Laboratuvarımda, protein mühendisliğini hücresel mühendislikle birleştirerek yeni nesil hücresel tedaviler tasarlıyoruz. Bu nedenle, yeni işlevler elde etmek veya mevcut olanları geliştirmek için protein bileşenleri tasarlıyoruz ve daha sonra bu boş proteinleri hücresel terapötiklere dahil ediyoruz. Protein stabilite mühendisliği, küçük moleküllü regüle protein anahtarlarının mühendisliği ve kanserle ilişkili aktive edilmiş reseptör onaylarının spesifik hedeflemesi dahil olmak üzere özel uygulamalar için kullanım yüzeyi ekranını daha da geliştirdik.
Maya yüzeyi ekranının faj veya ribozom gösterimi gibi diğer görüntüleme teknolojilerine kıyasla avantajı, sıralama işlemi sırasında kütüphanenin akış sitometrik görselleştirmesi ve antijen konsantrasyonu ve sıralama kapısının sıkılığı gibi seçim koşullarının hassas kontrolüdür. Başlamak için, 10 mikrolitre biyotin bağlayıcı manyetik boncukları 990 mikrolitre PBSA'da yeniden süspanse ederek boncukları ilk boncuk seçimi için hazırlayın. Yıkamak için, tüpü kapağı açık olarak iki dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.
Sonra süpernatanı dikkatlice çıkarın. Yıkanmış boncukları, 6.7 ila 33 pikomol biyotinile antijen ile bir mililitre PBSA'da 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde yeniden süspanse edin. İnkübasyondan sonra, tüpü kapak açıkken iki dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatanı çıkarın ve antijen yüklü boncukları bir mililitre PBSA ile yıkayın.
Boncuklar yerleştikten sonra PBSA'yı çıkarın. Daha sonra antijen yüklü boncukları 50 mikrolitre PBSA'da yeniden süspanse edin. Negatif seçimler için hücreleri, antijen boncuklarını ve bir ayı boncuk çözeltisini hazırlayın.
Yıkadıktan sonra, antijen boncuklarını 50 mikrolitre PBSA içinde yeniden süspanse edin ve ayı boncuklarını 150 mikrolitre PBSA içinde yeniden süspanse edin. İlk negatif seçim için, PBSA'daki 950 mikrolitre yıkanmış hücreye 50 mikrolitre yıkanmış çıplak boncuk ekleyin ve karışımı dört santigrat derecede 1,5 saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, ayı boncuk hücresi süspansiyonlarını içeren tüpleri, kapağı açık olacak şekilde manyetik bir rafa yerleştirin.
Kapaktaki herhangi bir sıvıyı tüpe pipetleyin ve iki dakika bekleyin. Daha sonra bağlanmamış hücreleri yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 50 mikrolitre yıkanmış ayı boncuğu ekleyin. Üç tur negatif seçimden sonra, hücrelere 50 mikrolitre antijen yüklü boncuk çözeltisi ekleyin.
Dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. Şimdi antijen yüklü boncukları içeren hücreleri, kapağı açık olan manyetik bir rafa yerleştirin. Kapakta bulunan herhangi bir sıvıyı tüpe pipetleyin.
İlişkisiz hücreleri atmadan önce iki dakika bekleyin. Kalan tüm adımları ilk antijen boncuk seçimi için açıklandığı gibi gerçekleştirin. Üç negatif ve bir pozitif seçimden sonra, hücreleri bir mililitre SDCAA'da hızla yeniden süspanse edin ve daha büyük hacimde SDCAA içeren bir çalkalayıcı şişeye aktarın.
Maya kütüphanelerinde SGCAA'daki proteinlerin yüzey ekspresyonunun gece boyunca indüksiyonundan sonra, çeşitliliğin 10 katını kaplayacak kadar hücreyi peletleyin ve süpernatanı atın. Peleti PBSA'da yeniden süspanse edin ve mikro santrifüj tüplerine aktarın. Her tüpte boyama için 30 milyon hücre kullanın.
Antijen içermeyen bir kontrol tüpü de dahil olmak üzere çeşitliliğe bağlı olarak gerektiği kadar tüp hazırlayın. Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2000 x g'da santrifüjleyin. Pelet, antijeni içeren 200 mikrolitre PBSA içinde yeniden süspanse edin ve dört santigrat derecede bir saat inkübe edin.
Santrifüjlemeyi bir kez daha gerçekleştirdikten sonra, PBSA'yı peletten çıkarın. Daha sonra, ekran boyama ve antijen tespiti için antikorlar içeren 100 mikrolitre soğuk PBSA'daki hücreleri yeniden süspanse edin. Dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2000 x g'da santrifüjleyin. Pelete bir mililitre PBSA ekleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Ardından, peletin kurumasını önlemek için yalnızca 20 ila 30 mikrolitre bırakarak süpernatantın çoğunu çıkarın.
Sıralamadan hemen önce peleti soğuk PBSA'da yeniden süspanse edin. Şimdi hücreleri doğrudan bir ortam olan SDCAA'ya sıralayın. Sıralamadan sonra, hücreleri daha büyük hacimde SDCAA ortamı içeren bir çalkalayıcı şişeye aktarın ve 180 RPM'de çalkalanarak 30 santigrat derecede inkübe edin.
