Wir würden gerne Elizabeth Sumner für ihre Hilfe, die Bearbeitung dieser Handschrift zu erkennen. Finanzierung für dieses Projekt war Teil von The Moody Project für Translationale traumatische Verletzungen Hirnforschung und RO1NS052532 HLH geboten.

Hinweis: alle Tierversuche sind durch die institutionelle Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas genehmigt, wie von den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Nutzung der Versuchstieren (8. Auflage, National Research Council).
 1. Gewebe Sammlung, Region Identifikation und Berandungen <ol><li>Thema Erwachsene, Männlich, Sprague-Dawley Ratten, etwa sechs Wochen alt und 250-300 g, experimentelle Flüssigkeit Percussion Verletzungen, wie in Shimamura Et al. beschrieben. 4.</li> <li>Twenty-Four Stunden nach experimentellen TBI einschläfern menschlich die Tiere indem man sie in eine Kammer mit einer Isofluran-Konzentration von 4 % bis tief narkotisiert. Tod durch Enthauptung zu gewährleisten, Verbrauchsteuern die Gehirne und sofort einfrieren in Pulverform Trockeneis. Store Gehirne in einem Gefrierschrank-80 ° C eingefroren, bis schneiden.</li>
	<li>Vor keinem LCM-Verfahren, die transkriptionelle Analyse beinhaltet alle Oberflächen mit RNase Reinigungsmittel beseitigen, um das Risiko für Verschmutzungen und RNA-Abbau reinigen. 
	Hinweis: Diese Reinigung umfasst die Nutzfläche für Färbung, der Kryostat wo Gewebe geschnitten ist, und die Gegend um das LCM-Gerät.</li>
	<li>Das Hirngewebe von Lagerung und Ort abzurufen, in einem Kryostaten gekühlt bis-20 ° C. zulassen, das Gehirn, um auf die Temperatur der Kryostat Kammer für ~ 10 min. equilibrate</li>
	<li>Stellen die Gehirn ventralen Seite nach oben auf eine Gaze Blatt auf der Oberseite der Kryostat-Bühne. Mit einer Rasierklinge sauber, RNase-freie schneiden Sie den hinteren Teil nur rostral an das Kleinhirn (gespeichert oder verworfen) und das Teil nur anterior Optik Chiasmus (Och).</li>
	<li>Ort eine kleine Menge der optimale Arbeitstemperatur (OCT) Medium in zwei separaten Cryomolds. Legen Sie das Gehirn (mit dem frontalen Verein Kortex (FrA) und dem Nucleus Accumbens Kern (AcbC)) in die Cryomolds vorderen Seite nach unten. Fügen Sie ausreichend OCT-Medium, um das Gewebe zu bedecken.
	<ol><li>Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Gehirngewebe mit dem Hippocampus (Hp) und suprachiasmatischen Kern (SCN).</li>
		<li>OCT Mittel-und komplett für ~ 20 min in der Kryostat einfrieren lassen.</li>
	</ol></li> <li>Einmal die Gewebe und OCT Medium vollständig gefroren sind, drücken Sie eine kleine Menge von OCT auf eine Montage-Kopf und drücken Sie die gefrorenen Cryomolds, enthält das Gewebe auf den Montage-Kopf. Ermöglichen das OAT komplett gefrieren, so dass die Form, die das Gewebe enthält sicher am Kopf befestigt ist.</li>
	<li>Der Kopfaufsatz an der speziellen Halterung zu sichern und die Schraube festziehen. Anpassen den Schnittwinkel in Bezug auf die Kryostat-Klinge mit den Hebeln der Anpassung zu gewährleisten, Querschnitte gleichmäßig.</li>
	<li>Setzen die Schnittdicke bis 30 µm. Wenn die Gewebe-Block mit der FrA und AcbC schneiden, zum ersten Mal schneiden bis Großhirnrinde ersichtlich ist und dann Start sammeln.</li>
	<li>Abschnitte unter Bezugnahme auf die Ratte Gehirn Atlas- 12, Abschnitt und sammeln Gehirn durch sanftes Auflegen Raumtemperatur Polyethylen Napthalate (PEN) Membran Folien auf der geschnittenen Gewebe für die FrA bis der sekundäre motorische Kortex (M2 ) bei Bregma 5,16 mm erreicht ist.
	<ol><li>Visuell gewährleisten Einhaltung gleiten durch die Prüfung, wenn Gewebe und ÜLG auf Folie vollständig geschmolzen sind. Speichern Sie alle Folien mit Gewebeschnitten im Kryostaten bis beflecken.</li>
	</ol></li> <li>Weiter schneiden, bis die vordere Kommissur (Aca) sichtbar und in einem kompletten Kommissur unter die jetzt offensichtlich lateralen Ventrikel (LV) bei Bregma 1.80 mm vereint.</li>
	<li>Sammeln Abschnitte bis die LVs angezeigt Verbindung mit Aca am Bregma 0,84 mm.</li>
	<li>Schnitt für die FrA und AcbC abgeschlossen, Block montiert Gewebe zu entfernen und ersetzen Sie durch den Block mit HP und SCN.</li>
	<li>Abschnitt bis die Och am Bregma-0,480 mm, abgeflacht ist wenn der dritte Ventrikel (3V) erkennbar wird.</li>
	<li>Sammeln Abschnitte für den SCN ab diesem Zeitpunkt bis Bregma-0,720 mm, beginnt die supraoptischen Decussation (Sox). 
	Hinweis: Es möglicherweise notwendig, sammeln mehr Gewebeschnitte während der Och wie die SCN einfach übergangen wird.</li>
	<li>Für HP Sammlung sind Abschnitt bis die Hörner des Granulat Zelle dentate Gyrus (GrDG) Schicht sichtbar offensichtlich am Bregma-3,000 mm.</li>
	<li>Sammeln Abschnitte bis der hippocampal Unterfelder CA in den koronalen Abschnitte am Bregma verschmolzen sind-4,780 mm. Dieses Detail ermöglicht eine komplette Sammlung von Hippocampus unter der Kraniotomie und Verletzungen Website. 
	Hinweis: Wie in früheren Publikationen aus diesem Labor gezeigt, die meisten verletzte Zellen werden innerhalb dieses Bereichs sichtbar und eignet sich für gen oder MicroRNA Expressionsanalyse.</li>
</ol> 2. Färbeprotokoll <ol><li>vor alle färben, waschen Geschirr und Färbung Bereich in einer chemischen Abzugshaube mit RNase-Beseitigung Reinigungsmittel. Dieses Präparat verringert das Risiko der RNA-Abbau durch die Verseuchung.</li>
	<li>Alle Färbung Reagenzien und Lösungen in Nuklease vorzubereiten, freies Wasser.</li>
	<li>Nehmen eine Rack mit Folien in den Kryostaten und Platz in der Dunstabzugshaube gespeichert. Folien für 30 S. Platz erwärmen sie in Färbung Lösungen (mit Nuklease freies Wasser zubereitet) wie folgt zu ermöglichen: 75 % EtOH für 1 min, Nuklease kostenlos Wasser für 1 min, 1 % Cresyl violett für 1 min, Nuklease freies Wasser für 30 s, Nuklease freies Wasser für 30 s , 95 % EtOH für 30 s, 100 % EtOH für 30 s, 3 min Xylol und Xylol für 3 min.</li>
	<li>Ermöglichen das Rack nicht mehr als 10 min bei Raumtemperatur in der Dunstabzugshaube an der Luft trocknen. Alternativ legen Sie Regale in eine Rnase-freie Vakuum Exsikkator zum schnelleren Trocknen. Sobald getrocknet, gehen Sie sofort zum LCM.</li>
</ol> 3. Stereotaktische Atlas geführte Laser Capture Microdissection mit dem LCM-System <ol><li>vor Beginn jedes LCM-Verfahren zur RNA-Analyse, wischen Sie den Abholort und die Gegend um das Gerät mit RNase-Beseitigung von Reinigungsmittel und 100 % EtOH.</li>
	<li>Drehen Sie den ein-/Ausschalter auf der IR-Laser Erzeugungseinheit vor dem Einschalten Mikroskop Basis, und lassen Sie das System zu initialisieren, bevor Software vom Desktop aus gestartet wird. 
	Hinweis: Wenn nicht in dieser Reihenfolge abgeschlossen, die Software nicht erkennen das Mikroskop.</li>
	<li>Sobald die Software gestartet und die Initialisierung Schritte durchlaufen, drücken Sie die &#34; derzeit &#34; Button in der Software &#34; Setup Panel. &#34; die modulare Bühne bewegt sich in Position, wo LCM Makro Kappen und Folien können geladen und off-loaded.</li>
	<li>Legen Sie die Stift Membran Folien in die Halterungen (bis zu drei gleichzeitig) mit satiniertem Rand nach rechts vor. 
	Hinweis: Wenn in der Halterung in der falschen Ausrichtung platziert, die Software möglicherweise nicht richtig erkennen, die gewünschte IR oder UV-Schneidbereich.</li>
	<li>Klicken Sie auf die &#34; Mem &#34; Kontrollkästchen in der &#34; Kappe und Folienbereich Umgang mit &#34; neben der jeweiligen Folie (d.h., A, B oder C). Dieser Schritt bezeichnet, wenn die Folie eine Membran-Glas-Folie ist. Klicken Sie auf die gewünschte Folie zuerst erfasst werden.</li>
	<li>, Die Kamera ein gekacheltes Bild für Gewebe-Standort und Ausrichtung für GAP Praktika zu machen wählen Sie &#34; Bild &#34; auf die Symbolleiste und wählen Sie &#34; erwerben Übersicht. &#34; 
	Hinweis: Wenn der Benutzer vertraut mit dem Gewebe gesammelt ist, dieser Schritt ausgelassen werden durch Verwendung der manuellen Scrollball zur Positionierung der &#34; Region Mitte &#34; für Sammlung.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger über den Bereich auf der gekachelten Bildern (oder relative Position ohne gekacheltes Bild), der rechten Maustaste und wählen Sie &#34; Ort Cap bei Region Zentrum. &#34; die Software findet automatisch eine Kappe über der ausgewählten Position.</li>
	Wählen Sie eine Position aus <li>. 
	Hinweis: Um sicherzustellen, dass die IR-Laser richtig ausgerichtet ist und holt nur Bereiche, in denen Flecken von der Software gelegt werden muss es, bevor Sie fortfahren befinden.
	<ol>
		<li>Umzug in ein Gebiet im Rahmen der GAP, wo kein Gewebe vorhanden ist. Klicken Sie &#34; ich &#34; in der &#34; Microdissect Tools Bereich &#34; und wählen Sie die &#34; IR Locate &#34; Registerkarte ". Im Bereich Brandschutz einen IR-Test shot um zu beurteilen, wo die IR-Laser schießt und die Größe des Spots.</li>
		<li>Mit dem Cursor in der Mitte IR vor Ort und wählen Sie Rechtsklick &#34; gelegen IR Spot. &#34; 
		Hinweis: Größe und Intensität der IR-Strahl können geändert werden, durch die manuelle Veränderung der &#34; Leistung, Durchmesser oder Dauer &#34; unter jeder Punktgröße Designator oder durch Verschieben der gleitenden Skala am unteren Rand des Dialogfelds. Einige Testaufnahmen müssen entlassen werden, um korrekte Punktgröße zu gewährleisten. Der IR-Laser muss jeder beim nächsten Einschalten die Position der Kappe Änderungen oder Folien sind neu gefunden werden.</li>
		<li>Für UV schneiden, lokalisieren den UV-Laser durch die Auswahl der &#34; UV-Locate &#34; Registerkarte im Dialogfeld ". 
		Hinweis: Weil der UV-Laser und die IR-Laser im Einklang bewegen, gibt es keine Notwendigkeit, ständig den UV-Laser jedes Mal wieder zu finden die Position geändert wird.</li>
	</ol></li> <li>Wählen Sie die &#34; Freihandzeichnen &#34; option in der &#34; wählen Sie Tools-Bereich &#34;. Mit einem Touchscreen-Stift, zeichnen Sie im Umkreis der Region des Interesses während darauf achten, nicht den Kontakt zwischen dem Touchscreen und dem Stift Kopf verlieren. Achten Sie darauf, die Anfangs- und Endpunkte miteinander zu verbinden. 
	Hinweis: IR-Spots werden festgelegt werden automatisch durch die Software, aber der Benutzer kann wählen, legte sich zusätzliche Spots zu gewährleisten, das Gewebe ist an der Kappe eingehalten, nachdem UV schneiden durchgeführt worden ist.</li>
	<li>Für FrA Sammlung, führen Sie eine grobe Laser Erfassung der kortikalen Gewebe bis zu wenn die M2-Kortex am Bregma 5,16 mm steht. 
	Hinweis: Dieses Detail kann geändert werden, so dass nur bestimmte Teile des FrA oder bestimmte Zelltypen gesammelt werden.</li>
	<li>Für AcbC Sammlung, Laser Capture eine Gegend in der Nähe in der Nähe der RH. 
	Die Kern und Schale von der AcbC verschiedene Funktionen und sind physiologisch einzigartig. Daher ist es wichtig, die Gehirn-Atlas so nah wie möglich zu folgen. Es empfiehlt sich, sammeln von nicht weiter vorbei an Bregma 0,84 mm, wie die beiden Subregionen zu eng mit einander verbunden werden.</li>
	<li>Für Hp Sammlung, Laser erfassen die CA 1, 2 und 3 hippocampal Unterfelder beginnend am Bregma 3,00 mm und mit vollständig ausgebildeten GrDG als eine physische Wahrzeichen für morphologische Identifikation. 
	Hinweis: Für die Zwecke dieser Studie, sammeln Sie keine Vergangenheit Bregma-4,780 mm, die optisch als Punkt abgegrenzt werden können, wenn die Hp Unterfelder verschmolzen sind und ventral zeigen. Dieser Bereich wurde gewählt, da am meisten verletzt Neuronen können entdeckt werden, direkt nach der Verletzung Seite 6.</li>
	<li>Für SCN Sammlung zuerst visuell identifizieren die dicht gepackten Kerne, die dorsale, die Och sitzen und dann sammeln.</li>
	<li>Nach Sammlung von Regionen (siehe oben), LCM-Makro-Kappen zum Verschieben der &#34; QC Position &#34; und inspizieren für Einhaltung der komplette Gewebe optisch dadurch UV geschnitten Gewebe an der Membran befestigt ist. Schnell setzen Sie die Kappe Ontoan RNase-freie 0,5 mL dünnen ummauerten Reaktionsgefäß mit 100 µL der Zelle Lysis Puffer.</li>
	<li>Vortex Proben kurz zu gewährleisten komplette Lyse bei-80 ° c lagern Zu diesem Zeitpunkt LCM kann angehalten und Proben aufbewahrt bis zur nachgelagerten Genomanalyse 6.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

LCM ist für molekulare Studien über das Gehirn von Säugetieren eine wesentliche Technik geworden. Dieser Artikel zeigt, dass durch die Kombination der IR und UV-Laser Schneiden im LCM System genomische Veränderungen in jeder Region das Gehirn von Säugetieren erfassen kann. Diese Regionen sind mit konventionellen LCM-kompatiblen Flecken wie Cresyl violett oder Hämatoxylin und Eosin identifizierbar. Die Geschwindigkeit des Laser-Capture-Prozess und Leistungsfähigkeit LCM auf dickeren 30 µm Bereiche auf Stift Membran Folien ermöglicht nicht nur ausreichende Mengen von Zellproben zu erhalten, sondern auch RNA von LCM Proben geeigneter Qualität für alle Arten von nachgelagerten zu isolieren genomische Analyse; Diese Analysen umfassen Microarrays16, PCR-Arrays17und quantitative Echtzeit-PCR-18.
Unsere Daten liefern eine Begründung für Studien, die LCM Gewebe zu nutzen. Wir finden, dass MiR-15 b hochreguliert in den Hippocampus und Cortex (Abbildung 4) aber herunterreguliert in dem Nucleus Accumbens und möglicherweise biologisch relevant für das Verständnis der unterschiedlichen Auswirkungen der TBI im Gehirn. Eine frühere Studie vorgeschlagen, dass Erhöhungen der kortikale neuronale Anfälligkeit für Verletzungen durch Überexpression von mehreren MiRNAs entstehen, die pro-überleben Gene, wie Bcl-219negativ regulieren. Ziel-Scan Analyse zeigt Bcl-2 unterliegt auch MiR-15 b; so, unsere Daten deuten darauf hin eine mechanistische Erklärung dafür, warum bestimmte Regionen des Gehirns (d. h., FCx) selektiv für TBI anfällig sein kann. Es ist wichtig zu erinnern, die meisten Gene werden durch mehrere MiRNAs geregelt und korrelierenden Veränderungen in jedem ein MiRNA zu einem bestimmten Ziel-gen ist schwierig. Diese Daten zeigen, dass bestimmte Veränderungen im gen und MicroRNA Ausdruck als Biomarker der Region-spezifischen Hirnschäden verwendet werden können. In der Tat, wir nutzen derzeit diese Daten in Studien Wirkstoffe mit antidepressive Eigenschaften wie neue neuroprotektive differentiell gen und MicroRNA Ausdruck in den Gehirnregionen verbunden mit neuropsychiatrischen Störungen beeinflussen können. Eine Einschränkung unserer Studie ist, dass während der mehrere Schritte der Folie Verarbeitungsverfahren für LCM RNA Integrität beeinträchtigt werden kann. Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Verringerung des Risikos der RNA-Abbau. Eine weitere Einschränkung ist die relativ kleine Stichprobengröße für die statistische Berechnung verwendet. In Zukunft sollten Studien, Erhöhung der Stichprobengröße die Auswirkungen der Gene und MiRNA Ausdruck Unterschiede zwischen den einzelnen Tieren verringern.
Der Vorteil der LCM ist in translational genomischer Studien mit Tiermodellen der Krankheit beim Menschen und kranke Gewebe20,21,22,23realisiert. Ohne die Fähigkeit, spezifische Zellpopulationen zu erfassen wäre die transcriptional Profile der verschiedenen Gehirnregionen eine unerkennbar und düster Mischung von vielen Zelltypen. Mit LCM Methoden im Gehirn Verletzungen Studien führte zur derzeitigen Bemühungen, Gehirn Region spezifische Biomarker zu beschreiben und zu verstehen, wie sie korrelieren mit zirkulierenden Biomarkern der TBI.

Das Gehirn von Säugetiere ist erstaunlich komplex und heterogen mit Hunderten bis Tausenden von Zelle Arten1. In der Tat, Studien am Menschen haben gezeigt, dass in Regionen wie dem frontalen Kortex, strukturelle und funktionelle Unterschiede in weißen und grauen Substanz spiegeln sich in unterschiedlichen und voneinander abweichenden transcriptional Profile2. Gehirn Heterogenität wurde ein großes Hindernis für die Genexpressionsdaten zu interpretieren und auf dem Gebiet der Hirn-Trauma. Diese Mehrdeutigkeit in präklinischen Studien führte anschließend zu Hunderten gescheiterten klinischen Behandlungen für Gehirn-Verletzung-3.
Wir verwenden Laser Capture Microdissection (LCM) Methoden, um Schädelhirntrauma (SHT) zu studieren-induzierte gen Dysregulation in der Ratte Gehirn4, mit Schwerpunkt auf der Hippocampus, eine Hirnregion, die für lernen und Gedächtnis5unerlässlich. Die Fähigkeit, laser-Erfassung und Analyse der Genexpression in sterben und Überleben der Neuronen gibt uns ein besseres Verständnis der Rolle der SCND im Genausdruck in den Ausgang (neuronale überleben) nach TBI6. LCM-Techniken haben auch für die Erforschung der Auswirkungen von TBI auf hippocampal Neuronen, beim Vergleich von jungen und alternden Mäusen7 oder Ratten8bewährt.
In neueren Studien untersuchten wir andere Hirnregionen Ratte negativ beeinflusst von TBI, mit einem Fokus auf Bereiche in Ratten und menschlichen TBI Patienten, die mit leitender Funktion (d. h. frontalen Kortex9) und TBI Komorbiditäten verbunden sind; Diese Begleiterkrankungen sind Depressionen (d.h. Nucleus Accumbens10) und zirkadiane Rhythmusstörungen (suprachiasmatischen Kern11). In früheren Studien, Huusko und Pitkanen12 und Drexel Et al. 13 verwendet LCM zur Genexpression in den Thalamus und Hypothalamus Untersuchung. Unsere Studie baut auf diesen früheren Beobachtungen und umfasst vier anderen Gehirnregionen. Um die regionsspezifischen molekulare Veränderungen nach TBI zu studieren, war es notwendig, Know-how bei der Ermittlung und Beschaffung Zelltypen in diesen Regionen mit einem LCM-System gewinnen. Die UV-schneiden und Infrarot (IR) Laser ermöglichen präzise Mikrodissektion von gewünschten Hirnregionen. Hier beschreiben wir, wie wir verwenden dieses LCM-System, geleitet von stereotaktischen Koordinaten in der Ratte Gehirn Atlas14, um zu identifizieren und laser-Erfassung vier Ratte Hirnregionen, die differentiell durch die experimentelle Flüssigkeit-Percussion Gehirn Verletzungen Methode betroffen sind 4.

<table><tbody><tr><td>Arcturus Laser Capture Microdissection System</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene (Histological grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td><td>UTMB Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactic atlas-guided laser capture microdissection of brain regions affected by traumatic injury

Die Fähigkeit, bestimmte Gehirnregionen von Interesse zu isolieren kann im Gewebe Dissoziation Techniken behindert werden, die nicht ihre räumliche Verteilung beibehalten. Solche Techniken neigen auch potenziell gen Expressionsanalyse, weil der Prozess selbst Expressionsmuster in einzelnen Zellen verändern kann. Hier beschreiben wir eine Lasermethode Erfassung Mikrodissektion (LCM) um gezielt bestimmte Gehirnregionen betroffen Schädelhirntrauma (SHT) durch die Verwendung einer modifizierten Nissl (Cresyl violett) Färbung, Protokoll und der Leitung von einer Ratte Gehirn Atlas zu sammeln. LCM bietet Zugriff auf Hirnregionen in ihren systemeigenen Positionen und die Fähigkeit anatomische Landmarken zur Identifizierung der einzelnen spezifischen Regionen verwenden. Zu diesem Zweck wurde zuvor LCM verwendet, Gehirn Region spezifische Genexpression in TBI zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Auseinandersetzung mit der TBI-induzierte Veränderungen im gen und MicroRNA Ausdruck in verschiedenen Hirnregionen innerhalb der selben Tier. Die Grundsätze dieses Protokolls können geändert und auf eine Vielzahl von Studien, die genomische Ausdruck in anderen Krankheit und/oder Tiermodellen angewendet werden.

Im Schaltplan dargestellt in Abbildung 1 veranschaulicht die gesamten Arbeitsablauf von Atlas geführte LCM von bestimmten Gehirnregionen und nachgelagerte Analyse Anwendungsmöglichkeiten. Diese Studie konzentriert sich auf vier Hirnregionen mit TBI Pathophysiologie und zur Entwicklung der Begleiterkrankungen: FrA, AcbC, SCN und Hp. Eine Einschränkung, die von bestimmten Gehirnregionen in LCM vorhanden ist, dass anatomische Standorten oft durch einen Mangel an definierte Grenzen verdeckt sind, wie in Abbildung 2 (A, D, G, J)gesehen werden kann. Die Verwendung eines Gehirn-Atlas zu führen-Schnitt und laser-Erfassung bestimmter Regionen verringert die Gefahr einer Kontamination der Probe mit Hirnregionen als das Ziel. Wenn darauf geachtet wird, Gewebe Sehenswürdigkeiten, beim Schneiden und nach Nissl-Färbung folgen, bieten LCM-Technologie eine äußerst konsistente Möglichkeit des Erwerbs von diskreten Populationen von Zellen, Kernen oder Regionen15. Die langfristigen Ziele dieser Studien sind Gene und Micro-RNAs, die potenziell als Surrogat, dienen können nichtinvasive Biomarker der Region bestimmten Hirnverletzung zu identifizieren. Der erste Schritt in dieser Biomarker-Entwicklungs-Pipeline ist die Charakterisierung der gewebespezifischen transcriptional Änderungen nach experimentellen TBI. Diese Daten können dann mit Verletzungen verursachten Veränderungen in zirkulierenden auszahlt korreliert werden.
Die vorgestellten Verfahren wurden optimiert, zur Verringerung des Risikos der RNA-Abbau um RNA Analyse über reverse Transkription von Gesamt LCM-RNS vor quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) zu ermöglichen. Gesamt-RNS (einschließlich der kleinen und großen RNA-Spezies) wurde mit einem spaltenbasierten Isolationsmethode auf Gewebe, das Laser-eingefangen von einzelnen Gehirnregionen war isoliert. RNA-Integrität, Qualität und Quantität nach Isolierungsmaßnahmen bewerten, wurden RNA-Proben kurz bei 70 ° C denaturiert und laufen auf einem RNA-Analysator. Qualitative Messungen enthalten Peak Amplituden der 18 s und 28 s rRNA Bands ()Abbildung 3(), die Vertreter der allgemeinen Verschlechterung sein können, zu analysieren und anhand der "RNA Integrität" (RIN). Wenn Sie vorsichtig RNase-freie Techniken verwenden, isoliert RNA von LCM Proben in der Regel Ergebnisse in RINs, die reichen von 6-8. Eine niedrigere RIN kann bedeuten schlechten RNA-Qualität und die Genauigkeit der gen- und MicroRNA Expressionsanalyse möglicherweise verringern kann. Umgekehrt kann eine höhere RIN Vertrauen in die Gültigkeit der Ergebnisse der RNA-Analyse verbessert werden.
RT-qPCR erfolgte mittels Primer/Sonden-Sets für einzelne Gene und Micro-RNAs (Abbildung 4). Ca. 1 ng von Gesamt-RNS war umgekehrt in cDNA umgeschrieben und bereits verstärkt, bevor qPCR laut Protokoll des Herstellers durchgeführt wurde. Verletzungsbedingte Gene untersucht in dieser Studie gehörten BCL2 verbunden X, Apoptose-Regler (Bax), B-Zell-CLL/Lymphom-2 (Bcl-2), Caspase-3, Apoptosis-Related Cystein Peptidase (Casp3) , Brain Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) und CAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb). MiR-15 b wurde ausgewählt, weil sich gezeigt hat, nach experimentellen TBI in einzelnen sterbenden Neuronen verändert werden. Es wurde auch experimentell überprüft und Bioinformatically vorausgesagt gen Ziele mit pro-Überlebensfunktionen (unveröffentlichte Daten). Normalisierte Falte-Änderung-Verhältnisse wurden durch Vergleich gen und MicroRNA Ausdruck in TBI Tiere und naiv-Steuerungen mit Normalisierung zu einem endogenen gen (Gapdh) oder kleine RNA (U6), bzw. ΔΔCt-Methode berechnet. Eine Falte-Änderung über 1 zeigt eine allgemeine Hochregulation in diesem Gen oder MicroRNA, und umgekehrt, eine Falte niedriger als 1 zeigt eine Herabregulation ändern. Statistische Analyse zeigte signifikanten Veränderungen in der Genexpression zwischen TBI und naiv Kontrolle (p ≤ 0,05), die Region des Gehirns angewiesen waren. Keine nennenswerten Veränderungen in MiR-15 b Ausdruck wurden zwischen die TBI und naiv Steuerung erkannt, aber gab es Entwicklungen in Richtung einer höheren und niedrigeren Ausdruck in einem Gehirn Region abhängigen Mode. Diese Daten deuten darauf hin, dass die weitere Optimierung notwendig, Änderungen in MicroRNA Ausdruck zu beurteilen ist. Es ist auch möglich, die Größe der Stichprobe zu klein, um statistische Signifikanz, teilweise aufgrund der inhärenten Variabilität im Ausdruck zu gewinnen war. Zukünftige Studien werden auch Augenwischerei betrieben Tiere um sicherzustellen, dass gen und MicroRNA Ausdruck Änderungen sind TBI und nicht durch die chirurgische Vorbereitung zurückzuführen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Workflow der Atlas-geführte LCM für nachgeschaltete Genomanalyse. (A-F) Verfahren aus tierischen Vorbereitung zur nachgelagerten qPCR-Analyse: (A) Erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley Ratten (~ 6 Wochen alt und mit einem Gewicht von 300 g) betäubt, Fluid Percussion TBI unterzogen und Human eingeschläfert 24 h nach der Verletzung. (B) Serienschnitte (30 µm) frisch gefrorenen Gehirne basieren auf Koordinaten von bestimmten Gehirnregionen (FrA, AcbC, Hp, SCN) aus Paxinos und Watsons The Rattengehirn Atlas. (C) Abschnitte sind feste, Nissl gebeizt (1 % Cresyl violett), dehydriert, und luftgetrocknet. (D). LCM durchgeführt auf Hirnregionen mit einem LCM-System identifiziert. (E) LCM Makro Kappen auf eine RNase-freie 0,5 mL-Tube mit 100 μL der Zelle Lysis Puffer übertragen und bis zur RNA-Isolierung für nachgeschaltete Genomanalyse bei-80 ° c gelagert. RNA kann dann rückwärts transkribiert für gen oder MicroRNA RT-qPCR-Analyse, differentielle Expression der molekularen-Zielen nach TBI und/oder zwischen Hirnregionen von Interesse (F)zu untersuchen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Abbildung 2: LCM von TBI betroffenen Hirnregionen. Repräsentative Bilder von Gewebeschnitten gesammelt von der ipsilateralen Seite der Verletzung Aufstellungsort mit IR und UV-laser-Funktionen auf dem LCM-System (A-ich). Gewebe wurde geschnitten auf einem Kryostat (30 µm) und auf den Stift Membran Folien gesammelt. Abschnitte wurden dann behoben, Nissl-gefärbt mit Cresyl violett (1 %) und zur Identifizierung von bestimmten Gehirnregionen basierend auf anatomischen Landmarken in Paxinos und Watsons die Ratte Gehirn Atlas verwiesen dehydriert. (A-C) Ein Bereich des frontalen Verein Kortex (FrA) (D-F) Komponenten der CA1, CA2 und CA3 pyramidalen Schichten des Hippocampus (Hp) befindet sich neben der voll ausgebildeten Hörner der Granulat-Schicht dentate Gyrus (GrDG). (G-ich) Ein Bereich des Nucleus Accumbens coRe (AcbC) proximal und rostral an der vorderen Kommissur (Aca). (J-K) Suprachiasmatischen Kern (SCN) rostral zu supraoptischen Chiasmus (Och). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Vertreter-Scans von RNS-Qualität. Vertreter Electropherograms und zugehörigen Gelbilder RNA abgeleitet von LCM gesammelt Gewebe (A-D). Electropherograms und damit verbundenen Gelbilder zeigen intakt RNA anhand der Darstellung der 18 s und 28 s rRNA Gipfeln und Gel-Bands. Diese RNA eignet sich für alle downstream-Anwendungen, einschließlich genomic und Proteomic Analysen. (A) Frontal Verein Kortex (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) Nucleus Accumbens Kern-RNA (AcbC). RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic Nucleus (SCN) RNA. RIN 7.6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Nachgelagerte Analyse des Gehirns regionsspezifische gen und MicroRNA Ausdruck über RT-qPCR. Einzelnen RT-qPCR für Gene von Interesse (Bcl-2, Bdnf, Casp3, Bax, Creb) und MicroRNA von Interesse (MiR-15 b) erfolgte am Laser erfasst Hirnregionen nach TBI (Hp und AcbC n = 5, FrA n = 4) und im Vergleich zu unverletzt naiven Tieren (n = 4). Analyse von Genen im Zusammenhang mit TBI Pathogenese erfolgte für Hp, AcbC, FCx. Daten als normalisierte Falte Änderung Verhältnisse im Vergleich zu naiv Kontrolle Hirnregionen dargestellt wird (ungepaarten t-Test mit Welch es Korrektur ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Differentielle Expression von MiR-15 b in verschiedenen Gehirnregionen wird als normalisierte Falte Änderungen im Vergleich zur naiven Kontrolle (± SEM) präsentiert (B). Daten vom SCN (n = 2) nicht enthalten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Wir beschreiben die Verwendung von Laser Capture Microdissection Proben unterschiedliche Zellpopulationen aus verschiedenen Gehirnregionen für gen- und MicroRNA Analyse zu erhalten. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der unterschiedlichen Auswirkungen von traumatischen Hirnverletzungen in bestimmten Regionen des Gehirns Ratte.

Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

stereotactic-atlas-guided-laser-capture-microdissection-brain-regions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Wir beschreiben die Verwendung von Laser Capture Microdissection Proben unterschiedliche Zellpopulationen aus verschiedenen Gehirnregionen für gen- und MicroRNA Analyse zu erhalten. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der unterschiedlichen Auswirkungen von traumatischen Hirnverletzungen in bestimmten Regionen des Gehirns Ratte.

Serie: Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Forschung

Neurowissenschaften

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell populations. To characterize proteome-level variation and tumor heterogeneity at scale, high-throughput methods are needed to selectively isolate discrete cellular populations in solid tumor malignancies. This protocol describes a high-throughput workflow, enabled by artificial intelligence (AI), that segments images of hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained, thin tissue sections into pathology-confirmed regions of interest for selective harvest of histology-resolved cell populations using laser microdissection (LMD). This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of regions denoting cell populations of interest, annotated using digital image software, directly to laser microscopes, thus enabling more facile collections. Successful implementation of this workflow was performed, demonstrating the utility of this harmonized method to selectively harvest tumor cell populations from the TME for quantitative, multiplexed proteomic analysis by high-resolution mass spectrometry. This strategy fully integrates with routine histopathology review, leveraging digital image analysis to support enrichment of cellular populations of interest and is fully generalizable, enabling harmonized harvests of cell populations from the TME for multiomic analyses.

This protocol describes a high-throughput workflow for artificial intelligence-driven segmentation of pathology-confirmed regions of interest from stained, thin tissue section images for enrichment of histology-resolved cell populations using laser microdissection. This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of demarcations denoting cell populations of interest directly to laser microscopes.

Industrialisierte, von künstlicher Intelligenz gesteuerte Laser-Mikrodissektion zur mikroskaligen proteomischen Analyse der Tumormikroumgebung

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Krebsforschung

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Medizin

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controlled Cortical Impact-Modell für traumatische Hirnverletzung

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Ein Mikro-CT-basierte Verfahren zur Charakterisierung von Läsionen und Lokalisierung von Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) occlusion of the middle cerebral artery (MCA) using a catheter. This generally accepted technique, however, has some limitations, thereby limiting its extensive use. Stroke induction by this method is often characterized by high variability in the localization and size of the ischemic area, periodical occurrences of hemorrhage, and high death rates. Also, the successful completion of any of the transient or permanent procedures requires expertise and often lasts for about 30 minutes. In this protocol, a laser irradiation technique is presented that can serve as an alternative method for inducing and studying brain injury in rodent models.
When compared to rats in the control and MCAO groups, the brain injury by laser induction showed reduced variability in body temperature, infarct volume, brain edema, intracranial hemorrhage, and mortality. Furthermore, the use of a laser-induced injury caused damage to the brain tissues only in the motor cortex unlike in the MCAO experiments where destruction of both the motor cortex and striatal tissues is observed.
Findings from this investigation suggest that laser irradiation could serve as an alternative and effective technique for inducing brain injury in the motor cortex. The method also shortens the time for completing the procedure and does not require expert handlers.

The protocol presented here shows a technique to create a rodent model of brain injury. The method described here uses laser irradiation and targets motor cortex.

Laserinduzierte Hirnverletzung im Motor Cortex von Ratten

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes and are defined as the sudden blockage of a vessel supplying blood to the brain. Within minutes of the blockage, cells begin to die and result in irreparable tissue damage. Current therapeutic treatments focus on clot removal or lysis to allow for the reperfusion and prevent more severe brain damage. Although transient brain plasticity may salvage some of the damaged tissue over time, significant fractions of patients are left with neurological deficits that will never resolve. There is a lack of therapeutic options to treat neurological deficits caused by stroke, emphasizing the need to develop new strategies to treat this growing patient population. Injectable biomaterials are currently being designed to enhance brain plasticity and improve endogenous repair through the delivery of active agents or stem cells. One method to test these approaches is to utilize a rodent stroke model, inject the biomaterial into the stroke core, and assess repair. Knowing the precise location of the stroke core is imperative for the accurate treatment after stroke, therefore, a stroke model that results in a predictable stroke location is preferable to avoid the need for imaging prior to injection. The following protocol will cover how to induce a photothrombotic stroke, how to inject a hydrogel in a controlled and precise manner, and how to extract and cryosection the brain while keeping the biomaterial intact. In addition, we will highlight how these same hydrogel materials can be used for the co-delivery of stem cells. This protocol can be generalized to the use of other injectable biomaterials into the stroke core.

Stroke is a global issue with minimal treatment options and no current clinical therapy for regenerating the lost brain tissue. Here we describe methods for creating precise photothrombotic stroke in the motor cortex of rodents and subsequent injection of hydrogel biomaterials to study their effects on tissue regeneration after stroke.

Injektion von Hydrogel-Biomaterialgerüsten in das Gehirn nach einem Schlaganfall

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes ...

Biologie

Cryopreserved Tissue Section Fixation and Staining: A Procedure to Process Frozen Brain Tissue Sections for Laser Microdissection

Source: Comba, A. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60939/laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular">Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video presents the fixation and staining method to process frozen mouse brain tumor tissue. The processed tissue helps differentiate and obtain a specific population of cells during subsequent laser capture microdissection.

Fixierung und Färbung von kryokonservierten Gewebeschnitten: Ein Verfahren zur Verarbeitung von gefrorenen Hirngewebeschnitten für die Lasermikrodissektion

Source: Comba, A. et al. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, ...