Teknik destek için J. van de Gaar ve M. Vroomen (Maastricht University, Hollanda) teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, teşekkür etmek istiyorum ve E. Blaak kan ve doku biyopsisi sağlamak için bu iletişim kuralını ve sonraki deneyler ayarlama için kullanılan.

Visseral ve subkutan örnekleri tıbbi etik Komitesi Jessa hastane, Hasselt ve Hasselt Üniversitesi, Belçika, Helsinki Deklarasyonu doğrultusunda tarafından onaylanan çalışma kayıtlı konulardan alınmıştır.
1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>Collagenase çözüm<ol>
<li>1 g geçiyoruz Collagenase ben fosfat 10 ml serum fizyolojik (PBS, kalsiyum ve magnezyum olmadan) 100 mg/mL stok çözüm yapmak için arabelleğe alınmış. 200 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Collagenase XI 1 g 10 ml 100 mg/mL stok çözüm yapmak için PBS çözülür. 200 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Dnaz 10 mg dağıtılması ı yapmak a 10 mg/mL stok eriyik için PBS 10 mL. 180 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>100 µL Collagenase ekleyin ben (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) ve 90 µL Dnaz 10 mL DMEM Ham'ın F12 için ben (10 mg/mL). Collagenase çözüm her yalıtım için taze olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eritrosit lizis arabellek<ol>
<li>0,84 g NH4Cl ultrasaf su 100 ml geçiyoruz.</li>
		<li>PH 7.4 kullanmadan önce ayarlayın. Bir cam şişeye 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Eritrosit lizis arabellek buz kullanmadan önce yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS arabellek<ol>
<li>0.5 g sığır serum albumin (BSA) 100 mL % 0.5 BSA PBS elde etmek için PBS çözülür.</li>
		<li>65 mg NaN3 10 mM NaN%3 0.5 BSA PBS elde etmek için 100 mL % 0.5 BSA PBS çözülür. Bir cam şişeye 4 ° C'de çözümde mağaza</li>
		<li>Kullanmadan önce buzda yer FACS arabellek. Dikkat: NaN3 çok zehirli. Bir duman mahallede çalışma ve koruyucu gözlük ve eldiven NaN3işleme koruma için giymek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnsan IgG blok<ol>
<li>10 mg insan IgG 10 ml 1 mg/mL elde etmek için PBS çözülür. 100 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>İnsan IgG blok buz kullanmadan önce yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izolasyon SVF AT üzerinden
<ol><li>1 g biyopsi bir 50 mL santrifüj tüpü (örneğin, Falcon tüp) bir neşter ve transferi ile küçük parçalara (± 2 mm2) kesti. Her örnek, 10 mL collagenase çözeltisi ekleyin. Not: tamamen tüp kapağını kapatın ve kapağı ¼ geri döndürmek.</li>
	<li>Nazik (60 devir/dak) sallayarak altında bir su banyosu içinde 37 ° C'de 60 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Elde edilen süspansiyon 200 µM ile filtre ve yeni bir 50 mL santrifüj tüpü örnek toplamak. 7 mL PBS filtre durulama ve tüm hücreleri elde etmek için filtre üzerine ekleyin.</li>
	<li>280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Kayan adipocyte kesir pipetting tarafından kaldırın. Hücre Pelet SVF var. Not: SVF elde etmek için adipocyte kesir kaldırın. Çünkü bu sadece PBS ve değil kayan adiposit kaldırır tüm uç örnek batış kaçının.</li>
	<li>SVF PBS collagenase kaldırmak için süspansiyon 70 µM ile filtre, filtre 5 mL PBS ile durulayın ve 280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi 5 ml resuspend</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet 3 mL eritrosit lizis arabellek resuspend.</li>
	<li>Buz üzerinde 5 min için kuluçkaya. PBS 7 mL kuluçka sonra ekleyin.</li>
	<li>280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi</li>
</ol>3. boyama SVF Akış Sitometresi Analizi için
<ol><li>Hücre Pelet 90 µL 4 ° C FACS arabelleği dağıtılması ve 1 mg/mL insan IgG blok 10 µL ekleyin. Hücre süspansiyon 96 v-shape iyi plaka 2 Wells bölün. Plaka Buza koyun ve 15dk için kuluçkaya insan IgG blok izin.</li>
	<li>Yıkama ve plaka ile 280 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi için her örnek için 100 µL FACS arabellek ekleyin Süpernatant plaka baş aşağı bir düzgün hareket plaka dokunarak olmadan devrilme tarafından kaldırın. Not: kalan herhangi bir sıvı bir doku ile plaka üst plaka baş aşağı tutarak kaldırmak emin olun.</li>
	<li>Antikor kokteyller Tablo 1 ve Tablo 2' de açıklandığı gibi makrofaj ve DC alt kümeleri (FACS Masası 1) ve T ve B hücre alt kümeleri (FACS panel 2) için hazır olun. Tablo 1 ve Tablo 2 ' de anlatıldığı birimler antikor konsantrasyonları optimize sonra seçilir ve bir KDV veya uydu örnek için yeterli. Not: FACS Masası'nda 1, CD303 ve CD141 işaretleri onaylamak için bu CD11C+ CD11Bdüşük hücrelerdir DCs. Ancak, bu işaretler bir canlı/ölü boyama içerecek şekilde panelinden dışlamak için tavsiye edilir. Her iki FACS Masası 1 ve 2 CD303 panelinde 1 PE kanalı olarak hariç kullanılmayan ne zaman boyama canlı/ölü Fixable kırmızı ölü hücre leke Kit canlılığı ile kombine edilebilir. Üreticinin yönergelerine göre boyama canlılık gerçekleştirin.</li>
	<li>29,5 µL antikor FACS paneli 1 kokteyl Pelet ve 23 µL antikor FACS panel 2 kokteyl resuspend. Buz üstünde karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Her şey için 150 µL FACS arabellek eklemek ve ikinci bir yıkama adım gerçekleştirmek için hücre Pelet resuspend. 280 x g ve 4 ° c, 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant plaka baş aşağı devrilme tarafından kaldırın.</li>
	<li>150 µL % 1 formaldehit çözüm hücreleri düzeltmek için her şey için ekleyin. Hücre süspansiyon P200 pipet ile pipetting tarafından karşılık gelen FACS tüp her kuyudan aktarın. 7 gün karanlık up FACS tüpler 4 ° C'de depolayın. Not: Doğrudan ölçüm olanağı da sağlar. Her şey yerine % 1 formaldehit 150 µL FACS arabellek eklemek, karşılık gelen FACS tüpler için P200 pipet ile pipetting tarafından hücreleri aktarmak ve hücreleri analiz. Dikkat: Formaldehit çok toksiktir. Formaldehit çözümleri inhalasyon önlemek ve eldiven ve koruyucu gözlük koruma için bir duman başlıklı çalışırken hazırlayın.</li>
</ol>4. Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>İlk ölçüm önce bir günahı negatif kontrol ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarlamak için kullanın. Akış Sitometresi üretici yönergelerine göre voltaj ilgi tüm örneğin alınma olasılığını FSC ve SSC grafikte görünür ve enkaz ve canlı hücreleri arasında bir ayrım yapılabilir şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Üreticinin protokol sonrası antikor yakalama boncuk ile çok renkli tazminat çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
	<li>Eksi bir (FMO) denetimleri floresan antikor mix yaparak hazırlamak ancak bir antikor karışımından dışarıda. 8 antikor karışımları FACS paneli 1 ve 6 antikor karışımları FACS panel 2 için oluşturma her antikor için bunu. Bu FMO antikor karışımları bu protokol için daha önce açıklandığı gibi SVF leke için kullanılır.</li>
	<li>Tüm FMO denetimleri ölçmek ve gating stratejisi FMO denetimlere dayalı ayarlayın. FMO denetimleri mümkün auto-floresan hücreleri algılamak için kullanır. Not: bir antikor karışımından kaldırarak, bu kanalda tespit herhangi bir floresan arka plan/autofluorescent sinyal düzeydir. Bu nedenle, farklı FMO karşılaştırarak FACS sonuçları denetlemek, gates belirli nüfus gatings pozitif hücreleri temel alan ve auto-floresan üzerinde temel almayan sağlanması üzerinde çizilebilir.</li>
	<li>Akış Sitometresi yerleştirerek ve ölçüm başlamadan önce 800 rpm'de girdap FACS tüpler. Not: En az 50.000 olayları canlı kapısında yeterince hücre her subpopulation ölçülür sağlamak için önerilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance:+cells,+cytokines,+and+chemokines.">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).</li><li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile.">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li><li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding.">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li><li>Han, J. M., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+in+obesity-associated+adipose+inflammation.">Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation.</a> J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice.">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity.">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).</li><li>Koh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+forms+profound+vascular+network+through+the+dynamic+reassembly+of+blood+endothelial+cells.">Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).</li><li>Peinado, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stromal-vascular+fraction+of+adipose+tissue+contributes+to+major+differences+between+subcutaneous+and+visceral+fat+depots.">The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots.</a> Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).</li><li>Leggate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+inflammatory+and+prominent+proteomic+changes+in+plasma+and+adipose+tissue+after+high-intensity+intermittent+training+in+overweight+and+obese+males.">Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+in+human+adipose+tissue:+link+with+morbid+obesity,+inflammatory+status,+and+diabetes.">Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).</li><li>Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fats,+inflammation+and+insulin+resistance:+insights+to+the+role+of+macrophage+and+T-cell+accumulation+in+adipose+tissue.">Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue.</a> Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).</li><li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization.">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li><li>Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages:+phenotypic+plasticity+and+diversity+in+lean+and+obese+states.">Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).</li><li>Wentworth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+CD11c+CD206++adipose+tissue+macrophages+are+associated+with+insulin+resistance+in+human+obesity.">Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity.</a> Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).</li><li>Wouters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+classical+monocytes+are+associated+with+CD11c++macrophages+in+human+visceral+adipose+tissue.">Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue.</a> Sci Rep. 7, 42665 (2017).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+contributes+to+false-positive+intracellular+Foxp3+staining+in+macrophages:+a+lesson+learned+from+flow+cytometry.">Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Bu yöntemler KDV SVF yalıtmak anlatan ve oturdu ve bu dokularda bağışıklık hücreleri göreli miktarda ölçmek. Ayrıca, belirli hücre tipleri üzerinde işaretleri ifade belirleme yöntemleri devlet.
Akış Sitometresi doku bağışıklık hücrelerinin fenotip dokuların immünolojik devlet için güçlü bir tekniktir. Doku bağışıklık hücreleri miktar birçok uygulamaları olabilir. Sonuçlar açıklandığı gibi belirli bağışıklık hücreleri (örn, vs obez yalın) hasta grupları arasında varlığı karşılaştırmak mümkündür. Buna ek olarak, aynı zamanda Akış Sitometresi aynı hastaların kan gerçekleştirerek, dolaşan hücre ve doku hücreleri arasındaki ilişkileri araştırılması. Bu uygulama ile biz monosit dolaşan belirli bir alt pro-inflamatuar CD11C ile ilişkili olduğunu belirlemek mümkün+ yağ doku makrofajlar16.
Çok sayıda mevcut floresan antikor Akış Sitometresi çok yönlü yapmak gibi ayarlamalar açıklanan protokol uygulamaları genişleyecektir. Farklı antikorlar ile neredeyse tüm hücre tiplerinin ayırt edilebilir ve birçok işaretleri ifade tespit edilebilir. Ayrıca işaretleri intracellularly floresan antikor hücre içi bağlantısına izin için hücre zarının permeabilizing tarafından leke mümkündür. Bu özellikleri ötesinde aşırı Basitleştirilmiş M1 ve M2 makrofaj alt türlerinden çok farklı makrofaj nüfusun ayrım sağlar. Yüzey marker ifade ölçümü yanı sıra, intracellularly bilgi makrofaj işlevselliği sağlayan proteinler (Yani, sitokinler) Boyanabilen. Ayrıca, nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri Ki67 gibi nükleer silahların yayılmasına karşı oranları ölçmek için kullanılır. Açıklandığı gibi makrofajlar ve DCs arasında ayrım DC işaretlerinin MFI düzeylerine göre. CD68 gibi bir genel makrofaj marker makrofaj Masası (FACS panel 1) dahil edilebilir. Ancak, CD68 tercih değildir ve protokol uzanacak hücre membran intracellularly gerektiren permeabilization lekeli gerekir. Diğer makrofaj işaretleri CD163 ve CD206 veya CD11c, ikincisi burada sunulan makrofaj panelinde varlık bütünleşmek gibi alt işaretleri vardır.
Bizim FACS paneller, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için bir işaretleyici dahil değildi çünkü o ölü hücreleri daha doğru bir dışlama FSC ve SSC kullanımı daha bırakmak hangi tercih olacaktır. Sık kullanılan DNA canlılığı boyalar propidium iyodür (PI) veya 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) yanı sıra ücretsiz Amin boya canlı/ölü Fixable ölü hücre leke kiti gibi farklı boya renk seçenekleri olan tepki boyama. Ancak, PI ve DAPI ne zaman hücreleri fixing kullanılamaz. İletişim kuralında açıklandığı gibi canlı/ölü Fixable kırmızı ölü hücre canlılığı boyama her iki panelleri strateji çoğunluğuna genel FACS etkilemeden entegre edilebilir.
Buna ek olarak, verileri canlı hücreleri tüm veri göreli anlamına gelir yüzdesi olarak ifade edilir. Yalnızca bir tam girerek, Akış Sitometresi hücre sayısı bilinen her hücre tipi tam numaraları belirlemek mümkün. Hücreleri yaklaşık bir sayısını SVF kesir hücrelerde sonra sayım sayım odası kullanarak hesaplanan. Ancak, bu sayı SVF ayırmak için kullanılan biyopsi doku miktarı için ayarlanacak olurdu, ama bu, obez için yalın karşılaştırırken sınırlamaları vardır. Onlar lipidler ile doldurulur ve büyük ölçüde genişlettik obez AT benzer bir kitle daha az adiposit oluşur. Bu bir küçümseme veya adipocyte, gram başına bağışıklık hücrelerinin sayı olarak gösterilmesini sağlar Eğer bağışıklık hücre sayının neden olabilir.
İnsan çalışmalarda hastaların eklenmesi genellikle büyük önem deneysel prosedürler standardizasyon yapmak zaman uzun bir süre içinde yapılır. Akış Sitometresi veri hastalar arasında karşılaştırma için birkaç seçenek vardır. Bu protokol için açıklandığı gibi hücreleri ölçüm analiz çeşitli örneklerinin aynı gün izin önce düzeltilebilir. Bu da onları boyama, boyama yordamı tüm örnekleri arasında eşit olarak sağlar ancak hücre canlılığı etkilenebilir önce SVF dondurarak elde edilebilir. Son olarak, Ayrıca bu çalışmada istihdam, tazminat düzeyleri yüklemek için floresan boncuk vardır ve sitometresi izleme boncuk iki haftada sitometresi günlük ölçümleri standartlaştırmak için kullanılmıştır. Bu son seçenek en verimli olur ne zaman uzun bir zaman aralığını kapsayan bir çalışma örnekleri ölçme.
Akış Sitometresi için kısıtlayıcı bir faktör genel Floresans kullanımıdır. Aynı anda tespit edilebilir floresan etiket sayısını emisyon spectra birbiri üzerine çakışması nedeniyle sınırlıdır. Ancak, akıllı FACS paneli geliştirme ve çeşitli antikor kokteyller KDV veya uydu örnek başına kullanımı ile bu sorun bu protokol için açıklandığı gibi üstesinden gelebilir. Önemli bir FACS paneli geliştirme FMO denetimleri yönüdür. Panelin bir dışında tüm antikorları kullanarak, FMO tam paneli ile karşılaştırırken potansiyel autofluorescence düzeyleri takdir edilebilir. Bu doğru nüfus çoğunluğuna izin verir ve yeni bir FACS panel ayarlarken bu yordamları yapılmalıdır. Buna ek olarak, yeni nesiller FACS cihazların en fazla 50 parametreleri aynı anda birçok özellikleri tespiti hücre başına izin algılayabilir. Hücreleri, özellikle makrofajlar autofluorescence floresan yönü ile ilgili başka bir sorun var. FACS lazer hücrelerle (özellikle ile 488 nm dalga boyu uyarma) uyarma sonra bu hücreleri floresan bir sinyal yayarlar (esas olarak < 640 nm) örtüşme antikor emisyon spectra ile etiketleri bu otelde17,18. Bunun için hesabınıza, günahı hücreleri her kanaldaki autofluorescence belirlemek için ölçülmelidir. Bu bilgiyle, fluorochromes autofluorescent sinyal aşan bir sinyal gücü görüntüleyen seçilmesi gerekir. Bu autofluorescent arka plan sinyal nüfusun gating stratejisi belirlerken dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, bu protokolü ve akıllı FACS panel tasarım uygulama tarafından derinlik fenotip makrofaj alt içinde mümkündür. Yeni farklı AT makrofajlar ve işlevlerine ile karakterizedir.

Obezite ile düşük dereceli AT ile karakterize iltihap1 ve pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri (KDV, oturdu), visseral ve subkutan infiltrasyonu. Pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri KDV birikimi tip 2 diyabet2geliştirmek için birincil bir risk faktörü olan insülin direnci yol açar. Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sisteminin bağışıklık hücreleri makrofajlar, nötrofiller, mast hücreleri gibi obez AT CD4 bulunur+ ve CD8+ T-hücre ve B-hücreleri3,4,5,6 ,7. Endotel hücreleri, stromal hücreler, adipocyte ataları, fibroblastlar ve perisitlerden, bu bağışıklık hücreleri SVF8 oluşturmaktadır ve AT9pro-inflamatuar maddeler ana kaynaktır.
AT inflamatuar durumunu yaygın olarak Western blot10, qPCR11ve immünhistokimya11gibi teknikleri tarafından araştırıldı. Ancak, bu teknikler, tüm AT, adipositler ve SVF kullanıldığında kullanılır. Bu zor tutar ve bağışıklık hücreleri AT mevcut alt kümelerine belirlemek yapar. Bağışıklık hücreleri tanımlamak ve onları, makrofajlar gibi kategorilere ayırmak için çeşitli hücre işaretleri var. Makrofajlar önemli heterojenite içinde işlev ve hücre yüzey marker ifade12i göster. Bu nedenle, sık sık iki makrofaj nüfus kategorize edilir: M1 ve M2. M2 makrofajlar genellikle alternatif olarak aktif makrofajlar12,13 denir ve yalın, metabolik olarak normal insanlar14AT bulunur. Ancak, obezite sırasında fenotipik anahtarı M2 makrofajlar M1 makrofajlar için oluşur. Bunlar klasik makrofajlar CD11C12 hızlı ve ölü adiposit taç benzeri yapıları13oluşturmak üzere birikir M1 aktif. Bu gösterilmiştir o CD11C+ AT makrofajlar insülin eylem zayıflatabilir ve obez insanlar15insülin direnci ile ilişkili. AT M1 ve M2 makrofajlar tanımlamak için immünhistokimya bir seçenektir. Bu teknik doku makrofajlar konumu hakkında bilgi verir. Ancak, bir boyama kullanılan işaretleri sayısı sınırlar. Ayrıca, ölçmek zordur. Bu nedenle, farklı bağışıklık hücre alt kümeleri KDV ve uydu mevduat araştırmak için biz bir Akış Sitometresi yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım bize hücre alt kümeleri tanımlamak ve her alt AT yataklarında mevcut sayıları saymak için bir Akış Sitometresi Analizi ile hücre başına birden çok işaretçileri kullanmak için fırsat verir.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>5660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)-Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657-1g</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-100</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.06688.0100</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;M syringe Filcons</td><td>BD Biosciences</td><td>340613</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;M filter</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Fc block / human IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14506</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Merck</td><td>1.04003.2500</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV421</td><td>Biolegend</td><td>301324</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>561807</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>CD56-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>562794</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>337218</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>CD19-BV421</td><td>Biolegend</td><td>302234</td><td></td></tr><tr><td>CD3-V500</td><td>BD Biosciences</td><td>561416</td><td></td></tr><tr><td>CD56-APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>641400</td><td></td></tr><tr><td>CD303-PE</td><td>Biolegend</td><td>354204</td><td></td></tr><tr><td>CD141-APC</td><td>Biolegend</td><td>344106</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 v-shape well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>PBS PH 7.4</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>IgG from human serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rat Ig, &amp;kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552844</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ig, &amp;kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>L23102</td><td></td></tr><tr><td>IKA&amp;nbsp;MS 3 basic shaker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z645028-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry

Subkutan ve viseral Yağ dokusundan (AT) mevduat bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu tip 2 diyabet gibi obezite ile ilişkili komplikasyonların gelişmesine katkıda bulunan bir düşük dereceli iltihabı neden olur. Nicelik ve nitelik itibariyle mevduat insan bağışıklık hücre alt kümeleri araştırmak için bir Akış Sitometresi yaklaşım geliştirdik. Stromal vasküler kesir (SVF), bağışıklık hücreleri içeren subkutan ve visseral biyopsi, collagenase sindirim tarafından izole edilmiştir. Adiposit Santrifüjü sonra kaldırılır. SVF hücreleri bağışıklık hücre alt kümeleri arasında ayırt etmek için seçilen ve Akış Sitometresi kullanılarak analiz birden çok membran bağlı işaretler için lekeli. Bu yaklaşım, pro ve anti inflammatory makrofaj alt kümeleri, bir sonucu olarak dendritik hücreler (DCs), B-hücreleri, CD4+ ve CD8+ T-hücreleri, ve NK hücreleri tespit ve sayılabilir. Bu yöntem AT bağışıklık hücreleri ve her belirli alt miktarı hakkında ayrıntılı bilgi verir. Mevcut çok sayıda floresan antikor olduğundan, Akış Sitometresi yaklaşımımız çeşitli diğer hücresel ve hücre içi işaretleri ilgi ölçmek için ayarlanabilir.

KDV'den izole ve oturdu SVF Akış Sitometresi kullanılarak ölçüldü. Akış Sitometresi ölçümleri hücresel işaretleri (şekil 1A ve 1B) göre farklı hücre popülasyonlarının gösterilen araziler oluşturmak. İlk olarak, komplo tarafından ileri genişliği (FSC-W) dağılım ve toplamları daha fazla analiz tek hücre düşük FSC-W. çoğunluğuna tarafından elimine edilebilir dağılım alanı (FSC-A), hücre ileri Sonraki, canlı hücreler seçilir ve hücresel enkaz hariç, doğru boyut ve karmaşıklık FSC kullanarak hücreleri çoğunluğuna tarafından-bir ve yan dağılım alanı (SSC-A), anılan sıraya göre. Ölü hücreleri küçük ve bu nedenle ayrı bir nüfus olarak görünür küçük bir ile FSC-A. Sonraki, bağışıklık hücreleri pan-lökosit işaretçiyi CD45 (Panel 1 ve 2, şekil 1A) kullanımı ile seçildi. Diğer bağışıklık hücreleri T hücreleri gibi (CD3), B-hücreleri (CD19), nötrofiller makrofajlar analiz etmek için (CD66b+ CD11b+), ve NK hücreleri (CD56) farklı antikorlar bu hücreler hedefleme kullanarak ama aynı ile daha fazla çözümleme hariç fluorochrome. Kalan hücrelerin daha fazla alt bölümü CD11b ve CD11c ifadesine dayanıyordu. Bu aşağıdaki nüfus sonuçlandı: CD11b+ CD11c+ makrofajlar, CD11b+ CD11c- makrofajlar ve CD11bdüşük /- CD11c+ DCs (FACS Masası 1, şekil 1B). Ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) ölçümü izin CD303 ifade miktar (plazmasitoid DC marker) ve CD141 (DC marker), CD11b üzerinde+ CD11c+ makrofajlar ve CD11bdüşük /- CD11c+ DCs. Her iki işaretleyiciyi de ifade edildi CD11b içinde daha yüksekdüşük /- CD11c+ hücreleri onaylayan bu CD11bdüşük /- CD11c+ hücreleri olduğunu DCs (şekil 1 c).
CD45+ hücreleri (şekil 1A) T-hücre ve B-hücre ayrıldı CD3 ve CD19, sırasıyla kullanarak. T-hücreleri T yardımcı hücreleri alt (CD4+) ve sitotoksik T-hücreleri (CD8+). Son olarak, CD3-CD19-hücreler NK hücreleri işaretçisi CD56 kullanarak ölçmek için çizilen (FACS panel 2, şekil 1 d). Her kapı hücre sayısı sayısal ve bütün canlı hücreler (Tablo 3) bu hücre türü yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir.
Tüm ortalama hesaplama sağlayan her konu grubu içinde örneğin özel bir bağışıklık hücreye, Yani, pro-inflamatuar CD11b bolluk görüntüleme yağsız ya da obez erkek konular için canlı hücreler yüzdesi hesaplanabilir+ CD11c+ makrofaj visseral AT içinde (Şekil 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> Şekil 1. Strateji visseral yağ dokusunun çoğunluğuna FACS. (A) FACS arsa ileri dağılım genişliği yoğunluğu (FSC-G) ve (FSC-A) tarafından bir FACS komplo takip sadece tek hücreleri (kırmızı) seçmek için bir kapı içeren ileri dağılım alan yoğunluğu ile tüm olayların (siyah) dayalı FSC-A ve yan dağılım alan yoğunluğu üzerinde (SSC-A) canlı hücreleri (açık yeşil) seçerek bir kapı içeren. Sonraki SSC-A ile arsa ve CD45 floresan yoğunluğu içeren tüm CD45 seçerek bir kapı+ (bağışıklık) hücreleri (mavi). (B) FACS CD19, CD3, CD66b ve CD56 floresan yoğunluğu CD11b floresan yoğunluğu ve CD19, CD3, CD66b ve CD56 negatif tüm hücreleri seçmek için bir kapısı (kahverengi) daha fazla nüfus lige karşı bir komplo. Sonraki komplo CD11b ve CD11c floresan yoğunluğu dayalı olarak daha fazla alt bölümü. Gates CD11b içeren görüntülenir+ CD11c+ makrofajlar (koyu yeşil), CD11b+ CD11c- makrofajlar (mor) ve CD11bdüşük /- CD11c+ dendritik hücreler (mavi). (C) CD11b tutarı+, CD11c+, veya CD11bdüşük /- CD11c+ CD303 ve CD141 ve ortalama karşılık gelen miktar için floresan yoğunluğu (x ekseni) düzeylerinin görüntüleme hücreleri (y ekseni) Floresan yoğunluğu (MFI). Önceki CD45 görüntüleme (D) FACS arsa+ için her iki CD3 T-hücreleri (macenta), B-hücreleri (koyu yeşil) ve sigara autofluorescent hücreleri (yeşil) negatif seçme gates içeren CD3 ve CD19 floresan yoğunluğu dayalı nüfus (mavi) ve CD19. Aşağıdaki çizim CD4 ve CD8 Floresans CD4 seçme gates ile dayanır+ (açık yeşil) ve CD8+ (macenta) T-hücreleri. Aynı bir perdeleme strateji deri altı yağ dokusu için kullanılır. Aynı bir perdeleme strateji deri altı yağ dokusu için kullanılır. Bu rakam Wouters vd değiştirildi 16 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> Şekil 2. Obez KDV içeren daha fazla pro-inflamatuar makrofajlar. CD11b miktarı+ CD11c+ makrofajlar tüm canlı hücreler yalın ve obez erkeklerin KDV yüzdesi olarak sundu. Tüm veri anlamına gelir ± SEM vardır; n = 20 için yalın ve n = 31 için obez. p ≤ 0,01 yalın vs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td>Tanım hedef</td>
			<td>Mevcut</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Miktar</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>myeloid integrin marker</td>
			<td>granülosit, monosit/makrofajlar, dendritik hücrelerdüşük ve doğal katil hücreler</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>ortak B hücresi antijen</td>
			<td>Blastoid B hücre ve plazma B hücre için pro-B hücre b hücre gelişimi</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>ortak T hücre antijen</td>
			<td>T lenfositler, doğal katil T hücreleri ve timositleri</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>carcinoembryonic antijen (CEA) üyesi-glikoprotein ailesi gibi</td>
			<td>granülosit</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>ağır glikozile yapışma protein</td>
			<td>doğal katil hücreler ve doğal katil T hücreleri</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>tip II transmembran glikoprotein</td>
			<td>plazmasitoid dendritik hücreler</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>201</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>thrombomodulin</td>
			<td>monosit/makrofajlardüşük, dendritik hücre subpopulation</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>transmembran glikoprotein yazın; integrin αx</td>
			<td>monosit/makrofajlar, dendritik hücreler, granülosit, doğal katil hücreler, B ve T hücre alt grubunu</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>ortak lökosit antijen</td>
			<td>lenfosit, monosit, granülosit, eozinofil ve timositleri dahil olmak üzere tüm insan lökosit</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS arabellek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Antikor için kokteyl FACS panel alt kümeleri makrofaj ve dendritik hücreler örneğin alınma olasılığını belirlemek için 1. Bir örnek analiz için açıklanan antikor miktarıdır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td>Tanım hedef</td>
			<td>Mevcut</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Miktar</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>ortak B hücresi antijen</td>
			<td>Blastoid B hücre ve plazma B hücre için pro-B hücre b hücre gelişimi</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>ortak T hücre antijen</td>
			<td>T lenfositler, doğal katil T hücreleri ve timositleri</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>ağır glikozile yapışma protein</td>
			<td>doğal katil hücreler ve doğal katil T hücreleri</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Ig süper, tip ı transmembran glikoprotein</td>
			<td>T yardımcı hücresi, timositleri, monosit/makrofajlar, tip II doğal katil T hücreleri</td>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>RPA-T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Α-alt disülfür bağlı bimolecular kompleks</td>
			<td>sitotoksik T hücreleri, timositleri, doğal katil hücre alt grubunu</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>ortak lökosit antijen</td>
			<td>lenfosit, monosit, granülosit, eozinofil ve timositleri dahil olmak üzere tüm insan lökosit</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS arabellek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Antikor için kokteyl FACS paneli 2T ve B hücre popülasyonlarının tanımlamak için. Bir örnek analiz için açıklanan antikor miktarıdır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Makrofaj paneli</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçidi adı</td>
			<td># Hücreleri</td>
			<td>% canlı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tek hücre</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>canlı</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>döküm-
</td>
			<td>771</td>
			<td>7,36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C- CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0,99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11Bdüşük /-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0,14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T-hücre, B-hücresi, NK hücre paneli</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçidi adı</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>% canlı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tek hücre</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Canlı</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK hücreleri</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25,56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>40'lı</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0.54</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. Farklı hücre tipleri KDV bağışıklık Hücre bolluğu. Her kapı hücre sayısı ve farklı hücre tipleri yüzdesi dayalı canlı hücreler toplam miktarı.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry at JoVE.com

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K Görüntüleme.  MUMC. Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Video: Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin<em&gt; İn Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Biyomühendislik

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Tıp

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

Hücre Fenotimi ve Sekretom Karakterizasyonu için İnsan Yağ Dokusu Mikro-parçalanma

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...