Yazarlar Tammo Reisewitz el yazması ve hem Mako Hayashi ve Sayuri Hagiwara dikkatli ekimi için eleştirel okuma ve Siyanobakteriler, görüntü işleme için Yoshitaka Kimori, Chihong şarkı, Naoyuki Miyazaki ve Miyoko gözlem için teşekkür ederiz Nagayoşi yapıları bölümleme ile yardım ettiğin için. Bu eser için Fizyolojik Bilimler (NIPS) Y.K. için ulusal Enstitü ortak çalışma programı tarafından desteklenen

1. zaman uyumlu Siyanobakteriler kültürünün
<ol><li>S. elongatus PCC 7942 %1,5 (w/v) agar ve %0,3 (w/v) sodyum thiosulfate8içeren steril BG 11 plaka (içinde 9 cm steril plastik petri kabına) üzerinde kültür.</li>
	<li>Tabakları bir büyüme Odası 23 ° c ile 50 µE/m2/s ve 12 h ışık/12 s karanlık döngüleri tabi bir ışık şiddeti yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri üzerine taze BG11 ağar kaplamalar haftada bir kez transfer. Not: Kültürler agar üzerinde yeşil şeritler halinde görünür bu kültür koşul altında bir hafta sonra aktif Proliferasyona hücreleri.</li>
	<li>Yeşil kümeleri bir alev sterilize tel döngü ve çizgi içeren hücrelerin hücre bir taze BG11 agar plaka üzerine al. Temiz bir bankta bunu.</li>
</ol>2. izleme tarafından floresans mikroskobu
<ol><li>6 gün agar tabakta kültürlü hücreleri DNA sıkıştırma gözlemlemek için kullanın. Hücreleri plaka ışık dönemin sonunda hücrenin üzerine dökülen 1 mL tarafından 0.2 M Sükroz çözeltisi toplamak. Böylece hücrelerin çoğu toplanan çözüm hücreleri dökülen yineleyin. Askıya-hücre çözümü DNA boyama için mikro bir tüp içine aktarın.</li>
	<li>DNA 500 µL askıya alınan hücre çözüm 1 µg/ml nihai bir konsantrasyon için mikro bir tüp boya (Örneğin Höchst 33342) çözüm boyama ekleyin. Daha sonra tüp 10 min için karanlıkta tutmak.</li>
	<li>2.000 x g tortu için de 1 dk. için hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve bir yoğun hücre süspansiyon elde etmek için 0.2 M Sükroz çözüm 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Bir slayt cam için lekeli hücreleri içeren çözüm 1 µL transfer için bir kapak kayma koymak ve 100 X ve daldırma yağ bir büyütme ile bir objektif lens kullanarak UV filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop ile gözlemlemek.</li>
	<li>DNA sıkıştırma en hücreleri bu noktasında görülmektedir onaylayın, sonra örnek dondurucu adım için hazır olun.</li>
</ol>3. örnek Cryo-HVET için dondurma
<ol><li>Dalma-donma aygıtı ayarlama. Sıvı azot ile tank doldurmak ve cryo-odası soğutma tankı ve odası ile bir Teflon tüp bağlandıktan sonra başlar.</li>
	<li>Sıvı azot sıcaklık odasına aşağı soğutma sonra odanın içinde bir küçük bakır pota sıvı etan doldurun. Sıvı etan patlayıcı olduğu için işlem sırasında gözlük.</li>
	<li>Kızdırma boşaltma delikli bir karbon kaplı icin karbon tarafında kılavuz (delikli ızgara) 30 s 50 plazma iyon bombarder kullanarak anne.</li>
	<li>1 µL BSA altın izleme uygulamak (15 nm) delikli ızgarasına indirgeme bir işaretleyici olarak.</li>
	<li>2.5 µL aliquot hücrelerinin DNA düzenleme aşamasında delikli ızgarasına uygulanır. Bir filtre kağıdı fazlalık çözümüyle kapalı leke. Kılavuz kullanarak bir dalgıç dalma dondurucu cihaz hemen sıvı etan Dalma.</li>
	<li>Onlar incelenir kadar donmuş ızgaralar sıvı azot depoda saklamak.</li>
</ol>4. Cryo-HVET
<ol><li>1 yüksek gerilim, HVEM kurmak MV.</li>
	<li>Cryo-numune tutucu-150 ° c cryo-iş istasyonu içinde sıvı azot ile precooled HVEM için dondurulmuş kılavuzunda mount ve HVEM yükleyin. Buz tarafından kirlenmesini önlemek için dikkatli olun.</li>
	<li>1, daha düşük büyütmede görüntüleme alanı seçme 000 X. Eucentric z ekseni yüksekliğini ayarla.</li>
	<li>Örneği Sahne Alanı'na-60 ° eğim ve tepki devirme dönme kaldırın.</li>
	<li>Bir büyütme 10, hedef konumda yakın odak ayarlamak 000 X. Ayarla bir 6-10 µm odaklı görüntü sapma tarafından odak noktası altında. Görüntüleme için doz 2 e-/Å-2 için ayarla veya önceden numune üzerinde daha az.</li>
	<li>HVEM görüntü ekranda akım yoğunluğu tarafından elektron doz ölçmek. Fotoðraf bir elektron film veya dijital kamera odaklama işleminin olduğu gibi aynı büyütmede tarafından.</li>
	<li>Tilt görüntüleri el ile (4.5) olduğu gibi aynı yordam tarafından-60 ° ila + 60 ° 2 ° ila 4 ° tilt açı artışı, toplamak. Not: içinde birçok modern elektron mikroskoplar, tilt serisi edinimi bir dijital fotoğraf makinesi kombinasyonu tarafından otomatikleştirilmiştir. Bu durumda, kullanım kılavuzu izleyin. Negatif ince tabaka için için bir su tankında tam güçte geliştirici kullanarak Geliştirici 20 ° C'de 12 dk filmler geliştirmek ve düzeltmek bir fixer 10 dk. dijital ortama için 4000 dpi (0.635 nm/piksel görüntü üzerinde) bir çözünürlükte filmler düz yataklı tarayıcı kullanarak. Bir dijital fotoğraf makinesi söz konusu olduğunda toplanan görüntüleri doğrudan sonraki görüntü işleme adımının için tabi. Gerekirse, iki ila dört binning (boyutu azaltma faktörü) ve ilgili yazılım (Örneğin ImageJ) kullanarak bir Medyan filtresi tarafından görüntü boyutunu azaltmak.</li>
</ol>5. tomografik imar
<ol><li>Komut "tif2mrc" veya "newstack" but yazılım9' kullanarak görüntüleri eğimli bir yığın görüntü dosyasından tek tek yapmak.</li>
	<li>BUT içinde eTomo GUI yazılım başlatın ve görüntü parametreleri ayarlayın: piksel boyutunu, indirgeme çapı, görüntü döndürme, vb. Daha sonra komut dosyaları oluşturun.</li>
	<li>Malzemeler, tablolarda listelenen yazılımlar göre bireysel programları çalıştırmak nerede tilt serisi (bir ortalama artık hata ile 0.5 daha az) indirgeme işaretçileri kullanarak hizalanır. Son olarak, but içinde SIRT algoritmasıyla bir 3D tomogram yeniden.</li>
	<li>Faiz (ROI) bölgesinin tomogram ayıklamak ve denoise filtre kullanarak denoise: bir anizotropik difüzyon but, EMAN10ikili bir filtre veya matematiksel bir morfoloji filtre11, vb, uygun parametrelerle birlikte karşıtlığı artırmak için.</li>
</ol>6. ayrılmasını faiz özelliği
Not: aşağıda açıklanan yordamı yazılım kullanılan (bkz: Malzemeler tablo) özgüdür ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. Onların Kullanıcı kılavuzuna başvurun.
<ol><li>3B görüntüleyici penceresinde Amira yazılım tomogram dosyasını açın ve bir OrthoSlice oluşturmak.</li>
	<li>Segmentasyon Düzenleyicisi penceresinde, yeni bir "etiket alan" seçerek bir bölümleme dosyası oluşturun.</li>
	<li>El ile ilgi (FOI) özelliğinin kenarlığı izleyin. Bütün tomogram dilimleri ile FOI izleyin. İkinci FOI için yeni bir "malzeme" oluşturmak ve aynı işlemi yineleyin.</li>
	<li>"SurfaceGen" menüsünden seçerek bir yüzey işleme oluşturmak. Kesimli birimin görselleştirmek için "SurfaceView" menü. Taşımak, döndürmek ve 3B cilt yakınlaştırmak için 3D Görüntüleyici penceresinde araçları kullanın.</li>
	<li>Otomatik bölümleme için Sihirli Değnek aracını kullanın. Bir nesne üzerinde tıklatın ve görüntü ve maskeleme böylece tam özellikleri tarafından seçilen değer aralığını kapsayacak şekilde kaydırıcıları ayarlayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, R. M., Williams, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+gene+transcription+imparted+by+chromosome+compaction+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+elongatus.">Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).</li><li>Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyanobacterial+circadian+clock+based+on+the+kai+oscillator.">A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator.</a> CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).</li><li>Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+polyphosphate+bodies+and+DNA+during+the+cell+division+cycle+of+Synechococcus+elongatus+PCC+7942.">Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942.</a> Plant biol. 16 (1), 258-263 (2014).</li><li>Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+compacted+DNA+in+cyanobacteria+by+high-voltage+cryo-electron+tomography.">Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography.</a> Sci. Rep. 6, 34934 (2016).</li><li>Koster, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+molecular+and+cellular+electron+tomography.">Perspectives of molecular and cellular electron tomography.</a> J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).</li><li>Lu&#269;i&#263;, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+The+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ.">Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ.</a> J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Adsorption+of+Cyanophage+P-SSP7+onto+Marine+Prochlorococcus.">Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus.</a> Sci. Rep. 7, 44176 (2017).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+assignments,+strain+histories+and+properties+of+pure+cultures+of+Cyanobacteria.">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria.</a> J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).</li><li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy.">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).</li><li>Kimori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+image+processing+for+quantitative+shape+analysis+of+biomedical+structures:+effective+contrast+enhancement.">Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement.</a> J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).</li><li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson, ., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions.">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> J. Visual. Exper. 76, e50386 (2013).</li><li>Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography.">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicros. 146, 39-45 (2014).</li><li>Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+thick+sections+of+nervous+tissue+with+energy-filtering+transmission+electron+microscopy.">Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 183, 89-101 (1996).</li><li>Bouwer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+most-probable+loss+tomography+of+thick+selectively+stained+biological+specimens+with+quantitative+measurement+of+resolution+improvement.">Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement.</a> J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).</li><li>Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+the+TEM+and+SEM.">Radiation damage in the TEM and SEM.</a> Micron. 35 (6), 399-409 (2004).</li><li>Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volta+potential+phase+plate+for+in-focus+phase+contrast+transmission+electron+microscopy.">Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zernike+phase+contrast+cryo-electron+microscopy+and+tomography+for+structure+determination+at+nanometer+and+subnanometer+resolutions.">Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions.</a> Structure. 18 (8), 903-912 (2010).</li><li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells.">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li><li>Ophus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+linear+phase+contrast+in+scanning+transmission+electron+microscopy+with+matched+illumination+and+detector+interferometry.">Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry.</a> Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).</li><li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+FIB-SEM:+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens.">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Biz bir sıra geçici DNA sıkıştırma Siyanobakteriler içinde görüntülenmesi için iletişim kurallarının sundu. Temel kavram bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM)12benzemektedir. Buna ek olarak, bu yöntemde, canlı Siyanobakteriler floresans mikroskobu tarafından izlenen, hızla EM ızgaralar donmuş ve doğrudan yüksek gerilim cryo-elektron tomografi ile görüntülenir. İlk uygulama, DNA'ın ayrıntılı yapısı bakteri hücreleri sıkıştırılmış gibi başarılı bir şekilde 3D görselleştirildiği. Şu anda, bu konuya özel bir işlemdir ama daha kapsamlı, bazı durumlarda değiştirilmiş metodolojisi ile uygulanacaktır. Burada, avantajları, sınırlamaları ve bu yöntemi gelecekteki olanakları ele alınmıştır.
Bu yöntemin avantajları, biri bütün hücre 3D görselleştirme. 1 MV HVEM başarıyla görüntülenir Dinamik DNA hücre altı organelleri yapısını sıkıştırılmış hücreleri. Ancak, normal hücrelere ince yapısı nedeniyle düşük görüntü kontrastı ayırt edilebilir değil. Esnek olmayan artan ve kalın numuneler birden çok saçılma bulanıklaştırır görüntü13. Sıfır-kaybı ve en olası kaybı görüntü bir enerji filtresi yoluyla filtre elastik saçılma14,15azaltarak görüntü kontrastı artırabilir ama numuneler iMFP kalın için çalışmaz. Sıfır-kaybı ve en olası kaybı doruklarına numune kalınlığı ile büyük ölçüde azaltır. Elektron hassas buz gömülü numuneler için yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek özellikle zordur. Murata vd göstermiştir bu 1MV tarama iletim plastik parlak alan görüntüde daha yüksek görüntü kontrastı Maya hücreleri 5 µm kalınlık ile gömülü mikroskobu (kök) verir nerede görüntü kontrastı öncelikle genlik kontrast13 tarafından verilir . Ancak, daha yüksek hızlandırılmış elektron Knock hasar etkisi zarar duyarlı cryo-numune16için ışınlama doz için başka bir sınırlama oluşturur bekleniyor. Faz plaka17,18 Volta ve Frits kullanma HVEM için toplam doz gelecekte azaltarak Knock zarar azaltmak mümkün olabilir. HVEM için kalın örnekler kullanarak başka bir sınırlama HVEM sağlamak Kullanıcı Özellikleri dünya çapında kıt olduğu gerçeği gelir.
Kalın numuneler, cryo-kök tomografi vasıl 300 gözlemlemek için alternatif bir yöntem kullanarak kV yüksek kontrastlı görüntüler dondurulmuş-sulu numuneler üzerinde birkaç yüz nanometre19aşan kalınlı¤ında göstermiştir. Cryo-kök faz kontrast almak için elektron pthychographic mikroskobu Ayrıca, faz plaka kondansatör objektif bir faz modülasyonlu kırınım pixelated 2D dedektörü20transposes girmiştir. Görüntüleri birden çok diffractions hesaplamadan tarafından alınır. Doğrudan ve hızlı 3D cryo-görüntüleme büyük yerli cryo-yalan-SEM örnekleri, donmuş Ayrıca kullanılan21, seri nerede ile odaklı iyon kiriş kesit ve yüz görüntüleme engellemek için görüntüleme tamamen donmuş numuneler sulu için uygulanır. Bu teknolojiler Biyolojik örneklerin görüş yelpazesini genişletmek, bakteri, hedef konumunu bulmak zor olsa da Örneğin etiketli bakteri, çünkü hedef tamamen buz altında ve kırpma önce tanımlanamıyor.
DNA sıkıştırma Siyanobakteriler farklı bir yapıda üretir. DNA sıkıştırılmış hücreleri bile normal hücrelerde mevcut değil bir büyük yoğunluk önyargı hücrelerindeki nedeniyle lekeli olmadan kolayca ayırt edilirler. Ancak, hücre içinde daha fazla yerel etkinlikler görselleştirmek için fluorescently etiketli ROI elektron mikroskobu aktarmak gereklidir. Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için ışık mikroskobu görüntüler ve elektron mikroskobu görüntüleri genellikle EM Bulucu ızgaralar12tarihinde floresan lateks boncuk veya kuantum nokta kullanarak correlated. Etiketleme parçacıklar yüksek elektron yoğunluğu floresans yanı sıra olması gerekir. Doğru ve güvenilir bir şekilde iki görüntü arasında pozisyonlar ilişkilendirmek. Ayrıca, etiketli alanı cryo-ışık mikroskobu ile teyit ederek, Roi tam örtüşme arasında iki mikroskoplar elde edilebilir. Bu parçacıklar ve cryo-ışık mikroskobu DNA sıkıştırma daha ayrıntılı yapısal olaylar karakterize, daha sağlam ve doğru bir ilişki içinde belgili tanımlık gelecek için vazgeçilmez bir araç olacaktır.
Bu makalede, siyanobakteriler DNA sıkıştırma geçici yapısını zaman uyumlu kültür, floresans mikroskobu ve yüksek gerilim cryo-elektron tomografi birleşimiyle karakterize gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı sıkıştırılmış DNA gözlem üzerinde duruluyor. Bu yöntem yukarıda bahsedilen diğer yeni teknolojilerle birleştirildiğinde, bu DNA sıkıştırma daha ayrıntılı süreci araştırmak mümkün ve uygun değiştirilmiş yöntemleri yaygın olarak bakteri diğer dinamik yapısal olaylara tabidir.

DNA sıkıştırma bazı Siyanobakteriler olduğu belirlendi dramatik bir sitoplazmik olaydır. Ne zaman Synechococcus elongatus altında 12 h her ışık/karanlık döngüsü, görünümü diğer zaman açıkça farklı ışık süresi kısaltılmış göründü DNA kültürlü1puan. Bu işlem tarafından Kai proteinler2dayalı bir sirkadiyen saat denetlenir sürülmüştür. Seki ve ark. Höchst 33342 ile lekeli DNA ışık döneminin sonuna doğru S. elongatus hücrelerdeki sıkıştırılmış ve floresan mikroskop altında dalgalı bir çubuk şekli gösterdi bildirdin. Sıkıştırılmış DNA sonra çubuk ortasındaki ikiye bölünmüş ve nihayet her kızı hücre3normal tekdüze dağılım için döndürülen hücre olarak ayrılmış. Ancak, onun geçici doğası ve büyüklüğü elektron mikroskopi için yapısal analizi engellemiştir. Murata vd. kombine zaman uyumlu kültür, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler gerilim elektron cryo-tomografi (cryo-HVET) ve geçici DNA sıkıştırma, yapısını belirlenmesinde başarılı oldu polifosfat organları (PPBs)4kinetik dahil olmak üzere. El yazması deneysel prosedürler birleştirerek görsel zor bir malzeme ayrıntılı açıklamasını sağlar.
S. elongatus kapsül bir şekli vardır, canlı hücreler çok kısa bir süre için sadece 2-5 µm, 0.5 µm hakkında bir genişliği ve mükemmel DNA sıkıştırma uzunluğu görünür. Bu nedenle, siyanobakteriyel DNA sıkıştırma içinde meydana gelen yapısal değişiklikler ayrıntılı olarak bilinmiyordu. Bu yapıların elektron mikroskobu tarafından araştırmak için iki ana teknik sorunların üstesinden gelmek gereklidir. Bir yerel koşullar yakınındaki bakteri bütün kalın bir örnek gözlem ve diğer dinamik bir yapısı hızlı fiksasyonu. İlk sorun gelince, esnek olmayan ortalama özgür keçiyolu (iMFP) elektron elektron mikroskobu5hızlanan voltajı bağlıdır. 300 transmisyon elektron mikroskobu (TEM) içinde kV, sanki daha az 350 nm. Örneğin, bir buz gömülü cyanobacterium zaman (numune kalınlığı ≈ 600 nm) 200kV TEM görülmektedir (iMFP ≈ 250 nm), hücre içindeki yapıları gözlemlemek zordur. Buna karşılık, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) vermek ve görüntü hücre (Şekil 1) boyunca sitoplazmik yapısının. Bu iletişim kuralı ' belgili tanımlık eriyik, 1 hızlanan bir gerilim, bir yüksek gerilim elektron mikroskobu (HVEM) bir parçası olarak MV istihdam. Ancak, HVEM uygulamak İmkanlar dünya çapında sınırlıdır. Olası alternatif çözümler de tartışma bölümde ele alınmıştır. İkinci sorun cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) tarafından çözüldü. Bu dinamik yapılar yerel koşullar, nerede örnek sıvı etan hızlı dondurucu cihaz kullanarak hızla dondurulur ve donmuş an doğrudan değişiklikler6minimum görülmektedir yakınındaki görüntülenmesi için güçlü bir araçtır. Tomografi ile birleştirerek, üç boyutlu (3D) yapıları bir anlık görüntü tilt serisi7' den yeniden olabilir. Bu deneyde, DNA sıkıştırma zaman uyumlu kültür altında 12 h her açık/koyu döngüsü kullanarak elongatus S. yeniden oluşturulmalı ve numune dondurulması zamanlaması floresan mikroskop altında izleyerek tespit edildi.
Burada açıklanan yaklaşım yaygın olarak bakteri hücreleri, Örneğin hücre bölünmesi, kromozom segregasyon ve faj enfeksiyon dinamik yapıları incelenmesi için geçerlidir ve mikrobiyolojik araştırmada yeni yollar açmak için bir potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Dojindo</td><td>346-07951</td><td>1mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Agar Powder (for plant culture)</td><td>Wako</td><td>016-11875</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Wako</td><td>027-02192</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Manganese chloride tetrahydrate</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>99%</td></tr><tr><td>Zinc sulfate heptahydrate</td><td>Wako</td><td>264-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium molybdate</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>99%</td></tr><tr><td>Copper sulfate pentahydrate</td><td>Wako</td><td>039-04412</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Cobalt nitrate hexahydrate</td><td>Wako</td><td>031-03752</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>99%</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Wako</td><td>131-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>98%</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>Dojindo</td><td>343-01861</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>Wako</td><td>197-01581</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>99%</td></tr><tr><td>TES (Good&amp;rsquo;s buffer)</td><td>Dojindo</td><td>344-02653</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate</td><td>Wako</td><td>092-00802</td><td>1st Grade</td></tr><tr><td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td><td>Wako</td><td>197-03585</td><td>99%</td></tr><tr><td>BSA gold tracer 15nm</td><td>Aurion</td><td>215.133</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil EM grid</td><td>Quantifoil MicroTools</td><td>R3.5/1 Copper grid</td><td></td></tr><tr><td>Electron films</td><td>Kodak</td><td>SO-163</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Kodak</td><td>D19</td><td></td></tr><tr><td>Fixer</td><td>Kodak</td><td>Rapid fixer</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>Grade 1</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>NKsystem</td><td>LH-100SP</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE 50i</td><td></td></tr><tr><td>High voltage TEM</td><td>HItachi</td><td>H1250M</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-specimen holder for HVEM</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plunge-freezing device</td><td>Leica</td><td>EM CPC</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Ion bombarder</td><td>Vacuum device</td><td>PIB-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage</td><td>Taylor-Wharton</td><td>25LDB</td><td></td></tr><tr><td>Developing tank</td><td>Dosaka EM</td><td>TB-3-75</td><td></td></tr><tr><td>flatbed scanner</td><td>Nikon</td><td>Coolscan 9000ED</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation software</td><td>FEI</td><td>Amira</td><td>https://www.fei.com/software/amira</td></tr><tr><td>Tomographic Reconstruction software</td><td>eTOMO</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td></tr></tbody></table>

visualization of dna compaction in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. DNA sıkıştırma son zamanlarda bazı Siyanobakteriler hücre bölünmesi önce gerçekleşmesi için bulundu dramatik sitoplazmik olaydır. Ancak, büyük hücre boyutu ve geçici karakteri nedeniyle yapısı ayrıntılı araştırmak zordur. Zorlukları aşmak için ilk olarak, DNA sıkıştırma tekrarlanarak cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 12 h her ışık/karanlık döngüsü kullanılarak zaman uyumlu kültür tarafından üretilmektedir. İkinci olarak, DNA sıkıştırma floresans mikroskobu tarafından izlenen ve hızlı donma tarafından ele geçirdi. Üçüncü olarak, hücre DNA'ın ayrıntılı yapısı sıkıştırılmış yüksek gerilim cryo-elektron tomografi tarafından üç boyutlu (3D) olarak görüntülenir. Bu yöntemler bakteri, Örneğin hücre bölünmesi, kromozom segregasyon, fajının enfeksiyon vbgeçici yapılarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir ayarlanır., hangi floresans mikroskobu tarafından izlenen ve doğrudan tarafından görüntülenmiştir Cryo-elektron tomografi uygun zaman noktalarda.

Küçük 12 h her açık/koyu döngüsü bir kesin zaman uyumlu kültürde Höchst ile etiketli DNA karanlık durumda (Şekil 2a) normal tekdüze dağılım gösterir. Ancak, bu kademeli hücre içinde ışık döneminde düzenler ve ışık dönemin sonunda bir dalgalı çubuk benzeri yapı (Şekil 2b) olarak görünür. Son olarak, Merkezi ( Şekil 2c oklar) çubuk böler ve onun iki bölümden kızı hücreleri (Şekil 2B) dağıtılır. Hücre bölünmesi sonra sıkıştırılmış DNA hemen kaybolur ve DNA için normal bir üniforma dağılımı verir.
Ne zaman bir aliquot hücreleri DNA sıkıştırma son aşamasında içeren hücre hemen transfer delikli bir ızgara üzerine ve hızlı donmuş sıvı etan ve donmuş kılavuz 1 MV cryo-HVEM, siyanobakteriler dahil olmak üzere iç yapıları tarafından gözlenmiştir DNA, thylakoid membran katmanları, hücre duvarları ve PPBs, olduğu gibi bir anlık görüntü (Şekil 3a) dondurma anda ortaya çıktı. Birçok hücreler hücreleri ( Şekil 3a' beyaz ok) farklı DNA sıkıştırma gösterdi ve normal hücreleri ( Şekil 3biçinde beyaz ok uçları) kolayca ayırt edici olabilir. Bazı hücrelerin ortasındaki bir daralma önce hücre bölünmesi ( Şekil 3a' sarı ok) beklendiği gibi sergiledi.
3D tomograms içinde büyük organellerin hücre bölümlenmiş; hücre duvarı, thylakoid membran katmanları, DNA ve PPBs olabilir (Şekil 4) ayırt. Özellikle, sıkıştırılmış DNA nerede DNA düşük yoğunluklu malzeme ile çevrili ve thylakoid membran katmanlar düzenlenen DNA'ın çubuk dalgalı bozuk sitoplazma içinde ayrı bir boşluk ayrılmış. PPBs dinamik davranışı yeni gözlenen: DNA'sı hücreleri, sıkıştırılmış ise büyük birçok küçük PPBs DNA için uygun görüldü ve normal hücrelere daha az. Buna ek olarak, çoğu PPBs çiftleri olarak ortaya çıktı ve bazı DNA PPBs ayrılması bir süreçte olduğu ortaya çıktı. Bu PPBs kendilerini iki DNA ikilenmesi ve işlevi tarafından fosfat DNA sentezi için tedarikçileri olarak ayrılır olduğunu ileri sürdü.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg"> Şekil 1. Cryo-EM görüntülerini normal Siyanobakteriler, S. elongatus PCC 7942 farklı hızlanan gerilimleri, buz gömülü. a) 200kV ve b) 1000kV. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg"> Resim 2: Floresan mikroskopi cyanobacterium S. elongatus hücre. Her açık/koyu altında 12 saat döngüleri zaman uyumlu kültür sonra hücreleri Höchst 33342 ile lekeli. (a) hücreleri koyu devlet başlangıcı 2 h sonra tek tip DNA etiketleme gösterir. Birçok hücrelerdeki DNA yavaş yavaş ışık döneminde yoğunlaşmak. Sonuçta bir kalın dalgalı çubuk (b) DNA sıkıştırmak tipik kurdu. Bu aşamadan sonra hızlı bir şekilde kendi merkezlerinde (ok uçları) bölünmüş hücre bölünmesi (c) ve iki parça sırasında sıkıştırılmış DNA yapıları ayrılmış kızı hücreleri (d). Kızı hücreleri tek tip DNA karanlık dönemde tekrar etiketleme için döndürdü. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg"> Şekil 3: Siyanobakteriler görüntüsünü Cryo-HVEM gömülü amorf buz (a) bir raw resim 0 ° tilt olarak gösterir. Görüntüleri ışık dönemin sonunda alındı. Bazı hücreleri dalgalı çubuk şekilli DNA organları benzer ökaryotik yoğun kromozomlar (beyaz ok) gösterir. Normal hücrelerde, siyanobakteriler discernable DNA yapısı içinde sitoplazma (beyaz ok uçları) sergi. Bazı hücrelerin hücre bölünmesi (sarı ok) önce beklendiği gibi merkezi bir daralma sergi. (b) xy, xz, yz-3D tomogram dilim. Sarı noktalı çizgiler kavşak dilimleri göster. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg"> Şekil 4: Ultrastructure hücre içeren sıkıştırılmış DNA'sı. Ana bileşenleri parçalara: hücre duvarı (parlak sarı), thylakoid membranlar (kırmızı) ve DNA (mavi). (a) 3D tomogram dilim z gösterir. (b) tüm kesimleri. Hücre ayrılık gösteren daralma hücre (ok) ortasında görünür. PPBs sarı veya turuncu küreler modellenmiştir; turuncu her alanda en yakın sarı küre muadili temsil eder. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography at JoVE.com

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

visualization-dna-compaction-cyanobacteria-high-voltage-cryo-electron

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.0K Görüntüleme.  National Institute for Physiological Sciences. Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Video: Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Biyomühendislik

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Biyokimya

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biyoloji

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Simplified Volumetric Models as an Effective Strategy for Segmenting Actin Networks in Cryo-Electron Tomograms

Efficient methods for the extraction of features of interest remain one of the biggest challenges for the interpretation of cryo-electron tomograms. Various automated approaches have been proposed, many of which work well for high-contrast datasets where the features of interest can be easily detected and are clearly separated from one another. Our inner ear stereocilia cryo-electron tomographic datasets are characterized by a dense array of hexagonally packed actin filaments that are frequently cross-connected. These features make automated segmentation very challenging, further aggravated by the high-noise environment of cryo-electron tomograms and the high complexity of the densely packed features. Using prior knowledge about the actin bundle organization, we have placed layers of a highly simplified ball-and-stick actin model to first obtain a global fit to the density map, followed by regional and local adjustments of the model. We show that volumetric model building not only allows us to deal with the high complexity, but also provides precise measurements and statistics about the actin bundle. Volumetric models also serve as anchoring points for local segmentation, such as in the case of the actin-actin cross connectors. Volumetric model building, particularly when further augmented by computer-based automated fitting approaches, can be a powerful alternative when conventional automated segmentation approaches are not successful.

Here, we present a protocol to place simplified volumetric models into noisy, complex, tomographic 3D volumes. This allows the fast segmentation of actin filament densities, detection of systematic filament bending and of gaps in hair bundle filaments, as well as convenient quantification of volumetric model properties, such as distances.

Efficient methods for the extraction of features of interest remain one of the biggest challenges for the interpretation of cryo-electron tomograms. ...

Nörobilim

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryo-STEM tomography provides a means to visualize organelles of intact cells without embedding, sectioning, or other invasive preparations. The 3D resolution obtained is currently in the range of a few nanometers, with a field of view of several micrometers and an accessible thickness in the order of 1 &#181;m.