Name: a modified yeast-one hybrid system for heteromeric protein complex-dna interaction studies
Uploaded: 2017-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies at JoVE.com

Yazının eleştirel okunması için SS Wang, M. Amar ve A. Galla&#39;ya teşekkür ediyoruz. Bu yayında bildirilen araştırmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından RO1GM067837 ve RO1GM056006 (SAK&#39;a) ödül numaraları ile desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri&#39;nin resmi görüşlerini temsil etmez.

<html> 1. Yapılandırma ve Reporter Plazmid Hazırlama <ol><li> PCR, E. coli (TOP10) kullanılarak giriş vektörüne klonlama için analiz edilecek hedef DNA&#39;nın &quot;fragmanları&quot; (tercihen ~ 250-500 bp) promoter bölgelerini çoğaltır. </li><li> Sekans teyitinin ardından, 8 , 9 , 10 , 11&#39;de tarif edildiği gibi pozitif klonun uyumlu bir pGLacZi ekspresyon vektörü 7&#39;de alt klonlanması. </li><li> Daha önce 12 , 13&#39;te tarif edildiği gibi maya muhabiri suşu oluşturmak üzere pGLacZi&#39;nin homolog rekombinasyonu ile maya suşunu promoter entegrasyonu (YM4271) için transforme edin. DNA bölgesinin bulunduğu maya suşunun transformasyon ve teyit basamakları, medyanın tarifi ile birlikte burada açıklanmamıştır çünkü basamaklar klasik Y1H protokolüne benzerAss = &quot;xref&quot;&gt; 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Daha önce 8 açıklandığı gibi β-galaktosidaz aktivitesi quantifiying ise PExP-AD502 kontrol plazmidi Normalizasyon için kullanılabilir. </li><li> İlgilenilen TF&#39;yi veya proteini klonlayın ve daha sonra etkileşen protein partneri pDEST22 ve pDEST32ΔDBD&#39;ye (pDEST32 eksi DNA Bağlama Etki Alanı) ekspresyon vektörlerine klonlayın. Dönüştürülmüş maya destekçi fragmanları ve TF klonları daha sonra protokolde daha fazla kullanılır. </li></ol> 2. Değiştirilmiş Y1.5H Protokolü <ol><li> 1. günde (öğleden sonra), bir Petri kabı veya gliserol stokundan SD-Ura&#39;da 5 mL kültür ile başlayın ve gece boyunca 30 ° C&#39;lik bir çalkalayıcıda inkübe edin. NOT: Bu kültür, yeni çizilmiş bir plakadan veya doğrudan mayanın% 25 veya% 30 gliserol stoğundan başlatılabilirDNA parçası ile klonlayın. </li><li> 2. günde (öğleden sonra), 10 mL YPDA medyumunu gece kültüründen 500 uL&#39;ye aşılayın ve gece boyunca 30 ° C&#39;lik bir çalkalayıcıda inkübe edin. </li><li> 3. Gün (sabahın erken saatlerinde ve öğleden sonra): Yetkili hücreleri hazırlayın (sabahın erken saatlerinde). <ol><li> 100 mL YPDA medyumunu gece kültürü 2 mL&#39;si ile inoküle edin ve 30 ° C&#39;lik çalkalayıcıda inkübe edin. OD 600 0.4-0.8&#39;e (3-5 saat) ulaşıncaya kadar bu taze kültürü büyütün. Not: gece boyunca kültüre göre OD 600 kontrol ve bu aşama için bir başlangıç noktası OD600 0.1 olduğundan emin olmak - 0.2. Aşırı veya yetersiz kültür kullanımı, deneyin uzamasına neden olabilir. </li><li> 1000 xg ve 21 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın. </li><li> Peletleri 10 mL steril suda bir vorteks veya pipetleme kullanarak yukarı ve aşağı rekonstitüe edin. </li><li> 1000 xg ve 21 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın. </li><li> Reconstitu(Tris-Etilendiamintetraasetik asit (TE) / Lityum asetat (LiAc) 2 mL içinde bir vorteks veya pipetleme kullanarak yukarı ve aşağı peletleyin. NOT: Lütfen TE / LiAc için Tablo 1&#39;deki reçete bakın. </li><li> 5 dakika boyunca 1000 xg ve 21 ° C&#39;de santrifüjleyin. Süpernatanı atın. </li><li> Pelet 4 mL TE / LiAc + 400 μL somon sperm DNA&#39;sında (10 mg / mL) pipetle yukarı ve aşağı tekrar asılarak bir sonraki adıma geçin. </li></ol></li><li> Eş dönüşüm: Hücrelere ısı şoku (öğleden sonra geç saatlerde) <ol><li> 96 oyuklu bir karıştırma plakasına (U-dip) oyuk başına 20 uL hücre dağıtın. </li><li> PDEST22: TF plazmiti, pDEST32ΔDBD: TF plasmidinin her birine 150 ng (~ 1.5 uL) ve oyuklara pEXP-AD502 artı pDEST32ΔDBD: TF (normalizasyon kontrolü) ekleyin. NOT: Başarılı bir ko-dönüşüm için ~ 150 ng&#39;lik pDEST22: TF ve pDEST32ΔDBD: TF plazmiti ile optimum sonuçlar beklenir. Böylece yapı ve plasmid ifadelerine göre değişebilir.Her deneyle optimize edilmelidir. Başka bir kontrol pDEST22-TF artı pDEST32deltaDBD de kullanıcının takdirine dahil edilebilir. </li><li> Kuyu başına 100 uL TE / LiAc / polietilen glikol (PEG) ilave edin ( üç kez karıştırın ). NOT: Lütfen Tablo 1&#39;deki TE / LiAc / PEG reçetesine bakın. </li><li> Plakayı nefes alabilen bir conta ile örtün ve 30 ° C&#39;de 20-30 dakika inkübe edin (daha uzun sürebilir) (karıştırma gerekmez). </li><li> Isı şoku 20 dakika süreyle ( tam olarak ) 42 ° C&#39;de. </li></ol></li><li> Hücreleri plakalayın. <ol><li> 1000 xg ve 21 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanı alın. 110 uL TE ekleyin ve karıştırın. </li><li> 1000 xg ve 21 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanın 100 uL&#39;ini çıkarın. Pelteyi delici ile tekrar süspanse edin. </li><li> SD-Trp-Leu agar plakalarına hücreleri aktarın. Levhaları kuluçkalayın30 ° C&#39;de bir sonraki aşamaya kadar. </li></ol></li><li> 5. Gün (öğleden sonra): Puncher / mikroplak çoğaltılayıcı kullanarak hücreleri yeni plakalara aktarın. <ol><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak 50 uL TE ile steril 96-iyi bir karıştırma plakasını (U-alt) doldurun. TE&#39;deki zımbayı önceden ıslatın. NOT: Delgeç veya mikroplak çoğaltıcısı bu adımdan önce ve daha sonra protokolde sterilize edilmelidir. Deliciyi sterilize etmek (% 100, moleküler biyoloji sınıfına değil) etanol içine daldırmak ve ardından alevle yakmak gibi ortak yöntem uygulanabilir. Delici iğnelerini soğutmak için 1 dakika bekleyin. Dikkat: Tezgah üstünde sterilizasyon yapılıyorsa; Tezgahın etanol ile önceden temizlendiğinden ve yanıcı herhangi bir malzemeden arındırılmış olduğundan emin olun. Uygun kişisel koruyucu ekipmanı (PPE) giyin. </li><li> Kolonileri yumruklayın ve TE dolu tabağa tekrar süspanse edin. NOT: Tabla üzerinde pürüzsüz bir büyüme varsa, kolonilere doğrudan delinebilirTE dolgulu plakaya veya alternatif olarak, tek koloni (birden fazla koloni olması durumunda), TE doldurulmuş plakaya sterilize edilmiş bir kürdan kullanarak seçilmeli ve daha sonra, bir sonraki aşamada delgeç kullanılmalıdır. </li><li> Optimum yüzey alanı için onları yeni SD-Trp-Leu agar plakalarına aktarın. Bir sonraki aşamaya kadar plakaları 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> 7. Gün (öğleden sonra): β-galaktosidaz aktivitesini ölçmek için kültür başlatın. <ol><li> Çok kanallı bir pipet kullanarak 50 μL SD-Trp-Leu ortamı ile steril 96-iyi bir karıştırma plakasını (U-altı) doldurun. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanarak 180 uL SD-Trp-Leu ortamı ile steril 96-derin kuyu bloğu doldurun. </li><li> Deliciyi medyada önceden ıslatın ve plakalardan 50 mcL medyaya koloniler aktarın. </li><li> 20 μL mayayı, 180 μL SD-Trp-Leu ortamına aktarın ve bloğu nefes alabilen bir conta ile kapatın. tasarlamak30 ° C&#39;de çalkalayıcıda 36 saat boyunca. </li></ol></li><li> 9. Gün (sabah): Enzimatik ölçüm için kültürü başlatın. <ol><li> 100 uL kültürü, sterilize edilmiş 96 derin kuyu bloğunda 500 uL YPDA medyasına aktarın. </li><li> Sterilize edilmiş derin kuyu plakasını nefes alabilen bir conta ile örtün ve 200 rpm&#39;de çalkalayarak 30 ° C&#39;de 3 ila 5 saat inkübe edin (OD 600 0.3-0.6&#39;ya kadar). </li><li> Kültürü yeniden askıya alın ve bir spektrofotometre plakasında çok kanallı bir pipet kullanarak 125 μL aktarın (OD 600 ölçün). NOT: Dikkat: Kabarcıkları önlemek için son damlasını boşaltmayın, eğer OD 600 0,3-0,6&#39;nın altındaysa kalan hücreleri okumaya bağlı olarak 1-2 saat daha inkübe edin. Bu aşamada kullanılan 125 uL kültürü atılabilir veya kullanıcının takdirine bağlı olarak orijinal derin kuyu bloğuna geri aktarılabilir. </li><li> Kalan hücreleri, 3000 xg ve 21 ° C&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı kaldırT ters çevirerek. </li><li> 200 μL Z-tamponu ekleyin ve girdap ekleyin. NOT: Lütfen Tablo 1&#39;deki Z-tamponunun reçetesine bakın. </li><li> 3000 xg ve 21 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın. </li><li> 20 uL Z-tamponu ekleyin ve vorteks ekleyin. </li><li> Donma çözülme döngülerine karşı koyabilen sızdırmazlık folyosu ile plakayı kapatın. Duman kabininde sıvı azot kullanarak 4 kez dondurma / çözülme yapın ve daha sonra su banyosunda 42 ºC (her biri 2 dakika) kullanın. </li><li> 200 μL Z-tampon / beta-merkaptoetanol (β-ME) / Ortho-nitrofenil-β-galaktoz (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8.4 mg sırasıyla 20 mL solüsyon verecek, her zaman taze hazırlayınız ) ilave edin. NOT: ONPG düzgün bir şekilde çözülmesi biraz zaman alır, bu adımı atmadan bir saat önce çözümü hazırlayın. ONPG β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümü için substrat görevi görür. </li><li> 30 ° C&#39;de 17 - 24 saat inkübe edin (eğer renk daha erken gelişiyorsa araya bakın.Bir sonraki adıma geçmek). </li></ol></li><li> 10. Gün (sabah): Tepkiyi durdurun ve ölçün. <ol><li> Reaksiyonu durdurmak ve zamanı kaydetmek için 110 uL 1M Na 2 CO 3 ilave edin. </li><li> 3000 xg ve 21 ° C&#39;de 10 dakika vorteksleyin ve santrifüjleyin. </li><li> Birden çok kanal kullanarak 125 ul süpernatant alın ve OD 420 ölçün. NOT: Dikkat, kabarcıkları önlemek için son damlasını dağıtmayın. </li><li> Β-gal etkinliğini hesaplayın: bir elektronik tabloda 1000 x OD 420 / (zaman (dak) x hacim (mL) x OD 600 ). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+formulations+for+various+two-hybrid+systems.">Media formulations for various two-hybrid systems.</a> Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays:+A+historical+and+technical+perspective.">Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective.</a> Methods. 57 (4), 441-447 (2012).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Gavin, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li><li>Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+B-BOX32+interacts+with+CONSTANS-LIKE3+to+regulate+flowering.">Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).</li><li>Helfer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LUX+ARRHYTHMO+encodes+a+nighttime+repressor+of+circadian+gene+expression+in+the+Arabidopsis+core+clock.">LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock.</a> Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Wanke, D., Harter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plant+Regulatory+DNA+sequences+by+the+Yeast-One-Hybrid+Assay.">Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay.</a> Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).</li><li>Klein, P., Dietz, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-Binding+Proteins+and+Protein-Protein+Interactions+by+Yeast+One-Hybrid+and+Yeast+Two-Hybrid+Screen.">Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen.</a> Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).</li><li>Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+Transcriptional+Regulators+by+Yeast+One-Hybrid+Screens+Using+a+Transcription+Factor+ORFeome.">Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome.</a> Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).</li><li>Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-Compatible+Yeast+One-Hybrid+Screens.">Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens.</a> CSH Protoc. 2006 (5), (2006).</li><li>Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway-compatible+yeast+one-hybrid+system.">A gateway-compatible yeast one-hybrid system.</a> Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).</li></ol>

Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Mevcut Y1H standart prosedürü, DNA yemine bağlanan tek bir protein yırtıcıyı tanımlamak için uygundur. Çeşitli teknik değişikliklerle, mevcut sistem transkripsiyonel düzenleyici ağları tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, TF&#39;lerin, iki veya daha fazla TF veya protein içeren komplekslerin bir parçası olarak işlev gördüğü ve bunların sadece bir kısmının DNA&#39;ya bağlanabildiği bilinmektedir. Sadece protein bağlama alanlarına sahip olan ve DNA&#39;ya bağlanma yetene...

<html> Genel olarak, protein-DNA etkileşimlerini anlamak için Y1H tahlili, laboratuar ortamında başarıyla kullanılan tercih edilen sistemdir 1 . Temel Y1H tahlili iki bileşen içerir: a) bir raportör proteini şifreleyen bir genin üst akışına başarıyla klonlanmış ilgi DNA&#39;sı olan bir raportör yapı; Ve b) ilgili TF ile bir maya transkripsiyon aktivasyon alanı (AD) arasında bir füzyon proteini üretecek bir ifade konstrüksiyonu. Fusion protein &quot;av&quot; olarak bilinirken ilgi DNA, yaygın olarak &#39;yem&#39; olarak anılır. Geçmiş yıllarda, Y1H tahlilinin birden fazla versiyonu, kendi avantajları ile spesifik ihtiyaçlara göre geliştirilmiştir 2 . Mevcut Y1H tahlili, DNA yemiyle bir defada bir proteinin etkileşimini tanımlamak ve doğrulamak için başarılı bir şekilde uygulanabilir ancak heterodimerik veya multimerik protein-DNA etkileşimlerini tanımlama yeteneğinden yoksundur. &quot;&gt; Burada açıklanan yöntem, mevcut Y1H&#39;nin değiştirilmiş bir versiyonudur ve araştırmacıların hedef DNA dizilimine / proteinlerine aynı anda birden çok protein bağlamalarını sağlar Bu tahlilin amacı, bir etkinleştirme domeniyle ilgilenilen proteini (pDEST22: TF) ve maya sisteminde etkileşen protein partnerinin (pDEST32ΔDBD-TF) varlığında ve / veya yokluğunda bir haberci ile birleştirilen aday DNA bölgelerinin aktivasyonunu değerlendirin.Bu tahlilde bu iki Proteinlerin, hedefin aktivasyonu için gereklidir.Bu, bir GATEWAY klonlama uyumlu sistemidir ve bu nedenle, düzenli bir laboratuar ortamında kullanılmak üzere uygundur.Bu protokol, bir maya sistemindeki farklı TF&#39;lerin birlikte dönüştürülmesini kolaylaştıran doğrudan dönüşüme dayanır Dolayısıyla, in vitro moleküler ve fonksiyonel doğrulama için olası DNA hedeflerine bağlanan protein komplekslerini doğrulamak için avantajlı bir strateji fVeya herhangi bir sistem. Tandem afiniteli saflaştırma (TAP) yöntemleri gibi mevcut teknikler maliyetli ve emek gerektirir, ancak protein hetro-komplekslerinin büyük ölçekte saptanmasına izin verir 3 , 4 , 5 . Bu modifiye maya tek hibridi, küçük bir ölçekte ( Şekil 1 ) düzenli bir laboratuar ortamında başarıyla uygulanabilir ve aynı zamanda maliyet açısından da etkili olur. Y1.5H tahlili, heterolog bir sistem kullanarak ortak bir DNA hedefine bağlanan multimerik protein kompleksinin rolünü tanımlamaya yönelik hipotezlerini test etmek ve doğrulamak için toplumdaki araştırmacıları kolaylaştırabilir. Bulgulara dayanarak, hipotez, tercih edilen çalışma sisteminde in vivo olarak doğrulanabilir. Son zamanlarda, Arabidopsis 6&#39;da çiçek açmayı düzenleyen bir TF&#39;nin rolünü ve bunun hareket biçimini tanımlamak için bu yaklaşımı kullandık.

<table><tbody><tr><td>pDEST22 vector</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit</td></tr><tr><td>pDEST32delatDBD</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000102</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain</td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>YM4271 Strain</td><td>Clontech</td><td>K1603-1</td><td>MATCHMAKER One-Hybrid System</td></tr><tr><td>pEXP-AD502</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two hybrid system kit</td></tr><tr><td>GATEWAY LR Clonase II enzyme mix</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>YPDA media</td><td>Clontech</td><td>630410</td><td></td></tr><tr><td>SD-Agar</td><td>Clontech</td><td>630412</td><td></td></tr><tr><td>SD minimal media</td><td>Clontech</td><td>630411</td><td></td></tr><tr><td>Uracil DO Supplement</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan Do Supplement</td><td>Clontech</td><td>630413</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>LiAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Saplmon Sperm (10mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>PEG3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1546547</td><td></td></tr><tr><td>96-deep well block</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sealable Foil</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td></td></tr><tr><td>Araseal</td><td>Excel Scientific</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>034461-100</td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73660</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223484</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83266</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA54-4</td><td></td></tr><tr><td>Drybath</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voretx</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifgue</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Molecular Device</td><td></td><td>SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Incubator</td><td>New Brunswick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Thermo Fisher</td><td>IsoTemp 205</td><td></td></tr><tr><td>Puncher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falocn</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flask</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriplates (150mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a modified yeast-one hybrid system for heteromeric protein complex-dna interaction studies

Yıllar boyunca, maya tek hibrid tahlili, transkripsiyon faktörleri (TF&#39;ler) ve DNA hedefleri gibi proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlamak ve doğrulamak için önemli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Burada sunulan yöntem Y1H&#39;nin altında yatan kavramı kullanır, ancak hedef DNA&#39;sına bağlanan protein komplekslerini incelemek ve doğrulamak için daha da modifiye edilir. Bu nedenle modifiye edilmiş maya tek hibrid (Y1.5H) tahlili olarak geçmektedir. Bu test maliyet açısından etkili olup, düzenli bir laboratuar ortamında kolayca uygulanabilir. Her ne kadar heterolog bir sistem kullansa da , tarif edilen yöntem, herhangi bir çalışma sisteminde, özellikle bitki genomiği için işlevsel genomik için DNA hedeflerine / hücrelerine bağlanan heteromerik protein kompleksini test etmek ve doğrulamak için değerli bir araç olabilir.

İlgilenen protein ile maya hücrelerindeki DNA bölgelerinin birlikte dönüştürülmesi için genel plaka hazırlama prosedürü ( Şekil 2 ). Plaka düzeneği, deneye ve test edilen DNA bölgeleri / fragmanlarının sayısına göre değiştirilebilir. Protokolün 5. gününden sonra, iyi yetiştirilmiş ve pozitif bir plaka Şekil 3&#39;deki gibi görünmelidir. Çalışmamızda, transkripsiyon başlangıç ​​alanının...

Watch this Scientific Journal Video about A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies at JoVE.com

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

a-modified-yeast-one-hybrid-system-for-heteromeric-protein-complex

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Görüntüleme.  University of Southern California.  Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır. 

Video: A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Biyokimya

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Genetik

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biyoloji

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

<meta charset="utf8"></head><body>Maya Yüzey Görüntüleme Teknikleri ile Protein Fonksiyonlarının Optimize Edilmesi

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Biyomühendislik

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar