Quinnipiac Üniversitesi&#39;ndeki Keller ve Magie Labs&#39;ın tüm üyelerine yararlı öneriler için teşekkür ederiz. Özellikle, Keller Laboratuarı&#39;nda bu hasar analizinin geliştirilmesi için Barron L. Lincoln II&#39;ye teşekkür etmek isteriz. LC Keller&#39;e ödül verilen Quinnipiac Üniversitesi Sanat ve Bilim Hukuku Yüksek Okuluna teşekkür ederiz.

1. Reaktiflerin ve Ekipmanların Hazırlanması <ol><li> 1x tahlil tamponuna hazırlama (70 mM NaCI, 5 mM KCI, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCOj 3, 115 mM sakaroz, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES, pH 7.2). </li><li> 1x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) hazırlayın. </li><li> % 0.01 Triton X-100 ile 1x PBS kullanarak 1x PBT hazırlayın. </li><li> Meyve suyu agar plakaları hazırlayın. 14 Kısaca, H2O ve otoklav, 700 ml 30 g agar karıştırılır. 0.5 g metil parabeni 10 mL etanol içinde eritin ve 300 mL meyve suyu konsantresine (üzüm veya elma) solüsyon ekleyin. Konsantre otoklavlanmış agar solüsyonuna karıştırın ve 10 mm x 35 mm Petri kaplarının kapaklarına dökün. NOT: Üzüm agar gücü premix de çeşitli firmalardan satın alınabilir (bkz . Malzemelerin Tabloları ). </li><li> Larvaları mekanik olarak yaralamasına izin verecek boyutta 5 forseps edin. </li><li> Standart Drosophila CO 2 kullanın </sUb&gt; temelli anestezi aleti. </li></ol> 2. Drosophila larvalarının seçilmesi <ol><li> 25 ° C&#39;de kültüre edilmiş dolaşan üçüncü instar larvaları içeren bir şişe veya şurup Drosophila al. </li><li> Görünüşe göre on bireysel 2. ya da 3. instar larva seçin. Üçüncü instar larva, ön dallı spirallerin görünümü ile tanımlanabilirken, ikinci instar larva daha küçüktür ve daha çok club benzeri anterior spiracles içerir. NOT: Larva aşamaları aynı zamanda zamanlama ile de tanımlanabilir. 25 ° C&#39;de ikinci instar larva kuluçkadan yaklaşık 48 saat sonra, üçüncü instar larva molt yaklaşık 24 saat sonra ortaya çıkar. NMJ&#39;de nörodejenerasyon incelemekle ilgileniyorsanız, ikinci instar larvalarının yaralanması gerekir. </li></ol> 3. Drosophila Larvalarının Mekanik Yaralanmalara Hazırlanması <ol><li> Dikkat çekerek, formaps veya bir fırça ile bireysel larvaları dikkatli bir şekilde seçinHer neyse onu sıkıştırmamak. </li><li> Herhangi bir yiyecek artıkını temizlemek ve larva hareketliliğini yavaşlatmak için on adet larvayı soğuk 1X PBS içeren bir cam tabakaya veya diseksiyon tamponuna doğrudan yerleştirin. </li></ol> 4. Drosophila larvalarının mekanik yaralanması ve tedavisi <ol><li> Her bir larva&#39;yı CO 2 anestezi cihazına yerleştirin. </li><li> Diseksiyon mikroskopu altında, cilt kütlesi boyunca segmental sinirleri görselleştirmek için dikkatle her larvayı dorsal yanlarına döndürün. </li><li> Konum büyüklüğü 5, ağız kancalarından başlayarak larva uzunluğunun yaklaşık 1/2 ila 2 / 3&#39;ünü forseps eder. Yerleştirdikten sonra, boyut 5 forseps ile segmental sinirleri içeren ventral kütaniğin yaklaşık 1 / 3&#39;ünü tutun. <ol><li> Larval segmental sinirlerin yaralandığından emin olmak için, segmental sinirleri ezmek için kütikülü sağlam halde bırakacak kadar kuvvet uygulayın. Doğru miktarda kuvvet belirlemek için, 10 larvayı ezin ve5 saat sonra ölüm oranı% 50&#39;nin altındadır. </li></ol></li><li> Hasar gördükten sonra, larvaları yaklaşık 0.5 g maya macunu içeren bir meyve suyu agar plakasına dikkatle aktarın. Her larvayı ön ucunun maya macununa gelecek şekilde yerleştirin, böylece hareketlilik bozulmasına rağmen beslenmeye devam edilir. NOT: larval segmental sinirlerin yaralandığından emin olmak için agar plakasına aktarıldıktan sonra bozulmuş larval motilite gözlemlenebilir. Yaralı larvalar, yaralanma yerine posteriferale felç ederler, ancak yine de ağız kancalarını hareket ettirebilir ve besleyebilirler. Yaralanmadan sonra hayvanların ölüm oranının yüksek olması yaygın olduğundan bir deney için gerekli olanlardan% 20-50 daha fazla hayata zarar vermek en iyisidir. </li><li> Boş bir 100 x 15 mm petri tabağın altına maya yapıştırın ve 10 yaralı larva içeren agar plakaları yerleştirin. Yaralı larvaları içeren bu petri plakasını nemli bir kağıt havlu içeren bir agar plakası üzerine örtün ve kağıt havluun larvalara veya agar plakalarına dokunmamasına dikkat edin. Yerleştir şunu.Petri, oda sıcaklığında daha büyük, hava geçirmez bir kaba koyun. </li><li> Zarar sonrası belirlenen periyotlardan sonra (6, 12 veya 24 saat sonra) diseksiyon için larva alın. NOT: Hasarın aksonal hücre iskeletine olan ani etkilerini incelemek için, larvalar yaralanmadan sonra doğrudan disseke edilebilir. Aksonal transport kusurlarını incelemek için yaralanmadan yaklaşık 6 saat sonra larvalar disseke edilebilir. Yaralanmadan yaklaşık 12 saat sonra, ubikitleşmiş proteinlerin birikmesi gözlemlenebilir ve hasardan 24 saat sonra, NMJ&#39;de motor nöron dejenerasyonu gözlemlenebilir. </li></ol> 5. NMJ&#39;de Nörodejenerasyon Analizi <ol><li> Drosophila larva NMJ&#39;yi daha önce tarif edildiği gibi parçalara ayırın. 15 , 16 Kısaca, pinleri bir Sylgard plakasına yerleştirin, sırt yüzeyi boyunca kesin ve vücut duvarı kas sistemini açığa çıkarmak için bir damla diseksiyon tamponunda pimleri bulunan fileto. Ya da% 4 paraformaldehit (PFA) ya da Bouin&#39;s Solveni antiNöronları ve kasları görselleştirmek için kullanılan cesetler. NOT: Yeşil Floresan Protein (GFP) gibi flüoresan protein etiketleri Bouin&#39;in fiksatif maddesi çok sert olabileceği için görülebilecekse, PFA fiksasyonu kullanılmalıdır. </li><li> Önceden presinaptik motor nöronları ve komşu postsinaptik (SSR) kas kıvrımlarını eşzamanlı olarak işaretlemek için daha önce 11 , 13 , 16 tanımlanmış olan immünofloresansı uygulayın. Presynaptik zarları ve aksonları floresan ile konjuge horseradish peroksidaz (HRP) (1: 300) 17 ile görselleştirin ve aktif bölgeler bir anti Bruchpilot (Brp) antikoru (nc82; 1: 100 Gelişimsel Çalışmalar Hibritoma Bankası) kullanılarak boyanabilir. Sinaptik sonrası kasları anti-Dics Large (Dlg) antikoru (1: 10,000) ile aynı anda etiketleyin. 18 </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi NMJ&#39;de nörodejenerasyonun nicelleştirilmesi için kurulmuş bir test yapın. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Kısaca, hem ön hem de son sinaptik bölmeler için bireysel NMJ&#39;leri aynı anda görselleştirin. Postinaptik belirteçlerle etiketlenmiş ancak presinaptik belirteçlerle etiketlenmemiş herhangi bir buton, nörodejenerasyon alanlarını gösterir ( Şekil 1 ). NMJ başına ortalama bouton sayısı ve hayvan başına ortalama NMJ sayısı nicelenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Daha önce tarif edilen ve burada gösterilen nöronal mekanik yaralanma, Drosophila larvalarının segmental sinirlerinde hasar / stres yaratmak için kullanılabilir. 4 , 5 , 6 , 14 Bu deneysel teknik, yaralanmadan sonra motor nöron hücre cisimciklerinde transkripsiyonel değişikliklerin incelenmesinin yanı sıra nörodejenerasyona yol açan olayların zamansal dizilimini incele...

Nöronal dejenerasyon normal gelişim sırasında oluşur ve doğal yaşlanma süreci, yaralanma, stres veya hastalık durumlarından kaynaklanabilir. Ortak meyve sineği olan Drosophila melanogaster , nöronların dejenerasyonunu yönlendiren moleküler mekanizmalardaki olağanüstü benzerliklerden dolayı nörodejenerasyonu incelemek için basit ve güçlü bir model organizması sağlar. Bu benzerlikler, hastalıkla ilişkili insan genlerinin yaklaşık% 70&#39;inde bir Drosophila homologunun varlığı ile vurgulanır. 1 Ek olarak, sayısız deneyleri ve insan nörodejeneratif hastalıklar çalışma teknolojik araçlar geliştirilmiştir ve Drosophilia&#39;daki kullanılmıştır. 2, Drosophila içinde 3, nöro-musküler eklem (NMJ) hem hücresel hem de elektrofizyolojik özelliklerin analizi için izin veriyor ve görünür n nöromüsküler hastalığı araştırmak için önemli bir sistem olduğu kanıtlanmıştırEuron-kas bağlantıları. 2 Bu çalışmada, segmental sinirlerin tekrarlanabilir yaralanmasına izin veren Drosophila larvalarında bir in vivo nöron hasar analizini açıkladık. Bu motonöron yaralanması, yaralanmadan 24 saat sonra NMJ&#39;de nörodejenerasyona neden olan hücresel olayların zamansal bir dizilimiyle sonuçlanır. Nörodejenerasyonla sonuçlanan tekrarlanabilir yaralanma motoneuronları yeteneği, dejeneratif işlem için gerekli spesifik genlerin belirlenmesi, nöronal hasara transkripsiyonel cevapların diseksiyonu ve koruyucu sinyalleme çağlayanlarının analizi gibi farklı uygulamalar içerir. 4 , 5 , 6 Bu yöntem aynı zamanda canlı hayvanlarda nöronal dejenerasyon ve yenilenmeyi incelemek için mikroakışkanlarla birlikte kullanılmıştır. 7 Motor nöron dejeneratını incelemek için kurulan niceliksel bir tahlilden yararlanıyoruzIyonu mekanik yaralanma sonrası Drosophila NMJ&#39;de. Bu tahlil, presinaptik zar ve proteinlerin kaybedilmesinin, postsınaptik kas membranı kıvrımlarıyla karakterize edilen subsynaptik retikulumun (SSR) sökülmesinden önce gelmesi üzerine kuruludur. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Bu tahlil, pre-sinaptik nöronun bitişik postsinaptik kas ile olan bağlantısını kaybettiği &quot;sinaptik ayak izlerinin&quot; ölçülmesine izin verir. Dejeneratif sürecin larva gelişimi boyunca ilerici olduğu gösterilmiştir 12 ve değişen sinaps gelişimi veya filizlenmesiyle açıklanamaz. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ReklamMevcut mutasyonlar üzerine mekanik yaralanma kullanmanın avantajı, NMJ&#39;de nörodejenerasyona yol açan hücresel olayların geçici diziliminin parçalanmasına izin vermesidir. 13

<table><tbody><tr><td>Micro-dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>Various tank sizes can be purchased</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Anesthetizing Apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Stainless-steel pins, size 0.1</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>To pour dissecting plates</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>Dissecting Stereo MIcroscope</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anti- nc82 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>One can you Alexa Fluor&amp;reg; 488, 594 or 647</td></tr><tr><td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Used to create humid chamber for larval recovery</td></tr></tbody></table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

Nöronların dejenerasyonu normal gelişim sırasında, yaralanma, stres ve hastalığa yanıt olarak ortaya çıkar. Nöronal dejenerasyonun hücresel özellikleri, insanlarda ve omurgasızlarda bu işlemleri yönlendiren moleküler mekanizmalarda olduğu gibi oldukça benzerdir. Meyve sinek, Drosophila melanogaster , nörodejeneratif hastalıkların hücresel karmaşıklıklarını incelemek için güçlü ama basit bir genetik model organizması sağlar. Nitekim, hastalıkla ilişkili insan genlerinin yaklaşık% 70&#39;inde bir Drosophila homologu vardır ve çok sayıda alet ve tahliller, insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için sinekler kullanılarak tarif edilmiştir. Daha spesifik olarak, Drosophila&#39;daki nöromüsküler kavşak (NMJ), nöron ile kas arasındaki yapısal bağlantıları analiz etme kabiliyeti nedeniyle nöromüsküler hastalıkları incelemek için etkili bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Burada, Drosophila&#39;daki bir in vivo motor nöron hasarı tayini üzerinde rapor veriyoruz;NMJ&#39;de 24 saat nörodejenerasyonu uyarılabilir şekilde uyarır. Bu metodolojiyi kullanarak, motor nöron dejenerasyonuna neden olan hücresel olayların geçici bir dizisini açıkladık. Hasar yöntemi, çeşitli uygulamalar içerir ve ayrıca nörodejenerasyon için gerekli spesifik genleri tanımlamak ve nöronal hasara transkripsiyonel cevapları incelemek için kullanılmıştır.

Burada sunulan prosedürü kullanarak, mekanik nöronal hasarın nörodejeneratif olayların zamana bağlı olarak parçalanmasına izin verdiğini gösterdik. 14 , 18 Olaylar dizisi önceden karakterize edildi ve hasar sonrası 24 saat boyunca, aksonal trafik kusurları, ubikitinasyonlu proteinlerin birikimi ve bunu izleyen nörodejenerasyon, ardından hücre iskeletinin derhal bozulmasıyla başladı. Yaralanmadan önce, WT NMJ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Burada, Drosophila larva&#39;daki segmental sinirlere zarar vermek için basit ve yaygın olarak erişilebilen bir yöntem tarif ediyor ve üçüncü instar larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) motor nöronların nörodejenerasyonunu görselleştirip sayısallaştırıyor.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

5.5K Görüntüleme.  Quinnipiac University.  Burada, Drosophila larva'daki segmental sinirlere zarar vermek için basit ve yaygın olarak erişilebilen bir yöntem tarif ediyor ve üçüncü instar larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) motor nöronların nörodejenerasyonunu görselleştirip sayısallaştırıyor. 

Video: A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Biyomühendislik

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Nörobilim

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Gelişim Biyolojisi

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Tıp

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Drosophila melanogaster'de Akson Ölümü Sırasında Aksonların ve Sinapslarının Morfolojik ve Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

Nörodejenerasyon ile Birlikte Erişkin Drosophila'da Sinaptik Dejenerasyonun Görselleştirilmesi

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

Drosophila'da Dorsal Longitudinal Kas Nöromüsküler Kavşaklarının Yapısal Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neuromuscular Disorders

Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observe Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila Larvae

Source: Li, D., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/57557/" target="_blank">A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video describes two-photon laser ablation of axons in a Drosophila melanogaster larva and an example protocol to induce injury and image the injury site.

İki Foton Lazer Kaynaklı Nöral Yaralanma: Drosophila Larvalarında Akson Dejenerasyonu ve Rejenerasyonunu Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Source: Li, D., et al. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. 
...

Biyoloji

Drosophila melanogaster (meyve sineği)

Larva

Mechanically Injuring Drosophila Larvae Segmental Nerves to Induce Neurodegeneration

Source: Danella, E. B., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56128">A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration.</a> J. Vis. Exp. (2017).
The video demonstrates inducing neurodegeneration in Drosophila larva segmental nerves via mechanical injury. The ventral cuticle of anesthetized larvae is pinched using forceps to cause injury to the segmental nerves. The injured larvae are maintained with food, allowing the injury to cause degeneration of the motor neurons in the nerves, causing disruption of their neuromuscular junctions (NMJs).

Nörodejenerasyonu İndüklemek için Drosophila larvalarının segmental sinirlerini mekanik olarak yaralamak

1. Preparation of Reagents and Equipment 

	Prepare 1x Dissection Buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sucrose, ...

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma