We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

1. Cryo-tutucu Hazırlama ve Bakım NOT: Kuru pompa istasyonu, turbo pompa istasyonu ve bir veya daha fazla soğuk sahne kontrolörleri oluşan, öncelikle üç amaçlar için kullanılır: a) kullanılmadıkları zaman cryo sahipleri saklamak için güvenli bir yerdir. sahipleri saklamak için doğru yolu vakum altında istasyonunda onları terk etmektir. b) Sıvı azot Dewar ve maruz kriyo tutucunun ucundan kaldırıldığında oluşan don ve nem oluşumunu buharlaştırılması için; Bu ısınma döngüsü ile elde edilir. c) zeolit ​​kurutucu yeniden oluşturmak için ve cryoholder Dewars yüksek vakum elde etmek. Bu kriyo elektron mikroskopisi yaparken bir sabit sıcaklık tutulması için gereklidir. <ol><li> Isınma Döngüsü. <ol><li> Pompalama istasyonu pompa limanlarından birine cryo tutucu yerleştirin. Sahibinin vakum valfi altında metal çıkışına tahliye tüplerden birini bağla. Yapmakistasyon (V1, V2, V3 ve) ve cryo tutucu tüm vanalar kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Soğuk sahne denetleyicisi açın ve kontrol kablosu aracılığıyla sahibine bağlayın. Turbo pompa istasyonu güç anahtarını açın. </li><li> Soğuk sahne denetleyicisi Isınma döngü seçeneği başlatın. Turbo pompa istasyonu vakum 10 -3 Torr&#39;a veya daha okuduğunda, kelebek vana V2 açmak vakum stabilize kadar bekleyin ve ardından kelebek vana V1 açın. </li><li> Tutucu sıcaklık 20 ° C&#39;nin üzerinde stabil olana kadar yaklaşık 30 dakika ısınma döngüsü çalıştırın. Yakın V1 ve ardından döngüsünü durdurun. </li></ol></li><li> Zeolit ​​döngüsü. 4 saat ve O Arasında Zeolit ​​Döngüsü çalıştırın / N cryoEM Oturum öncesinde ve Hafta kez eğer Değil Kullanımı. <ol><li> Zeolit ​​döngüsü seçeneği başlatın ve 1-2 x 10 -4 Torr aralığında, iyi bir vakum ulaşmak için gerekli zamanı seçin, ve böylece uzun bekleme süresi. Ne zaman vakum 10 ulaşır -3Torr, V3 Dewar tahliye vanasını açın. pompa istasyonu daha sonra sahibine hattı tahliye edecek; Vakum stabilize kadar bekleyin. </li><li> Cryo tutucu vanayı açın. Döngüsü tamamlandığında, onlar açıldı edildiği ters sırayla vanalarını kapatın: vana tutucu, daha sonra V3, V2 ve nihayet V1. Turbo pompa istasyonu ve soğuk sahne denetleyicisi kapatın ve soğuk sahne denetleyicisi ve turbo pompa istasyonundan cryo tutucu ayırın. </li></ol></li></ol> 2. Izgara Hazırlık <ol><li> Temizleme. Not: Ticari Delikli tablosunu kullanarak, bu üretim işleminde kullanılacak olan herhangi bir artık polimerin çıkarılması için, kullanımdan önce bunları temizlemek için tavsiye edilir. Alt yayılmış filtre kağıdı 5 kat, cam bir Petri tabağına yapın. <ol><li> Delikli karbon tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdı üzerinde ızgaraları yerleştirin. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, o birkaç damla ile kağıt ıslakızgaraları etrafında f kloroform sadece yüzen başlayana kadar. </li><li> Bir davlumbaz Ç / N biraz açık kapak ile Petri örtün. </li></ol></li><li> NOT: Buz tabakası doğrudan holey karbon ızgara küçük delikler arasında oluşturulabilir ince karbon desteği (2,2-2,3 adımları) ihmal edilebilir. <ol><li> Bir çift cımbız kullanarak, iki yeni yüzeyler ortaya çıkarmak için mika bir parça bölmektedir. Bir Petri kabındaki beyaz bir kâğıt parçası üzerinde mika yüzü yukarı yeni maruz yüzeyleri yerleştirin. </li><li> Bir karbon evaporatör çan kavanoza Petri kabı yerleştirin. Vakum altında 2 x 10 -6 Torr kadar pompa aşağı dizisini başlatın. C çubuk yüzeyi üzerinde herhangi bir istenmeyen maddeyi buharlaştırmak için, kapalı bir Petri kabı ile bir ön-buharlaştırma gerçekleştirin. Sonra çan kavanoz hava ve Petri kabı kapağı çıkarın. </li><li> Vakum karbon ince bir tabaka (~ 5 nm) ile mika 10 -6 Torr ve ceket altına kadar pompa aşağı dizisi gerçekleştirin. Karbon sırasında göz koruması kullanınbuharlaşma. Mika yaprak altına olmuştu kağıt üzerinde ortaya çıkan karanlık karbon film kalınlığını izleyin. </li></ol></li><li> TEM Grid İnce Carbon aktarın. <ol><li> Kaplanmış mika, 0.5 x 1 cm parça kesin ve süzüldü, iyonu giderilmiş su, düz yüzey üzerine karbonun yüzer. Düz bir su yüzeyi elde etmek için optik lens kağıdı kullanın. Cımbız kullanarak, yüzen karbon tabakasının üst yüzeyi ile temas halinde ızgara holey karbon yan koymak ve onu almak. </li><li> Izgaraları yeterli sayıda hazırlanır kadar tekrarlayın 2.3.1 ve 2.3.2 adımları. </li></ol></li><li> Deşarj Glow. NOT: ışıltılı tahliye hidrofil içine ızgaraları doğal hidrofobik karbon kaplama tabakası dönüştürür. Bu adım isteğe bağlıdır. <ol><li> Karbon yan Parafilm ile kaplı 7.5 x 2.5 cm cam slayt yukarı bakacak şekilde yerleştirin ızgaraları. Kızaran deşarj ekipman odasına yerleştirin ve odasına kapatın. </li><li> Pompa25 mA 20 saniye ve 7 x 10 -2 mbar için çan kavanoz ve parlaklık deşarj. NOT: Bir açık mor parlaklık görünür hale bu süre zarfında. Aksi takdirde, onlar kızdırma tekrar taburcu olması gerekir, ızgaraları ile cam slayt çıkarın ve 1 saat içinde bunları kullanmak. </li></ol></li></ol> 3. Numune Dalma-dondurma NOT: Sıvı azot ve etan sıçramalarına karşı korumak için bu aleti kullanırken koruyucu gözlük ve uygun ayakkabı kullanın. <ol><li> Dalma-dondurma aparatı açın. Damıtılmış suyla nemlendirici doldurun. Istenen sıcaklık, bağıl nem ve leke kez dalma koşulları, leke kuvvet ve tutma süresi (22 ° C,% 95, 2 saniye, burada sunulan örnek 2 ve 40 sn). Yeni lekeleme filtre kağıdı yerleştirin. </li><li> Stabilite (yaklaşık 10 dakika) elde edilene kadar sıvı nitrojen ile dış hazne doldurarak etan kap soğutun. Sıvı azot Boilin durduğundag, iç odasında etan tankından gelen tüp ucu yerleştirin ve çok yavaş vanayı açın. Iç hazne içinde etan sıvılaştırılması ve üstten 1 mm kadar doldurun. Etan dondurma kaçının. DİKKAT: etan, son derece yanıcı ve patlayıcıdır. </li><li> Emin cımbız dalma dondurma aygıtı içinde hizalanır olun. </li><li> Nem açın. Cımbız üzerine bir ızgara yerleştirin ve holey ızgara karbon yüzeyine (donuk tarafı) üzerine numunenin 3-5 ul yükleyin. Örnek ızgarasına adsorbe ve ince bir sıvı tabakası elde etmek blot gerçekleştirmek için bekleyin. </li><li> Sıvı etan içine dalan tarafından ızgara Flash dondurma. Sürekli cımbız tutan sıvı etan gelen cımbız-ızgara aksamını çıkarın, ve sıvı azot ile dış odasına transfer. Sıvı azot içinde dalmış küçük ızgara kutusuna ızgara aktarın. Ya depolama tankına transferi sırasında sıvı azot içinde her zaman vitrifiye örnek tutmak emin olunya cryo sahibine. NOT: Izgara kutuları en az 1 yıl süreyle büyük bir kapasite (35-50 L) sıvı azot Dewar saklanabilir. Uygun şekilde saklanması için iki delinmiş üstünde delikler ve termosun ağzından çekilebilir olan kapağa bağlı bir olta bir 50 ml Falcon tüpü içine yerleştirilmiş olabilir. </li></ol> 4. TEM Cryo-grid transfer <ol><li> Cryo transfer istasyonu içine cryo tutucu yerleştirin. Yerleştirilmesi sırasında sahibinin ucu zarar vermemeye özen gösterin. Herhangi bir optik lens kağıdı ile kaldırmak varsa, çubuk ve bir büyüteç kullanarak cryo sahibinin O-ring küçük liflerin varlığı ve toz kontrol edin. </li><li> Cryo sahibinin Dewar ve sıvı azot ile iş istasyonu gemi doldurun. Iş istasyonu ile birlikte geliyor tuzağa huni kullanılarak sıvı azot dökmekten kaçının. </li><li> Sıcaklığını izlemek, ve sıvı azot &amp; # eklemeye devam soğuk sahne denetleyicisi cryo tutucu bağlayın160; sıcaklık yaklaşık -194 ° C&#39;de stabilize kadar. Sıvı azot düzeyi iş istasyonu gemi ve cryo tutucu Dewar hem vakum mühür seviyesinin altında olduğundan emin olun. Izgara cımbız, klip halka ve iş istasyonunda klip halka aracının künt ucunu ön-serin. Ayrıca, büyük cımbız bir dizi ve sıvı azot ile doldurulan bir termosun bir tornavida ön soğutulur. </li><li> Hızla büyük cımbız kullanarak iş istasyonu sıvı azot dondurulmuş hidratlı ızgaraları içeren cryo ızgara kutusunu aktarın. , Tornavida ile cryo grid kutusunu açın dondurulmuş hidratlı ızgara almak ve numune tutucu yuvasına yerleştirin. </li><li> Izgara üstüne klip halka yerleştirin ve sıkıca yerine oturana kadar klip halka aracı künt uçlu basın yavaşça. Cryo-deklanşör kapatın. Iş istasyonundan araçları ve cryo ızgara kutusunu çıkarın. </li><li> Mini amacıyla mikroskop konsoluna tutucu ve ızgara ile tüm iş istasyonu taşıyınoda havasında ızgara transfer süresi rımızı azamiye. </li><li> Önceden doldurulmuş ve en az 20 dakika boyunca soğutulur olan sıvı azot ile TEM anti contaminator kapalı üst. -60 ° mikroskop sahne Ön eğin. Not: tutucu havalandırma süzgeci içine yerleştirildiğinde, bu sıvı azot kaybını en aza indirir. </li><li> Mikroskop öncesi pompa hava kilidi döngüsü başlar. (Bir FEG TEM özellikle varsa) elektron tabancası valf kapalı olduğundan emin olun. Ön-pompa hava kilidi dizisi cryo tutucu takmadan önce (yaklaşık 2 dakika) bitirmek için bekleyin. NOT: Bu aşama sönmüş olan kırmızı ışıkla belirtilir. </li><li> Hava kilidi içine yerleştirilir ve bu 90 ° saat yönünde döndürmek; sıcaklığını izlemek için cryo sahibine soğuk sahne denetleyici kablosunu bağlayın. Kırmızı ışık sönene kadar tekrar bekleyin ve TEM en hi içine tutucu eklemek için sahne ve arka 0 ° pozisyonuna tutucu hem döndürmekgh vakum sütun. </li><li> Sıcaklık asla kristal buz oluşumunu önlemek için -160 ° C&#39;nin üzerine çıkması emin olun. </li><li> Cryo sahibinin Dewar doldurun. Tutucu termal dengeye ve TEM vakum görüntüleri kaydederken önce iyileşene kadar 45 dakika - 15 bekleyin. </li><li> Sıvı azot kabarcıkları tespit edilirse, sıvı azot dolum yüksekliğini değiştirmek, ya da hafifçe bir pamuklu çubukla köpürme kökenli dokunun. </li></ol> 5. Düşük doz Veri Toplama NOT: Düşük doz veri toplama tekniği / Å 2 20 elektronlara miktarının sınırlandırılması ile örnek elektron radyasyon hasarı en aza indirmek için kullanılır. Bu üç yapılandırmaları arasında değişen elde edilir: yüksek büyütme (~ 150,000X) ve bakış küçük alan ve &quot;maruz kalma&quot; ile, düşük büyütme (~ 5,000X) ve görüntüsü, &quot;odak&quot; geniş alanıyla, &quot;arama&quot;, istenen son Magni ileSınıflamasına ve ilgi alanı içeren kaydedilecek. Modları arasında ışın Boş. <ol><li> TEM ve düşük doz Programı Kurma <ol><li> Cryo-deklanşör çekin ve sütun vanalarını açın. </li><li> Sahne ortala ve 15 ° ± sahne rock alfa wobbler kullanarak eucentric yüksekliği (Z) ayarlayın. Sahne sallanan iken hiçbir kayda değer bir hareket kalmayıncaya kadar Z konumunu ayarlayın. Düşük doz programı etkinleştirin ve her mod için dedektör seçin. </li><li> Pozlama modunda, herhangi bir karbon olan ızgara bir alan bulmak kaydedilecek alanı tamamen aydınlatılmış böylece optimum kondansatör diyafram ve spot boyutu seçerek aydınlatma ayarlayın. Sürkondensasyon yönünde ışını yaymak için emin olun. </li><li> Arama modunda, yüksek büyütmede kolay tanımlanabilir olacak küçük bir özelliği bulmak. Pozlama modunda, joystick (xy sahne denetleyicisi) ile bu özelliği merkezi. Feat eğer düşük büyütme başlayınure görüş alanında değil. </li><li> Arama modunda, düşük doz xy görüntü kaydırma kontrolleri kullanarak alanının merkezine bu özelliği getirmek. Pozlama moduna gidin ve kaydedilecek alanı dışında olduğu kadar joystick&#39;i kullanarak eksen eğim boyunca özelliğini taşımak (0,5-3 mikron). Modunu odak gidin ve xy görüntü kaydırma kontrolleri kullanarak özelliğini merkezi. Özellik görüş alanında değilse düşük büyütme başlayın. </li><li> Her zaman merkezli ışın tutun. </li></ol></li><li> Bilgi toplama <ol><li> Cryo-deklanşör çekin ve sütun vanalarını açın. Düşük doz programı etkinleştirin. </li><li> Arama modunda, ince, homojen buz içeren bir ızgara kare tespit. </li><li> Uygun delik seçin ve alanın ortasına yerleştirin. Modunu odak ve görüntü odak geçin. 4.5 mikron - O 0.5 görüntü underfocus. </li><li> Pozlama moduna geçer ve görüntüyü kaydedebilirsiniz. </li><li> 5.2.3-5.2.4 modu arama ve adımları tekrar geçin.Kaçınarak ızgara Meydanın karşısında hareket öncesi açığa iyi delikleri kaydedilecek. </li><li> Izgara kare bitirin ve başka iyi bir hareket. </li><li> Yüksekliği (Z) yeniden ayarlayın ve veri toplama devam ediyor. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RyRs:+Their+Disposition,+Frequency,+and+Relationships+with+Other+Proteins+of+Calcium+Release+Units.">RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units.</a> Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+from+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).</li><li>Radermacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+three-dimensional+reconstruction+of+the+calcium+release+channel/ryanodine+receptor+from+skeletal+muscle.">Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).</li><li>Stewart, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+bias+in+the+refinement+of+structures+derived+from+single+particles.">Noise bias in the refinement of structures derived from single particles.</a> Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).</li><li>Serysheva, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+and+angular+reconstitution+used+to+visualize+the+skeletal+muscle+calcium+release+channel.">Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel.</a> Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+reconstructions+of+the+transferrin-transferrin+receptor+complex+obtained+with+different+specimen+preparation+techniques.">Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques.</a> J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).</li><li>Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+apolipoprotein+serum+amyloid+A+in+solution+forms+a+hexamer+containing+a+central+channel.">Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).</li><li>Amunts, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+yeast+mitochondrial+large+ribosomal+subunit.">Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.</a> Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+the+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: the new Leginon system.</a> J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, e00461 (2013).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).</li><li>Lerch, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+AAV-DJ,+a+retargeted+gene+therapy+vector:+cryo-electron+microscopy+at+4.5+A+resolution.">Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution.</a> Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).</li><li>Govindasamy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+adeno-associated+virus+serotype+5.">Structural insights into adeno-associated virus serotype 5.</a> J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods.">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).</li><li>Ge, P., Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-bonding+networks+and+RNA+bases+revealed+by+cryo+electron+microscopy+suggest+a+triggering+mechanism+for+calcium+switches.">Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).</li><li>Clare, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-triggered+conformational+changes+delineate+substrate-binding+and+-folding+mechanics+of+the+GroEL+chaperonin.">ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin.</a> Cell. 149 (1), 113-123 (2012).</li><li>Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+model+of+the+human+26S+proteasome.">Molecular model of the human 26S proteasome.</a> Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Markl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keyhole+limpet+hemocyanin:+9-A+CryoEM+structure+and+molecular+model+of+the+KLH1+didecamer+reveal+the+interfaces+and+intricate+topology+of+the+160+functional+units.">Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units.</a> J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).</li><li>Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+the+'Wild+West'+of+structural+biology.">Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).</li><li>Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).</li><li>DiMattia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+structural+studies+of+adeno-associated+virus+serotype+5.">purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).</li><li>Samso, M., Shen, X., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+RyR1-FKBP12+interaction.">Structural characterization of the RyR1-FKBP12 interaction.</a> J Mol Biol. 356 (4), 917-927 (2006).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors:+insights+into+disease+mutations.">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+electron+crystallography.">Introduction to electron crystallography.</a> Methods Mol Biol. 955, 1-16 (2013).</li><li>Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+gaining+insight+into+cellular+processes+by+structural+approaches.">Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+supramolecular+assemblies+by+cryo-electron+tomography.">Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography.</a> Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).</li><li>Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+structure+and+visualization+of+transmembrane+domains+of+the+RyR1+calcium+release+channel+by+cryo-EM.">Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM.</a> Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).</li><li>Sharma, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoelectron+microscopy+and+image+analysis+of+the+cardiac+ryanodine+receptor.">Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor.</a> J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+with+contrast+transfer+function+correction+from+energy-filtered+cryoelectron+micrographs:+procedure+and+application+to+the+70S+Escherichia+coli+ribosome.">Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome.</a> J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).</li><li>Thon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phase contrast electron microscopy. , (1971).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

SPA ardından TEM verilen makromolekülü için, düşük çözünürlüklü 3D yapısı ilk daha-yüksek takip edebilir NS verilerden belirlenir, genel olarak orta 2014 yılına EMDB 2.000 girdileri yaklaşıyor, birçok makromoleküler 3D yapılar katkıda bulunmuştur çözünürlüklü cryoEM 3D yapısı. İlk 3 boyutlu rekonstrüksiyon kolaylaştırır NS tarafından sağlanan moleküler sınırları yüksek kontrast, daha sonra onun, tam hidrate durumda makromolekül iç yapısını harita yeteneği, ve çok daha yüksek çözünürlük elde etmek imkanı ile cryoEM rafine edilir. CryoEM diğer bir avantajı, makromolekül çökmesine neden olabilir dehidrasyon stres ortadan kaldırılmasıdır. Buna ek olarak, olası yüzey absorpsiyon etkilerini ortadan kaldırır ve makromolekül çözeltisi içinde benimser yapıyı gösteren karbon desteği, ihmal etmek imkanı vardır. Cryo-negatif boyama, cryoEM ve NS bir arada, tam HYD yüksek kontrast verirörnek puan ve leke kendisi makromolekül 31 bütünlüğüne müdahale edebilir, çünkü aynı zamanda kısmen, 10&#39;dan az EMDB girişleri ile, ancak daha az sıklıkla kullanılır olmuştur, SPA kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon yol açabilir. 3D rekonstrüksiyon elverişli diğer iki TEM teknikleri 2D elektron kristalografisi ve elektron tomografi vardır. 2D elektron kristalografisi, düzlemsel ya da boru şekilli kristal gerektirir; kristalin en elektron kırınımı potansiyel atomik çözünürlükte 32 öncü 3D rekonstrüksiyon için kullanılır. Vitrifiye ya da geleneksel sabit örneklerde elektron tomografisinde, bir makromolekül ya da alt-hücresel bileşeni tek nesnelerin yeniden edilebilir avantajı ile, daha sonra tomografik yeniden 33 için TEM içinde döndürülür; Ancak bugüne kadar bu teknik, 34,35 40-20 arasında değişen bir çözünürlük sınırı vardır. Tüm bu moleküler TEM teknikleri arasında, NS ve cryoEM verileri SPA en yaygın olmuşturkullanılır. Burada gösterilen protokol SPA analizi için uygun cryoEM görüntüleri elde adamıştır; Bununla birlikte protokolünün çok da cryoEM 2D kristaller ve tomografik örnekleri için de geçerlidir. Başarılı bir cryoEM oturumu birçok kritik adımlar kombine başarısına bağlıdır; önemli yönleri, akılda tutmak ortak cryoEM eserler açıklama ve onları aşağıdaki paragraflarda açıklanmıştır önlemek için nasıl. Bu bölümde ayrıca SPA yöntemi kullanarak yüksek kaliteli 3D rekonstrüksiyon elde etmek veri toplama kurallarına anlatılmaktadır. Buz kristal geçiş kaçının. Merkezi bir yönü örnek cryo-dalan TEM gözlem boyunca andan itibaren camsı halde kalmak gerekiyor. Bu yüzden, sıvı etan bakımından örnek dalan sonra takip eden tüm adımlar sıvı azot (-196 ° C) ya da sıvı helyum (-269 ° C) sıcaklıklarda gerçekleştirilir. -135 ° C&#39;nin üzerinde ısıtıldıktan vitreus su dönüşümleriKristal su; Daha sonra makromoleküler düzenlenmeleri yer alabilir ve su kristalleri görüntü (Şekil 3A) hakim; Numune atılmalıdır. Taşıma cımbız yeterince öncesi olsaydı Kaza örnek ısınma cryo-dalma, TEM içine (bir gridbox tarafından korunan bile) kaplarda ve / veya cryo tutucu ekleme arasındaki dondurulmuş ızgara transferi çok yavaş ise ne, ya da olabilir soğutulmuştur. Cryo-transferi üzerine TEM belirgin vakum bozulma (soğuk örnek tuzakları sıcak gelen hava) da örnek ısınabilir. Son olarak, aşırı ışınlama numunenin ayrıca buz kristal geçiş neden olabilir. Buz kontaminasyonu en aza indirin. Küçük bir örnek hacmi (3-5 ul) TEM ızgara uygulanan göz önüne alındığında, buharlaşma tampon bileşenleri (tuz, deterjanlar) konsantre ve dolayısıyla multimerik devletin kaybı da dahil olmak üzere makromoleküler bütünlüğünü etkileyebilir. Yüksek bağıl nem (RH) mikro-ortam veya oda circumvents Bu sorun. Alternatif Cryo-dalma yeterince havalandırılmış çevre soğuk odada yapılabilir. Cryo-dalan RH sonra kendisini soğuk bir tuzak olarak görür cryo-grid gibi, buz kontaminasyonu veya krio-ızgara üzerinde ortamdaki nem yoğunlaşmasını önlemek için mümkün olduğunca düşük olmalıdır. Buz kirlenme yüksek kontrast ve 5 ° arasında nm arasında değişen boyutlarda ve müdahale etmesi ya da hatta tamamen görüntü blok birkaç mikron ile bir alt sahip parçacıklardan oluşmaktadır. Hava transferi sırasında cryo-grid doğru nefes / konuşurken, hava taslaklar kaçının ve ortam RH azaltır. (Beyaz asılı parçacıklar gibi görünür) yoğunlaşmış su ile açın sıvı azot kapları da atılmalıdır. Makromoleküler yönelimler / görüşlerini maksimuma çıkarın. Örnek desteği için, yapılacak bir seçim, gerçek holey ızgaraları ve holey ızgaraları üzerinde ince karbon arasındadır. Bu örnek karbon delikleri karşı karbon filmi yayılır nasıl (i), (ii) kullanılabilir örnek conce bağlıdırntration, çıplak delikleri görüntünün üzerinde benzer bir parçacık yoğunluğu, karbon desteği daha yüksek bir konsantrasyon 100X gerektirebilir (~ 0.02 uM 2), ve (iii) makromolekül yönelimleri dağılımı ne kadar rastgeledir. Karbon hidrofil yapar kızdırma akıntı, Not, her üç açıdan önemli bir etkiye sahip olacaktır ve bu örnek bağımlı olacak. Yüksek çözünürlüklerde 3D rekonstrüksiyon hassaslaştırırken tekrarlayan görünümü rastgele konik yeniden başlangıç ​​yapısal belirlenmesi için arzu edilir ise, makromolekül yönünü ilgili olarak, makromoleküler görüş rastlantısallığı arzu edilir. Bizim örneğimizde, RyR1 bir favori &#39;dört kat&#39; görünümü (Şekil 2B) ile karbon ile etkileşime ve yönelimlerin rastgelelik ve daha yüksek çözünürlükte 36 Delikli ızgaraları gerektirir. SNR. SNR artırmak için en iyi strateji gürültü arka kaynaklarını azaltmak için üst düzeye çıkarın. Aşırı buzkalınlık ve gerekli ötesinde karbon film kalınlığı desteklemek ve protein ekstra gürültü katacak gömmek için (varsa). Böylece buz kalınlığı blot zaman, basınç, RH, ve filtre kağıdı kalitesini kontrol ederek gerekli minimum azaltılmalıdır. Karbon desteği için, ince (~ 5 nm) karbon film kalın holey karbon film üzerinde katmanlı: numune ince karbon kaplı delik üzerinden görüntülü ise kalın holey karbon mekanik direnç sağlar. Öte yandan, son derece ince bir buz not edin ve / veya C-bir ağ (Şekil 3D) dönüşebilir bir kolay kırılan destek neden olabilir. SNR en üst düzeye çıkarmak için, herhangi bir gereksiz tampon bileşenleri kaçınılmalıdır. Membran proteinleri için, deterjan aksine önemli bir otoyol (Şekil 2D, sağ paneli bakınız) alır. Yüzey gerilimini azaltarak ek deterjan örnek desteği yayılır biçimini değiştirir. Bazı membran proteinleri det ek olarak lipid varlığını gerektirirayrıca kontrast azaltır ergent. Bu örnek üstesinden gelmek için, sadece 37 cryo dalan önce düşük deterjan konsantrasyonuna ve lipid olmayan bir tampon içinde seyreltilebilir. Yeni bir alternatif deterjanlar 16 ve transmembran alanı komponentinin stabilizasyonu için nanodisks 38 kullanılması cryoEM da görüntüleme zar proteinleri başarılı yaklaşımlar gibi görünmektedir. Yüksek kaliteli görüntüler için çabala ve CTF düzeltme için hazırlık. Vitrifiye örnekleri hangi orada hiçbir işaret, CTF, frekansa yoğunluğunu ilgilidir fonksiyonu, çeşitli sıfır geçişler vardır kontrast yeterli görüntü (faz) oluşturmak için yüksek bulanıklaştırma değerleri gerektirir bilgi. CTF düzeltme düşük çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyon için gerekli olmasa da daha yüksek çözünürlük hedefleyen zaman, 3D nesnenin doğru sunumunu kurtarmak için, farklı defoci ile görüntüleri hesaplama CTF düzeltme yapılabilir ve böylece toplanan gerekir.CTF belirlenmesi ve düzeltilmesi önemli SPA yazılım paketleri 4-7 dahildir; detaylar başka bir yerde 39 bulunabilir. Optimum CTF düzeltme için, defoci bir dizi kullanın. İyi bir strateji 3-4 bulanıklaştırma değerleri arasında dönüşümlü etmektir. değerleri, buz / karbon kalınlığı (ince numune az bulanıklaştırma gerektirir) ve gerilim (voltaj düşük az bulanıklaştırma gerektirir) makromolekül (büyük boyutlarda daha az bulanıklaştırma gerektiren) büyüklüğüne bağlıdır. 200 kV için, değerlerin iyi bir başlangıç ​​aralığı 2.5, 3, 3.5 ve 4 mikron bulanıklaştırma olduğunu. CTF karşılıklı uzay gösterimi, güç spektrumunda (Thon 40 halkaları) yüksek ve düşük yoğunluktaki halkaları alternatif olarak tezahür eder. Çözünürlük potansiyelini ortaya çıkaracaktır güç spektrumunu gösteriliyor; geniş görünür Thon halka sıklığı ulaşılabilir çözünürlük önsel tahmini en yakın. güç spektrumu periyodik olarak kontrol, ve astigmat (dairesel olmayan) Thon halkaları olmalıdır (Şekil 3C) objektif stigmator ile düzeltilmelidir. Thon halkalar en azından istenen çözünürlüğe kadar görünür olmalıdır. Bu protokolü kullanılarak elde edilen bir cryoEM kümesi doğrudan 3D rekonstrüksiyon oluşturmak amacıyla SPA tarafından işlenebilir. Hatta ideal örneği ile, 3D rekonstrüksiyon kalite performansı ve TEM ekipman özelliklerine bağlıdır, ve görüntü işleme olacaktır. Bu iki cephede de, ve son zamanlarda geliştirilen doğrudan elektron dedektörleri ile anılmayı devam iyileştirmeler sayesinde, olasılık daha tutarlı atomik çözünürlükte 3D rekonstrüksiyon elde hiç olmadığı daha yakın için.

cryoEM hedefi kendi ana hidre edilmiş halde makromoleküllerin elektron mikroskopik görüntü elde etmektir. Vitrifiye suda makromolekül gömme sayesinde, bir dondurulmuş sulu örnek doğrudan sokulabilir ve TEM cihazda görselleştirilmiştir. Vitrifikasyon dondurma, flaş (10.000 o C / sn) tarafından elde, su kristalleşme olmadan örnek donuyor ve donma sırasında moleküler düzenlenmeleri önemsiz olmasını sağlar. Çevredeki tampon göre numunenin elektron saçılması aşırı herhangi bir leke 1 yokluğunda makromolekül görmek için küçük ama yeterli kontrast sağlar. Bilgisayarlı görüntü işleme sonra makromoleküle 3D yapısını yeniden oluşturmak için kullanılabilir. ~ 500 kDa- çok MDa aralığında Büyük makromoleküller (Elektron Mikroskobu Bilgi Bankası (EMDB) girişleri over% 80 temsil eden) cryoEM için ideal örnekler vardır; Bu proteinler, protein kompleksleri, protein-nükleik asit, C içeriromplexes ve zar proteinlerinin, bir iki-tabaka içinde gömülü. Bu makromoleküller (PDB veritabanı az% 2 girişleri ile) kristalize olması daha az olasıdır henüz x-ışını kristalografisi veya NMR tarafından çözüldü küçük parçalar cryoEM tarafından oluşturulan 3D zarfın içine yerleştirilmiş olabilir sık ​​sık bir durumdur. Öte yandan, cryoEM çözülmüştür büyük yapıların bazı ince kesitli TEM 2 tam hücre içinde tanımlanabilir. Böylece, cryoEM etkili bir hücre içi ve atomik yapıları arasındaki boyut ve çözünürlük boşluğu kapatıyor. CryoEM leke dışlama bölgesi güçlü bir tezat &quot;negatif&quot; imajını 3 yaratır sayede makromolekül susuz ve ağır metal leke tabakası ile çevrili olan negatif boyanma daha klasik yöntemle (NS), daha iyi makromoleküle doğal yapısını yansıtmaktadır. Her iki durumda da elektron ışını makromoleküllerin 2D projeksiyon görüntüleri denilen parçacıklar, s üretirhape elektron ışını ile ilgili olarak bir makro molekülün yönüne bağlıdır. Birçok parçacıklar, en azından ~ 1.000 ve hiçbir üst sınırı ile, gürültü oranı (SNR) ortalamaya rağmen sinyal artırmak için, ve parçacığın mekansal oryantasyon parametrelerini bulmak için &#39;tek parçacık analizi&#39; (SPA) yazılımı ile bilgisayarda analiz edilebilir arka projeksiyon 4-7 makromoleküle 3D yapısını yeniden gerekiyordu. Yüksek SNR NS, ön örnek karakterizasyonu için kullanılır ve de novo 3D yeniden üretmek üzere programlanabilen; çözünürlüğü nadiren ağır metal tahıl dehidrasyon ve boyutuna göre dayatılan 20 Å aşıyor. Genel olarak, cryoEM 3D yapısal belirlenmesi için, düşük çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyon, ilk NS elde edilir ve daha sonra cryoEM daha da iç yapısını görmek için, onun yerli hidrate durumda makromolekül incelemek için bu düşük çözünürlüklü ilk haritayı rafine için kullanılan ve çözünürlüğü artırmak için. Hayırte ki NS modeli bozuk edildi (en yaygın örneği dehidratasyon 8 kaynaklanan düzleşme) ve cryoEM parçacıklar düşük SNR, daha sonra bozulma, düşük SNR yaygındır cryoEM modeli (model önyargı dışlayıcı, içine taşımak olabilir olsaydı gerçekleştirmede 9). Yapısal bozukluk NS ve cryoEM ham tanecikler arasında ve ham cryoEM parçacıkları ve düzleştirme yönüne dik 3D modeli, karşılık gelen projeksiyonlar arasındaki uyumsuzluk ile sonuçlanacaktır. 3D modeli ardışık arıtma döngülerine maruz gibi model önyargı başına çözebilir. Bu 3D modeli ham cryoEM parçacıklar ve ilgili projeksiyonlar arasındaki yazışma eksikliği olarak tespit edileceği, meydana olmamalı, daha sonra bir de novo modeli cryoEM verilerinden inşa edilmelidir. İyi bir yaklaşım mümkün olan en iyi cryoEM modelini seçmek için birkaç olası 3D hacimleri verebilir açısal sulandırma algoritması 10, kullanımı, ve sonra NS 3D modeli kullanmak için olabilirBu 11 daha rafine olacak. Daha iyi bir strateji (Tartışma adanmış bölümüne bakınız) cryoEM dataset SNR artırmaktır. saflaştırılmış makromolekül biyokimyasal kalitesi nihai sonucu bir derece etkiye sahiptir. Makromolekül, heterolog sistemlerde dokudan arıtılır veya eksprese, yüksek saflık derecesine sahip ve yapısal olarak sağlam olmalıdır. Bu ne agrega oluşturmalıdır ne de parçalamak gerekir. Belirli bir yapıyı tanımlamak için, hazırlama koşulları muntazam bir oluşum durumunu teşvik etmelidir. Kompleksleri incelemek için, başka türlü fiksatif başarılı düşük afiniteli etkileşimler 12,13 stabilize etmek için kullanılmaktadır, bunların Kd nM aralığında olması en iyisidir. İşlenmemiş cryoEM görüntüleri boyutları hakkında değerli bilgiler, genel hatlarıyla, toplama / multimerizasyon, homojenlik durumunu ve macromolecu iç yapısını verimle. Yine tekniğin potansiyel ölçüde görüntü işleme ile geliştirilmiştir. Bir 3D yapı, makromolekül genel mimarisini, ligand ve alt-birimleri, bu şekilsel değişikliklere ve 3D konum ortaya çıkarır ve X-ışını kristalografisi veya NMR yolu ile belirlenen atomik yapılarının yerleştirme sağlar. çözünürlük arttıkça 3D rekonstrüksiyon bilgi miktarı adım adım artar: Genel 15-20 Å çözünürlükte 9-10 Å alfa heliksler de, atom yapıların kesin yerleştirme izin 5 Å azından ayırt etmek mümkün, çubuklar gibi görünür Beta levhalar ve 3.5 Å ve daha iyi çözünürlükte bir atom modeli 14 inşa etmek mümkündür. olasılığı en az 0.05 mg 3-5 ul / mL olarak bir TEM ızgara hazırlamak için yeterli olan, bilgi görüntü ve cryoEM çekici bir teknik bu örnek, nispeten küçük miktarlardaki SPA kullanılarak bir 3D yeniden elde edildi. Minimum gereksinimler enstrümantalcryoEM bir ev yapımı veya ticari kriyo-piston, ultra yüksek vakum, görüntü kayıt ortamı ve düşük doz kiti olarak, pompa istasyonu, bir ışıma boşaltma aygıtı ile bir kriyo-tutucu ve bir buharlaştırıcı ile bir elektron mikroskobu bulunmaktadır. TEM&#39;de zorunlu olmayan ancak daha arzu edilen özellikler (tüm modern dardı mevcut) CCD kamera veya doğrudan elektron dedektörü, alan emisyon tabanca (FEG), enerji filtreleme ve yüksek verimlilik veri toplama yazılımı vardır. Prensip olarak bu yazılım, ancak artan veri depolama ihtiyaçlarını ve sonraki denetimli sonrası işlem süresi ihtiyacı dikkate alınacak, bir tek cryoEM oturumda 15 onlarca parçacıkların binlerce toplama sağlar. Kontrast transfer fonksiyonu (CTF) düzeltme ile birlikte FEG alfa helis görselleştirmek için yeterli çözünürlük ulaştı çoğu 3D rekonstrüksiyon yatmaktadır. Bu noktada, çözünürlük düzeyi de örnek-bağımlı: 10 Å çözüme ulaşma zar proteinleri için daha az yaygın olup olmadığını isesimetri yüksek mertebeden atomik çözünürlük daha ulaşılabilir sonra mevcut. doğrudan elektron dedektörü son gelişmeler cryoEM elektron yoğunluğu haritaları kalitesi, bu X-ışını kırınım verileri 16,17 türetilen uygundur (4x) düşük ya da hiç simetrisi bile moleküller için atomik çözünürlük sağladı. Tekniğin yeteneklerini gösteren Pratik örnekler cryoEM yapısal kararlılık devam eden bir baş rolü vardır makromoleküllerin dört önemli türleri için burada verilmektedir. 60-kat ve sadık ve tekrarlanabilir uyum izin onların büyük boyutuna göre veri kümesi artar kendi ikosahedral simetri ile (i), birkaç ikosahedral virüslerin yapıları SPA 18, ardından cryoEM tarafından yakın atom çözünürlüğe çözüme kavuşturuldu. Bu ikosahedral virüslerinden, adeno-bağlantılı virüsler (AAVler) içindeki bir sınıfın bir örneği göstermektedir olan cryoEM tarafından ve cryoEM / X-ışını hy yakınında atom yapılarıbrid yöntemler 19,20 vardır. (Ii) sarmal yapıya sahip makromoleküller mikrotübüller, filamentler ve virüsleri içermektedir. Sarmal eksen boyunca Onların tekrarlayan birimler sarmal geometri 21 adapte SPA daha karmaşık bir sürümü ile analiz edilebilir. Örneğimizde, tütün mozaik virüsü (TMV), cryoEM 22 vasıtasıyla atomik ayırım çözüldüğü bir RNA virüsü göstermektedir. (Iii) geniş çözünür proteinler fazlasıyla incelenmiştir. Bunlar arasında, simetrik multimerik silindir oluşturan makromoleküller genellikle subnanometer çözünürlükte 23,24 çözülmüş bir yinelenen mimari oluşturmaktadır. Burada bir melez moleküler modeli cryoEM / x-ışını kristalografisi hibrid yöntemleri 25 oluşturulduğu KLH, bir omurgasız oksijen taşıyıcı görüntüleri gösterir. (Iv) Membran proteinleri proteinlerin önemli bir sınıfıdır; insan genomu tarafından kodlanan proteinlerin yaklaşık 1/3 oluşturan, henüz vadesi tr ile ilgili karmaşıklıklar yapısal karakterize etmek zordurBirleştirilen herhangi bir yapısal olan teknikle çözülen yapılar az% 1.5 oluşturan ansmembrane alan sabitleme 26. yapısal tespiti cryoEM ve 3B yeniden rolü riyanodin alıcısı (RyR), kas kasılması ve beyin sinyal verme açısından önemli büyük bir ökariyotik hücre içi Ca + 2 kanal ile örneklenmiştir. Bugüne kadar en yüksek çözünürlükte cryoEM yapıları, 10 Å çözünürlük ile, ikincil yapıyı 27 göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:243px;">Ethane</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">371745</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:243px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27135</td>
			<td style="width:167px;">99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5326</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mica sheets, 1 x 4 cm</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Graphite rods, presharpened size 1/8&#8221; dia x 2 &#188;&#8221; long tip 0.039&#8221; dia neck type</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">70220-45</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">350 ml cryo-dewars</td>
			<td style="width:132px;">Pope</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids&#160; Quantifoil</td>
			<td style="width:132px;">Quantifoil</td>
			<td style="width:119px;">Q10525</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td>
			<td style="width:132px;">Protochips</td>
			<td style="width:119px;">CF-1.2/1.3-4C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Glow discharge device</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Model E7620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Turbo pumping station</td>
			<td style="width:132px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;">Model 655</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Carbon evaporator</td>
			<td style="width:132px;">Denton Vaccum</td>
			<td style="width:119px;">Model 502B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Freeze plunger</td>
			<td style="width:132px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software EMAN</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:243px;">Image Processing software Spider</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software Freealign&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">3D visualization software Chimera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td>
			<td style="width:132px;">Biosyn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Şekil 1&#39;de özetlenen tüm protokol adımları dikkatli yürütme dondurulmuş sulu olmayan lekeli makromoleküllerin görselleştirme sağlar. Farklı yapısal özelliklere sahip dört temsilci örnekler için sonuçlar gösterilmiştir. NS ve cryoEM yöntemleriyle elde edilen mikroskopik görüntü (Şekil 2) karşılaştırılır. AAV5 (i) AD görüntüleri 130 Â çaplı virüs benzeri partiküller ortaya koymaktadır. Dolu ve boş yapıların birlikteliği sırasıyla, ve yapısal olarak sağlam capsids (leke girişine izin olduğunu) kırık karşılık gelir. CryoEM eşit boş yapıları göstermektedir; Gerçekten de, bu viral partiküller genetik malzeme 28 ihtiva etmez. CryoEM kendi ikozahedral formunu yansıtan, çoğunlukla altıgen parçacıklar gösterir ise NS baskın yuvarlak parçacıkları gösterir. (Ii) her iki 23, görünür bir sarmal tekrar ile sık sık uzun süre 0.1 um 180 bir çapa ve değişken uzunlukta sarmal TMV göstermektedir çubuklar görüntüleri,NS ve cryoEM içinde. 40, merkezi bir kanal cryoEM görüntü NS görüntülerde leke ve boş ile doldurulur. (Iii) Yerli KLH, 8 MDA bir didecamer, 350 Å çapı ve 400 Å uzunluğu karakteristik varil toplanır. NS ve cryoEM KLH en dikdörtgen yan görünümleri ve dairesel görünümler sonu üzerinde ortaya. Her iki teknik altı simetri eksenine dik yarıkları ve her katman içinde eşit aralıklı morfolojik birimleri ortaya koymaktadır. CryoEM boş iç yapısını ortaya koymaktadır. (Iv) Riyanodin reseptörü, 2.26 MDA büyük bir tetramerik hücre içi kanal, 275 x 275 Å 2 kare olarak görülüyor. Böyle bir merkezi haç ve NS tarafından leke birikimi olarak tezahür merkezi depresyon gibi cryoEM tarafından düşük yoğunluklu bölgeler gibi Girift yüzey özellikleri. NS dört test edilen numunelerde içindeki kontrast gösterirken, cryoEM panellerin Bu karşılaştırma, bu membran proteini çözünür hale getirmek için deterjan bulunması RyR1 alt SNR (kontrast) ortaya koyar. Kristal buz, buz kirlenme, astigmatizma ve web-benzeri yapılar (Şekil 3): cryoEM eserler tipik örnekleri RyR1 için gösterilmiştir. Onların nedenleri ve önleme daha tartışma bölümünde açıklanmıştır. Dondurulmuş sulu RyR1 SPA ve 3D rekonstrüksiyon proteinin homotetramerik organizasyonu (Şekil 4A) yansıtan dört kat simetrik yapısını ortaya koymaktadır. sitoplazmik alan Å 3 275 x 275 x 120 bir kare prizma oluşturur ve bir iskele-benzeri bir yapı oluşturan birçok tekrarlanabilir küresel etki içerir. transmembran 115 x 115 x 60 Å 3 maksimum boyutları ile daha küçük konik kare prizma oluşturur. 10 Å çözünürlükte alfa helis (Şekil 4B) görselleştirmek mümkündür. 3D fark haritalama, bu durumda, bir 12 kD proteini düşünüldüğü bir FKBP12 3D farkı ilk önemli ligandların konumunu ortaya çıkarabilirRyR1 kırmızı bir alt-birimi, RyR1 (Şekil 4C) 29 üzerine bindirilir. Son olarak, yapısal değişiklikler makromolekül dinamik bir görünüm sağlar. Bu durumda RyR1 önce açık durumda (Şekil 4D) 27 kapalı bir kitle translokasyon kapalı ya da açık koşullarda ortaya stabilize. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> Cryo elektron mikroskopisi tekniği Şekil 1. Akış şeması. Diyagram protokolü temel adımları vurgulamaktadır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> Numunelerin çeşitli NS ve cryoEM 2. Karşılaştırma Şekil. (A), AAV5, bir ikosahedral virüsü. Helezoni virüsü (B), TMV. Insets 23 Å sarmal tekrarı, gösterir. (C) Yerli KLH. (D) RyR1; temsili görünümleri (f dört kat görünümü ve s, yan görünümü) vurgulanır. Bütün numuneler, düşük doz ve koşullar altında 200 kV bir hızlandırma gerilimi altında 50,000X bir aynı büyütmede görüntülü. Ölçek çubukları, 10 nm. Tüm NS örnekleri karbon desteği üzerinde, cryoEM örnekleri A, C, D quantifoil üzerinde ince karbon üzerinde, ve cryoEM örnek B quantifoil delikleri üzerinde doğrudan. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> Şekil, bir RyR1 cryoEM örnek ortak cryoEM eserler gösteren görüntü 3. Fotoğraflar. (A) kristal buz. (B) Buz kirlenme (oklar). (C) Astigmat. Astigmat görüntüde RyR1s zorlukla görülebilir. Sağdaki ilave güç SPECT gösterirAsimetrik Thon halkaları görüntünün rom. Soldaki ilave referans olmayan bir astigmat görüntünün güç spektrumunu gösterir. (D) Web-benzeri yapılar. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> Riyanodin reseptörünün 4. cryoEM ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon Şekil. (A). Isosurface temsili (B), atomik koordinatlar ve cryoEM zarf arasında iyi bir uyum gösteren RyR1 en N-terminali 30 arasında bir kristal yapısının Yerleştirme; oklar yapıdan çıkan iki alfa heliksler işaret. Ok başı iyon kanalının gözenek çevreleyen dört sarmallarının birini gösterir. noktalı çizgiler, membran sınırlarını göstermektedir. (C), RyR1 ve 3B loFKBP12 ligandı (turuncu renk) katyon. (D) açık (siyah örgü) Uyum kapalı (turuncu) den gidiş RyR1 konformasyonel değişiklikler. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction at JoVE.com

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

do-s-don-ts-cryo-electron-microscopy-primer-on-sample-preparation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

45.9K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Video: Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Biyoloji

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA Mikroarray&#39;ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal colony. Proper collection of tissues for further histological processing can impact the quality of testing results. This article describes the conduct of a basic gross examination including identification of heart, liver, lungs, kidneys, and spleen, as well as how to collect those organs. Additionally four of the more difficult tissue/sample collection techniques are demonstrated. Lung collection and perfusion can be particularly challenging as the tissue needs to be properly inflated with a fixative in order for inside of the tissue to fix properly and to enable thorough histologic evaluation. This article demonstrates the step by step technique to remove the lung and inflate it with fixative in order to achieve optimal fixation of the tissue within 24 hours. Brain collection can be similarly challenging as the tissue is soft and easily damaged. This article demonstrates the step by step technique to expose and remove the brain from the skull with minimal damage to the tissue. The mesenteric lymph node is a good sample type in which to detect many common infectious agents as enteric viruses persist longer in the lymph node than they are shed in feces. This article demonstrates the step by step procedure for locating and aseptically removing the mesenteric lymph node. Finally, identification of infectious agents of the respiratory tract may be performed by bacterial culture or PCR testing of nasal and/or bronchial fluid aspirates taken at necropsy. This procedure describes obtaining and preparing the respiratory aspirate sample for bacterial culture and PCR testing.

This article describes the procedures for conducting a basic postmortem examination of a mouse or rat, and the collection of basic organs, as well as more challenging sample types from for histological, microbiological, and PCR evaluation.

Tanı Otopsi ve Sıçanlar ve Fareler Seçilmiş Doku ve Örnek Toplama

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Kalite İnositol Pyrophosphates hazırlanması

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...