Diese Forschung wurde durch die National Institutes of Health Grant (R01-DE025985) und durch eine amerikanische Krebs Gesellschaft Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch unterstützt durch Zuschüsse aus dem US Department of Agriculture (2015-67015-23268 und 2014-67015-21787) und neue Research Initiative Grant University of California, Davis.

Achtung: Zelllinien verwendet in diesem Verfahren infektiöse Viren enthalten, seien Sie vorsichtig und nur in Stufe 2 BSL Anlage oder höher gehen.
1. Handy-Vorbereitung und Wartung
<ol><li>Kulturzellen TREx-K-RTA BCBL-1 (oder ein anderes KSHV infiziert PEL-Zell-Linien) in RPMI1640 Medium mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung ergänzt.</li>
	<li>Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2) sicherstellen, dass kontinuierlich wachsen und Zellen geteilt durch ein Verhältnis von 1:4 alle 2 – 4 Tage.</li>
	<li>Überwachen Sie Zellkulturen mit einem Lichtmikroskop jeden Tag bestätigen gute Zellwachstum und Morphologie, ansonsten empfiehlt es sich, die Zellkultur neu zu starten oder die Zelle Kulturbedingungen entsprechend anpassen.</li>
</ol>(2) Thymidin-Synchronisation und lytischen Induktion
<ol><li>In einer 10 cm Petrischale Platte TREx-K-Rta BCBL-1 Zellen in frisch zubereitete Medien (1 x 106 Zellen/2 mL der Medien)</li>
	<li>Fügen Sie 200 mM Thymidin (Endkonzentration: 2 mM) in die Schale mischen und 18 h inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in frisch zubereiteten Medien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In frisch zubereiteten Medien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen, die S-Phase für 8 h beenden.</li>
	<li>Hinzufügen von Thymidin (Endkonzentration: 2 mM), mischen und 16 h inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in frisch zubereiteten Medien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In frisch zubereiteten Medien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Um virale Reaktivierung zu induzieren, 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, Endkonzentration 20 ng/mL) und Doxycyclin (DOX, Endkonzentration 100 ng/mL) für die Zellkultur, mischen und 4 h inkubieren. Stimulieren Sie für Zell-Linien ohne eine K-Rta induzierbaren Kassette Reaktivierung mit TPA (Endkonzentration 20 ng/mL und Natrium Butyrat (1 mM)).</li>
	<li>Zentrifuge, die Zellen für 5 min bei 500 X g. Waschen der Zellen mit sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), erneut Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen in komplette Kulturmedien. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. In komplette Kulturmedien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen für 24 h zu wachsen.</li>
</ol>(3) Fixierung und Permeabilisierung
Hinweis: Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher Befestigung Lösung (3,7 % Formaldehyd in DEPC-behandeltem PBS) Diethyl Pyrocarbonate behandelt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DEPC-PBS), Glycin DEPC PBS (Endkonzentration von Glycin: 100 mM) und Permeabilizating Lösung (50 % Aceton, 50 % Methanol) sind bereit. In der Regel wird jede Folie benötigen mindestens 0,5 Millionen Zellen, vermehren, wenn notwendig und umfassen zusätzliche Zellen für Rücken vor allem, wenn Zellen nicht gesund sind.
<ol><li>Sammeln Sie Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Zentrifuge für 2 min bei 200 X g. waschen den Zellen die Zellen 3 Mal mit 1 mL sterile DEPC PBS. In 1,2 mL DEPC PBS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Legen Sie die entsprechende Anzahl von Deckgläsern (bestimmt durch den Versuchsaufbau) in den Böden der 6-Well-Platte.</li>
	<li>Pipette 200 µL der Zelle DEPC PBS-Mischung auf jeden Deckglas, sicherzustellen, dass mindestens 0,5 Millionen Zellen auf jeder Folie. Können Sie die Zellen für 2 min zu begleichen, und aspirieren Sie überschüssige DEPC PBS verlassen nur eine dünne Schicht von Zellen. Es ist normal, dass Zellen in diesem Prozess entfernt werden. Achtung: PFA ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>Fügen Sie sorgfältig 1 mL der Lösung (3,7 % Formaldehyd in DEPC PBS) für jede Deckglas Befestigung. Lassen Sie die Zellen für 10 min beheben.</li>
	<li>Waschen Sie Deckgläsern 3 Mal mit DEPC PBS.</li>
	<li>Sorgfältig fügen Sie 1 mL Glycin DEPC PBS (Endkonzentration von Glycin: 100 mM) auf jeder Deckglas. Lassen Sie die Zellen für 5 min zu stillen.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 mL DEPC PBS und entweder auf einen Shaker für 5 min hinzu oder schütteln Sie fest aber vorsichtig in die hand zu, für 1 min. Absaugen des überschüssigen DEPC PBS. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Zellen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 1 mL permeabilizing Lösung (50 % Aceton, 50 % Methanol) für jede Deckglas sorgfältig. Lassen Sie die Zellen, die für 15 min permeabilize. Hinweis: An dieser Stelle können die Deckgläsern in einem Gefrierschrank-20 ° C nicht länger als eine Woche gespeichert werden. Vermeiden Sie einfrieren zu oder minimieren Sie die Zeit in den Gefrierschrank, wie schnell die Bildqualität verschlechtern kann. Sicherstellen Sie, dass wenn Sie in den Gefrierschrank, den die Zellen bleiben feucht und bedeckt in Methanol/Aceton und um sicherzustellen, dass sie nach der Entnahme aus der Tiefkühltruhe richtig mit DEPC PBS rehydrieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 mL DEPC PBS und entweder auf einen Shaker für 5 min hinzu oder schütteln Sie fest aber sanft in der hand für 1 min. aspirieren Sie die überschüssige DEPC PBS, achten Sie darauf, die Zellen zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen.</li>
</ol>4. IFA und RNA-Fisch
Hinweis: In Bezug auf RNA Fisch Sonde Kennzeichnung und Vorbereitung: für die K-Rta Intron 959 Basenpaare, 31 verschiedenen Sonden wurden generiert, die begnügten 20 Basenpaare jeweils mit einem GC von etwa 50 %. Arbeits- und Lager Lösungen der Sonden wurden bzw. regelmÄÑig in 100 µM und 2,5 µM Konzentrationen.
<ol><li>Objektträger mit notwendigen experimentellen Daten oder irgendeine Art von unterscheidbar Label zu kennzeichnen.</li>
	<li>Linie unten einen verschließbaren Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch.</li>
	<li>
Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung (1,5 µL LANA Antikörper, 0,75 µL RNA-Pol-II-Antikörper, 3 µL des Bäckers Hefe tRNA, DEPC PBS bis zu 30 µL), und multiplizieren Sie Rezept für jede vorhanden Deckglas. Platz 30 µL Primärantikörper Lösung auf jeder beschrifteten Objektträger.
	<ol>
<li>Titrieren Sie zunächst den primären Antikörper von Interesse und nutzen Sie die optimale Menge. Achten Sie darauf, gereinigte IgG zu verwenden, da Serum (Aszites-Flüssigkeit) große Menge von RNase enthalten kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Deckgläschen (Zellen mit Blick auf die Lösung) auf die beschrifteten Objektträger und verschieben Sie die Folien in den Behälter mit der feuchten Papiertuch. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Das äußere des Containers mit Plastikfolie abdecken. Bewegen Sie den Container in einen Inkubator, eingestellt auf 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Fisch-Waschpuffer (2 X Kochsalzlösung Natriumcitrat Puffer (SSC) (final), 10 % Formamid, 90 % DEPC dH2O).</li>
	<li>2 x Hybridisierung Puffer vorzubereiten (4 X SSC, 20 % Dextran Sulfat).</li>
	<li>Bereiten Sie den sekundären Antikörper und Fisch Intron Sonde Puffer (20 µL 2 x Hybridisierung Puffer (letzte 1 x Hyb-Puffer), 4 µL der Bäckerhefe tRNA (letzten 10 %), 4 µL Formamid (letzten 10 %), Intron K-Rta-Sonde (final 125 nM), 0,8 µg Sekundärantikörper, DEPC dH2 O bis zu 40 µL). Multiplizieren Sie Rezept für jede Folie benötigt.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Inkubation Zellen 3 Mal mit DEPC PBS in einer 6-well-Platte für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie mit Waschpuffer Fisch 3 Mal für 5 Minuten. Halten Sie Deckglas in Fisch-Waschpuffer bis Ziel vorbereiten Mischung von Zweitens Antikörper und Intron Sonde (Schritt 4,7).</li>
	<li>Sauberen Objektträger für Primärantikörper Inkubation für die Hybridisierung verwendet.</li>
	<li>Platz 40 µL der Sekundärantikörper und Fisch Intron-Sonde, die Lösung in jedem Glas Folie enthalten.</li>
	<li>Legen Sie Deckgläsern mit den Zellen auf dem Objektträger mit der Zelle-Seite nach unten auf den Puffer, darauf achten, nicht sein, Luftblasen einzuführen.</li>
	<li>Legen Sie die Folien in einem Plastikbehälter mit einem feuchten Papiertuch auf den Boden. Wickeln Sie Kunststoffbehälter in ersten Plastikfolie und dann in Alufolie.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Container mit den Folien bei 37 ° C für 16-24 h.</li>
	<li>Nach der Inkubation sorgfältig schieben Sie das Deckglas aus der Glas-Folie-Rand und setzen Sie wieder in 6 well-Platten nach oben und waschen Sie Zellen mit Fisch-Waschpuffer 3 Mal in einem 6-well-Platte für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 2 X SSC.</li>
	<li>Fügen Sie DAPI (1:1 000) in den 2 X SSC und für 5 min bei Raumtemperatur sitzen lassen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 2 X SSC.</li>
	<li>Reinigen Sie die Glas-Folien für die Hybridisierung verwendet, und fügen Sie 10 µL Montagelösung auf den Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie das Deckgläsern Gesicht nach unten auf die Montage-Lösung. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einem Labor Gewebe vorsichtig das überschüssige Befestigungslösung, wobei Sie darauf achten, nicht um die Zellen zu zerquetschen.</li>
	<li>Mit Nagellack, ein reichlich auftragen um den Rand der Deckgläsern und trocknen lassen.</li>
	<li>Fahren Sie mit Fluoreszenz-Mikroskopie durchzuführen.</li>
</ol>5. 3D Fluoreszenz-Mikroskopie
Hinweis: Protokolle variiert mit der Art der Fluoreszenz-Mikroskop-System verwendet, werden die folgenden Schritte helfen, um den Erwerb von optimalen Bilddaten für die Quantitative Analyse zu gewährleisten.
<ol><li>Vorbehandeln Sie feste Proben und montieren Sie in Anti-Fade Medien, Immunofluoreszenz Fluoreszenz während der Bildgebung zu verzögern.</li>
	<li>Verwenden Sie ein hochwertiges Ziel (z. B. ein 60 X 1,42 N.A Ölimmersion Objektiv), das eine ganze Zelle (oder einen Zellkern) erfassen kann in das Blickfeld.</li>
	<li>Belichtungsparameter (z.B.Erregerleistung, Belichtungszeit) für jeden Farbkanal Fluoreszenz, mit positiven und negativen Kontrollproben festgelegt. Fluoreszenzbilder zu erwerben. Hinweis: Positivkontrolle Proben, die nur eine fluoreszierende Label enthalten sollte auch zur Bestimmung der Höhe des "Übersprechen" zwischen Farbkanäle verwendet werden. Für bildgebende feste Zelle Proben kann Fluoreszenz Erregerleistung (mit etwas längeren Belichtungszeiten) reduziert werden, um Immunofluoreszenz zu minimieren.</li>
	<li>Sobald das Image-Protokoll festgelegt worden, erhalten die gleichen Belichtungsparameter konsistent für alle Proben in einer Studie — so dass Bilddaten genau analysiert und verglichen werden können.</li>
	<li>Führen Sie nach der Übernahme Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion. Identifizieren Sie die K-Rta-Transkripte von RNA-FISH-Signal (rot), LANA-Moleküle durch Immunfluoreszenz (grün) und nuklearen Chromatin (falls zutreffend) gebeizt mit DAPI (blau). Hinweis: Regionen des Zellkerns, in denen K-Rta und LANA Co gruppierten sind sind somit vermutlich virale Transkription Fabriken und Replikation komplexer zugeordnet werden.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren dieses Papiers haben keine finanziellen Verbindungen oder konkurrierenden Interessenkonflikte.

Es gibt einige Aspekte des Protokolls, die geändert werden können, um außergewöhnliche Umstände zu berücksichtigen. Die Wahl der Fixierung und Permeabilisierung Puffer kann auch geändert werden. Für Fixierung Puffer Paraformaldehyd ist auch wirksam und Ethanol für Permeabilisierung genutzt werden.
Abschrecken von Formaldehyd mit Glycin, die PBS empfohlen wird, da es verhindert, dass Formaldehyd deaktivieren die Antikörper in Abwesenheit von Rinderserumalbumin (BSA), aber wenn die Dec...

Es ist immer deutlicher geworden, dass die räumlich-zeitliche Organisation des Kerns eine wichtige Rolle spielt bei der Modulation der fein abgestimmten Genexpression in den Eukaryotes. Die meisten Gewebe spezifische Gene über viele Chromosomen verteilt sind und synchron geregelt werden, um auf bestimmte Reize in einer koordinierten Art und Weise1reagieren müssen. Zellen bauen aktiv Chromatin Naben (ACH) als eine Möglichkeit der Zusammenführung von Genen und deren Cis-regulatorische Komponenten auf einem bestimmten nuklearen Raum1.
Es wurde auch durch verschiedene Studien nachgewiesen, dass obwohl der Kern sehr dicht und Viskose scheint, biologisch aktive Molekülen Nucleus ziemlich schnell per Diffusion2durchlaufen können. Als Folge dieser ephemeren Eigenschaft springen"" die meisten DNA-bindende Proteine von verbindlichen Website Website, Gefühl, ihren Weg um die nuklearen Raum, ermöglicht eine sehr anpassungsfähige und vielseitige Kern2als verbindlich.
Trotz dieses dynamische Verhalten von Biomolekülen innerhalb des Zellkerns, nukleare Einrichtungen ohne Membranen wie z. B. (aber nicht beschränkt auf) die Nukleolus, Cajal Körper und Promyelocytic Leukämie nuklearen Einrichtungen (PML-NB) noch vorhanden sind. Es ist durch eine Vielzahl von Mechanismen wie DNA Tandemwiederholungen (Nukleolus), rRNA (Nukleolus) und Strukturproteinen wie coilin (Cajal Bodies) oder PML Proteine (PML-NB), die diese Konstrukte zusammen3,4,5 halten . Diese Strukturen und anderen Gemeinden wie Transkription Fabriken dienen als Gerüste, die erhöhen nicht nur die lokale Konzentration von erforderlichen Komponenten, sondern Regeln auch die Zusammensetzung von Proteinen und Nukleinsäuren in ihnen letztendlich schaffen eine zentraler Standort für effiziente Zellfunktionen6.
Wann und wo atomare Strukturen Form bietet eine Fülle von Informationen für Forscher studieren Epigenetik zu visualisieren. Aus Sicht der Virologie der Reaktivierung der latent infizierten Viren, z. B. KSHV, erheblich verändert die Landschaft des Kerns und Verteilung der nuklearen Enzyme, Transkription in erster Linie aus zellulären Genen auf virale Gene, letztlich zu verlagern, voll funktionsfähige virale Nachkommen7,8zu produzieren. Wie manipuliert KSHV zelluläre gen Ausdruck Maschinen, virale Genexpression zu erleichtern? Solche Informationen könnten auch Aufschluss über zeitliche zelluläre gen Regulationsmechanismen.
Wie alle anderen Herpesviren hat KSHV zwei Lebenszyklen lytischen Replikation und Latenz genannt. KSHV befindet sich in erster Linie in der Latenz-Phase, in der die meisten seiner viralen Gens Ausdruck zum Schweigen gebracht wird, außer Latenz Gene9,10verbunden. Während der Wartezeit, die KSHV produziert verbundene Latenz nuclear Antigen (LANA), die konstitutiv bindet das virale Genom und Anbindehaltung virale Chromatin der menschlichen Chromosom11. Wegen Lanas intime Beziehung mit das virale Genom ist es möglich, IFA und DAPI zu färben und zu lokalisieren, wo der viralen Episomes in Bezug auf die Host-Chromatin waren zu verwenden.
Um KSHV Reaktivierung auf der Ebene der einzelnen Episome und die Assoziation mit anderen viralen Episomes in einer infizierten Zelle zu untersuchen, wurde eine Strategie suchen aktiv Transkription viraler Chromatin in Situ gegründet. Dementsprechend wurden LANA und RNAPII IFA mit Intron-RNA-Fisch kombiniert, durch die Generierung von RNA-FISH-Sonden, die an der Intron-Region (genaue Sonde finden Sie Sequenzen in die Izumiya Lab neueste Veröffentlichung8) binden KSHV K-Rta-die wichtigsten virales Protein, das ist, notwendig und ausreichend für KSHV Reaktivierung-es möglich war, wo Transkription tatsächlich nahm Platz8,11,12,13,14,15 . Diese Intron-RNA-FISH-Technik ermöglicht Forschern zu visualisieren, wo mRNA transkribiert ist, sofort bevor es gespleißt und, Zytoplasma16,17 exportiert.
KSHV kann reaktiviert werden, durch verschiedene chemische Reize, einschließlich Phorbol Ester wie 12-O-Tetradeconoyl-Phorbol-13acetate (TPA) und Histon-Deacetylase-Hemmer wie Natrium Butyrat, zusätzlich KSHV durch Überexpression von reaktivieren induziert werden können die virale Transkriptionsfaktor, K-Rta-19. Forscher haben erfolgreich erhöht die Effizienz der KSHV Reaktivierung durch die Synchronisation der Zelle Zyklen vor Induktion Reaktivierung18. So wurden für diese Spezialuntersuchungen Zellen synchronisiert, mit einen doppelten Thymidin-Block (Protokoll beschrieben) und für eine kurze Zeit mit TPA und Doxycyclin (Dox) inkubiert. Doxycyline wurde verwendet, weil in diesen Experimenten verwendeten Zelllinie eine Doxycyclin-induzierbaren K-Rta-Kassette, die wurde von cDNA kloniert und beinhaltet nicht die Intron-Region von K-Rta hat. Es ist zwar möglich, reaktivieren KSHV mit K-Rta Ausdruck nur induziert, es ist von anderen Forschern nachgewiesen worden, dass aufgrund einer Vielzahl von verschiedenen biochemischen Faktoren K-Rta Ausdruck allein erweist sich als ein schwacher Reaktivierung Reize20. Durch die Kombination aller dieser, und durch die Droge Inkubationen für einen kurzen Zeitraum zu begrenzen wurde eine robuste, aber nicht übermäßig künstliche KSHV Reaktivierung für die Bildgebung erreicht.
Nach LANA, RNAPII, Kennzeichnung K-Rta Introns und DNA als in diesem Dokument beschriebenen, 3D Fluoreszenz-Bildgebung erfolgte mittels einer Weitfeld Dekonvolution Mikroskop. Nach der Bearbeitung mit imaging-Software kann die räumliche Verteilung der aktiven viralen Episomes richtig ausgewertet werden. Mit dieser Technik können die zentralen Fragen über die grundlegende Natur der Bildung von aktiven Chromatin Hubs und andere atomaren Strukturen untersucht werden. Mit identischen virale Episomes in eine einzelne Zelle, die die gleichen regulatorischen Elemente verarbeitet kann eine einzigartige Recherche-Tool zur Vertiefung des Verständnisses der raumzeitlichen gen Regulationsmechanismen darstellen.
Eine Einschränkung von imaging-mehrere Zelle Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert um eine von Natur aus molekularen Dynamik zu charakterisieren ist, dass subtile oder kleine Änderungen bei Fluoreszenz Verteilung unentdeckt oder als unbedeutend. Dies gilt, sofern in dem seltenen Fall, jede Zelle beobachtet die gleiche subtile Änderung zeigt. Daher kann nicht die volle raumzeitliche Beziehung aktive virale Transkription und anderen atomaren Strukturen mit festen Bildgebung kritisch beurteilt werden. Um diese technischen Herausforderungen zu begegnen, ist der beste Ansatz, Bild lebenden Zellen, die virale Episomes geprägt haben und die Lage der wichtigsten zellulären Enzymen im Laufe der Zeit folgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">RPMI medium 1650 GlutaMAX</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:167px;">Needs to be warmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Omega Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FB-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10378-016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Thymidine&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">TPA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium Butyrate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde Solution&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">252549</td>
			<td style="width:167px;">Corrosive, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-5758</td>
			<td style="width:167px;">Acute toxicity&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">410225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">179124</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Chemical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td>
			<td style="width:71px;">Advanced Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">13-210-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">05-623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ribonucleic acid, transfer from baker&#8217;s yeast (S. cerevisiae)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9014-25-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15557044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formamide&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">295876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">1916C093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">DAPI (4&#8217;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">slowFade Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micro cover glass 22x22</td>
			<td style="width:71px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">C022221</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">VoloCITY</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">3D imaging software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DeltaVision microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Superfrost/Plus microscope slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

Es ist bekannt, dass räumliche und zeitliche Regelung der Gene Bestandteil ist des Regierens richtige Genexpression. Daher ist es von unschätzbarem Wert zu verstehen, wo und wann Transkription in nuklearen Raum stattfindet und die Beziehung zwischen Episomes innerhalb der gleichen Zellkern infiziert zu visualisieren. Hier, Immunfluoreszenz (IFA) und RNA-Fische wurden Combinedto identifizieren aktiv Transkription Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) Episomes. Durch Färbung KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA), ist es möglich, zu finden, wo virale Episomes im Zellkern vorhanden. Darüber hinaus können durch die Gestaltung von RNA-FISH-Sonden, um der Intron-Region eines viralen Gens zu Zielen, die nur während der produktiven Infektion ausgedrückt wird, im Entstehen begriffenen RNA-Transkripte befinden. Mit dieser Kombination aus molekularen Sonden, ist es möglich, die Montage von großen virale Transkription Fabriken visualisieren und analysieren die räumlichen Regulierung der viralen Genexpression während KSHV Reaktivierung. Durch die Einbeziehung Anti-RNA-Polymerase II Antikörper Färbung, kann man auch die Assoziation zwischen RNA-Polymerase II (RNAPII)-Aggregation und KSHV Transkription bei Reaktivierung sichtbar machen.

Eine leicht gekürzte Protokoll wurde durchgeführt, wo BCBL-1-Zellen dienten und nur LANA und K-Rta RNA (Abbildung 1 gefärbt wurden). Dieses Experiment kann wir prüfen, wo aktiv Universalklassifikation virale Episomes sind und die Heterogenität der Reaktion auf KSHV Reaktivierung Reize in einer Bevölkerung der Zellen. In der Zelle wird durch den Pfeil in Abbildung 1ist die verschiedene K-Rta-Fluoreszenz in Regionen, in denen...

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Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K Aufrufe.  University of California, Davis. Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Serie: Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Forschung

Biologie

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...