha geniş bir kohort hücre tiplerinin daha önceden takdir yansıtmak.
GM-CSF-oluşturulan moDC farklılaşma 12,13,14son aşamasında bu hücreler işleve ilişkin çalışma çok şey öğrendik. Bununla birlikte, önemli ölçüde bu gelişimsel yolu hakkında daha az 2,15,16 hücreleri ve nasıl ve ne zaman onlar özel sergi gibi işlevleri anlamak: patojen ilişkili moleküler yanıt Desenler (PAMPs), fagositoz, antijen işleme ve sunum 13ve anti-bakteriyel etkinlik. Yalıtım geleneksel Flt3L tahrik DC ataları ve hareketlenme öncesi ilk belirtiler çok sayıda için bir protokol bildirilen 17oldu. Yalıtım bu farklı nüfus elde kullanarak carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-(sayesinde bunun bölünen hücreler izlemek için) kemik iliği hücreleri lekeli ve Flt3L kültür 3 gündür. Hücreleri sonra hiza pozitif hücrelerinin tükenmiş ve içine yaratıcı ve öncü nüfus CD11c ifade 17tarihinde göre sıralanır. CD31 ve Ly6C 18tarihinde dayalı hücreleri sıralamak için DC erken ataları GM-CSF-driven kültür tanımlamak için Leenen'ın Grup tarafından başka bir yaklaşımı oldu. Ataları ve GM-CSF-driven moDC nın elde etmek için benzer bir yöntem oluşturmak için ilk hedefi oldu. GM-CSF tarafından oluşturulan belirli hücre tipleri nedeniyle, yaklaşım ve strateji geliştirme erken ve daha sonraki aşamalarında ifade edildi molekülleri ifade dayalı sıralama uyarlanmış. Biz sonuçta belirlenen Ly6C, CD115 (CSF-1 reseptör), ve CD11c bu hücre ayırt 10türleri için en iyi işaretler vardı.
Burada, birkaç farklı gelişimin yolu boyunca GM-CSF tarafından tahrik farklılaşma, hücre izolasyon için bir yöntem mevcut: ortak Myeloid dede (CMP), granülosit-makrofaj dede (GMP), monosit, monosit kaynaklı makrofaj (MoMac) ve monosit kaynaklı DC (MoDC). MoMac nüfus daha fazla dayalı MHC sınıf II ifade, düzeyde moDC habercisi nüfus (moDP) 10açığa ayrılmış olabilir. Biz Ly6C, CD115 ve CD11c ifade üzerinde göre bu 5 nüfus yalıtmak için (FACS) strateji sıralama yüksek hızlı bir floresan aktif hücre kullanmaktadır. O zaman bu hücrelerin fonksiyonel deneyleri PAMP stimülasyon yanıtlarını ifşa olarak muayene göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>HyClone</td><td>SV30014.04</td><td>to supplement complete medium and FWB</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>to supplement complete medium</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>MP Biomedical</td><td>190242</td><td>to supplement complete medium</td></tr><tr><td>75 mM Vacuum Filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>156-4045</td><td>to sterilize complete media</td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>to lyse red blood cell</td></tr><tr><td>HBSS buffer</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>to rescue leukocytes after red blood cell lysis</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco&#039;s</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>must be endotoxin free; chilled at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>35 &amp;micro;m Cell filter</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>to break apart clumps before running through cytometer.</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Biosource</td><td>PMC2011</td><td>usable concentration of 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Tissue cultured treated plate</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>for bone marrow cells after harvest</td></tr><tr><td>Anti-Ly6C, Clone HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115, Clone AFS98</td><td>Tonbo Bioscience</td><td>20-1152-U100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c, Clone HL3</td><td>BD Biosciences</td><td>557400</td><td>to differeniate CMP and MoDCs</td></tr><tr><td>MoFlo XPD Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>660517</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri Dish</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical tube</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Female; 10-20 weeks old</td></tr><tr><td>Biosafety Hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>8354-30-0011</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>23 G needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&amp;nbsp;R</td><td>eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10</td><td>BD Biosciences</td><td>Version 10</td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

generation of large numbers of myeloid progenitors and dendritic cell precursors from murine bone marrow using a novel cell sorting strategy

Fare kemik iliği granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak üretilen monosit kaynaklı dendritik hücreler (moDC) kültürleri son zamanlarda daha önceden takdir daha heterojen olduğu kabul. Bu kültürler rutin de monosit türetilmiş moDC makrofaj (moMac) ve monosit gibi hatta bazı az gelişmiş hücreler içerir. Bu iletişim kuralı gibi onlar geliştirmek, böylece özel işlevleriyle daha fazla soruşturma tutarlı bir yöntem kimlik ve birçok hücre tipleri bu kültürlerde mevcut ayrılması için sağlamak için hedeftir. Burada sunulan sıralama strateji hücreleri ilk dört nüfus Ly6C ve CD115, ifadeye dayalı GM-CSF-driven kültür geliştirdikçe ikisi de geçici hücreleri tarafından ifade edilir içine ayırır. Bu dört nüfus ortak miyeloid ataları veya Cumhuriyetçi millet Partisi (Ly6C-, CD115-), granülosit/makrofaj ataları veya GMP (Ly6C +, CD115-), monosit (Ly6C +, CD115 +) ve monosit kaynaklı makrofajlar veya moMac (Ly6C-, CD115 +) içerir. CD11c da içinde Ly6C-, CD115-nüfus iki popülasyonun ayırt etmek için sıralama strateji ekledi: CMP (CD11c-) ve moDC (CD11c +). Son olarak, iki örneğin alınma olasılığını daha da içinde Ly6C-, MHC sınıf II ifade düzeyine göre CD115 + nüfus ayırt. Monosit kaynaklı bir DC habercisi (moDP) daha yüksek MHC sınıf II ifade ederken MoMacs alt düzeyleri MHC sınıf II, hızlı. Bu yöntemi birkaç gelişimsel olarak ayrı nüfus sayıları güvenilir yalıtım fonksiyonel ve gelişimsel analizleri çeşitli için yeterli olanak sağlar. Biz bir tür işlevsel okuma, stimülasyon Pathogen-Associated moleküler desenleri (PAMPs) ile fark yanıtlarını bu hücre tiplerinin vurgulayın.

Bir çaba olarak birçok kanal analiz için kullanılabilir olası, canlı hücreler olarak tutmak için düzenli olarak ön ve yan dağılım, çok küçük ve çok parçalı Etkinlikleri (tipik bir kapı tüm 1A rakamnokta çizer uygulanır) hariç göre seçildi. Bu perdeleme strateji güvenilir bir şekilde ölü hücreleri hariç olup olmadığını belirlemek için 7-Amino actinomycin D (7-AAD) (Şekil 1B) ile lekeli. 7AAD ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy at JoVE.com

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

generation-large-numbers-myeloid-progenitors-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.0K Görüntüleme.  Auburn University. Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Video: Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Biyoloji

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of hematological pathologies. Despite the most relevant data that can be acquired using in vivo models or primary cultures, the low abundance of hematopoietic stem and progenitor cells considerably restricts the pool of suitable techniques for their investigation. Therefore, the use of cell lines allows sufficient production of biological material for the performance of screenings or assays that require large cell numbers. Here we present a detailed description, readout, and interpretation of proliferation and differentiation assays which are used for the investigation of processes involved in myelopoiesis and neutrophilic differentiation. These experiments employ the 32D/G-CSF-R cytokine dependent murine myeloid cell line, which possesses the ability to proliferate in the presence of IL-3 and differentiate in G-CSF. We provide optimized protocols for handling 32D/G-CSF-R cells and discuss major pitfalls and drawbacks that might compromise the described assays and expected results. Additionally, this article contains protocols for lentiviral and retroviral production, titration, and transduction of 32D/G-CSF-R cells. We demonstrate that genetic manipulation of these cells can be employed to successfully perform functional and molecular studies, which can complement results obtained with primary hematopoietic stem and progenitor cells or in vivo models.

Here detailed protocols for culturing the murine myeloid precursor 32D/G-CSF-R cell line, performing viral infections, and carrying out proliferation and differentiation assays are presented. This cell line is suitable for studying myeloid cell development, and the role of genes of interest in myeloid cell growth and neutrophilic differentiation.

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Gelişim Biyolojisi

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine induced differentiation of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineage cells. CD34+ cells are isolated from human umbilical cord blood and co-cultured with MS-5 stromal cells in the presence of cytokines. Immunophenotypic characterization of the stem and progenitor cells, and the differentiated myeloid lineage cells are described. Using this protocol, CD34+ cells may be incubated with small molecules or transduced with lentiviruses to express myeloid disease mutations to investigate their impact on myeloid differentiation.

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Here, we present a protocol for immunophenotypic characterization and cytokine induced differentiation of cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineages. The applications of this protocol include investigations on the effect of myeloid disease mutations or small molecules on myeloid differentiation of the CD34+ cells.

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...