Bu çalışma Federal Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (FKZ 0312138A ve FKZ 316159), AB Yapısal Fonlarıyla Devlet Mecklenburg-Batı Pomerania (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 ve ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) ve Alman Kalp Vakfı (F / 01/12). Buna ek olarak, RD, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi (889001), DAMP Vakfı ve BMBF (VIP + 00240) FORUN Programı tarafından desteklenmektedir.

Yenidoğan farelerini içeren bu protokolün tüm basamakları, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi hayvan bakımına ilişkin etik kurallara göre gerçekleştirildi. 1. Hücre Kültürü Tabletlerinin Hazırlanması ve Kardiyomiyosit Kültürü için Orta <ol><li> PBS içinde% 0.1 jelatin ile bir hücre kültürü plaka kaplayın ve 37 ° C&#39;de 4 saat süreyle inkübe edin veya gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Jelatı çıkarın ve steril laminer hava akımı altında kurumasına izin verin. </li><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile takviye edilmiş 50 mL DMEM&#39;den oluşan hücre kültürü ortamı hazırlayın. 37 ° C&#39;ye kadar ısıtın. </li></ol> 2. Yenidoğan Kardiyomiyositlerinin İzolasyonu <ol><li> Yenidoğan farelerini (1-2 günlük) steril makaslarla kesilerek kurutun ve göğsü göğüs kafesi boyunca açın. Toraksı hafifçe bastırırken forseps kullanarak kalbi çıkarın ve kalbi, buz gibi HBSS içeren 24 yuvalı bir plakaya aktarın(Ca 2+ ve Mg 2+ olmadan). </li><li> Steril forseps kullanarak kalp dışı dokuları ve daha büyük damarları çıkarın. Temizlenmiş kalpler buz soğukluğunda HBSS içeren 1.5 mL tüp içine aktarılır. Enzimatik sindirim için tüp başına maksimum 5 kalp kullanın. </li><li> Küçük makaslarla kalpleri &lt;0,5 ila 1 mm³ parçaya kesin. </li><li> Öğütülmüş kalpler HBSS ile 1 mL mikrolitrelik pipet kullanılarak aspirasyon / ilave HBSS ile iki kez yıkanır. Enzimleri eklemeden önce HBSS&#39;yi tamamen çıkarın. </li><li> Yenidoğan kalplerindeki enzimatik sindirim için, piyasada bulunan bir kit kullanın ve üreticinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosuna bakın ). 35 ° C&#39;de 37 ° C&#39;de enzimlerle inkübe ederken kıyılmış kalpleri içeren tüpü her 5 dakikada sallayın. </li><li> Tohum, kardiyomiyosit fraksiyonunun yapışmasına izin vermek için 1.5-2 saat boyunca hücre kültürü ortamı içeren kaplanmamış hücre kültürü kaplarında hücreleri askıya aldı. Yüksek saflık varsa bu adımı tekrarlayınKardiyomiyositlerin tedavisi gereklidir. Arzu edildiği takdirde, kardiyomiyositsiz fraksiyonu daha da kültürleyin. NOT: 15 kalp içeren bir hücre süspansiyonu için, ön kaplama adımı 75 cm2&#39;lik hücre kültürü şişeleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Genellikle, bir yenidoğan kalpten yaklaşık 5 x 105 hücre elde edilir. </li><li> 15 mL konik tüp içinde süpernatantı toplayın ve 300 x g&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. 1 mL hücre kültürü ortamında hücreleri tekrar süspanse edin. </li><li> Bir Neubauer odacık hemositometresi ile hücreleri sayın veya eşdeğer bir yöntem kullanın. </li><li> Plaka, kardiyomiyositleri 6 yuvalı plakalarda 3 x 10 5 hücre / cm² yoğunlukta izole etti. Hücreleri gece boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de inkübe edin. NOT: İsteğe bağlı olarak hücreler de bu noktada transfekte edilebilir. Bununla birlikte, hücreler elektroporasyona tabi tutulmadan önce bir gün kültüre alındığında canlılığın arttığı gözlenmiştir. </li></ol> Floresanla Etiketli miRNA ile Transfeksiyon <ol><li> öncesiSıcak bir hücre kültür ortamı (adım 1.2&#39;ye bakın) ile 37 ° C&#39;ye kadar bir su banyosu veya eşdeğer bir cihazda inkübe edin. </li><li> RNaz içermeyen steril suda flüoresan miRNA&#39;nın 20 uM stok solüsyonu hazırlayın. </li><li> 90 mM Na2HPO4, 90 mM NaH2PO4, 5 mM KC1, 10 mM MgCl2 ve 10 mM sodyum süksinat içeren elektroporasyon tamponunu hazırlayın ve pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın; Elektroporasyon tamponu birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 5 dakika süreyle% 0.05 tripsin kullanarak kültür çanak hücrelerini çıkarın. Hücre kültürü ortamı ilave ederek tripsini inaktive edin. </li><li> Bir Neubauer odacık hemositometresi ile hücreleri sayın veya eşdeğer bir yöntem kullanın. Hücreleri 300 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> 100 uL başına 4 x 10 5 hücre konsantrasyonu elde etmek için elektroporasyon tampon hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bir tüpte flüoresan miRNA (son konsantrasyon: 0.25 uM) ile hücre süspansiyonunun 100 uL&#39;sini karıştırın veKarışımı bir elektroporasyon küvetine yükleyin. <ol><li> Ampirik olarak hücre türüne bağlı olarak uygun miktarda miRNA belirler. </li></ol></li><li> &quot;G-009&quot; programını kullanarak bir elektroporasyon cihazı (bkz . Malzeme Tablosu ) kullanılarak elektroporasyon gerçekleştirin . </li><li> Önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı 500 mcL ekleyin ve 4-iyi cam-alt oda slayt bir kuyuya tüm hücre süspansiyonu (4 x 10 5 hücre) aktarın. 37 ° C&#39;de 1 gün boyunca hücreleri% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin. NOT: FRAP analizi için ~% 80&#39;lik bir hücre yoğunluğu en uygunudur. Etiketli miRNA transfeksiyonu sadece elektroporasyon ile yapılmalıdır. Etiketli miRNA moleküllerinin homojen dağılımı FRAP ölçümü için yararlı olduğu için reaktif temelli transfeksiyon önerilmez. </li></ol> 4. 3D-FRAP Mikroskopi Uygulaması (3. Gün) <ol><li> Mikroskop inkübatörünü 37 ° C&#39;ye ısıtın; C ve FRAP ölçümünden önce en az 2 saat konfokal mikroskop sistemi üzerinde geçiş yaparak bir termal denge kurun ve kayma olasılığını azaltın. Mümkünse% 5 CO2 atmosferi uygulayın. </li><li> Oda slaydını sahne örneği tutucusuna yerleştirin. </li><li> Transfekte edilmiş kardiyomiyositlerin bir kümesini 1.4 NA yağ hedefi (400X büyütme) ve düşük lazerli güçte 561 nm lazer uyarma ışığı kullanarak, 570-680 nm&#39;lik bir algılama aralığıyla bulun. NOT: FRAP ayarlarının tanımı, görüntü elde etme ve analiz, mikroskop spesifik yazılımı kullanılarak yapılmıştır (bkz . Malzeme Tablosu ). </li><li> &quot;Kurulum Yöneticisi&quot; nde &quot;z-Stack&quot;, &quot;Zaman Serileri&quot;, &quot;Ağartma&quot; ve &quot;Bölgeler&quot; düğmelerini etkinleştirin. </li><li> FRAP parametrelerini tanımlayın. <ol><li> &quot;Acquisition Mode&quot; menüsündeki görüntü toplama ayarlarını, &quot;frame size&quot;4; 512 x 512, &quot;satır adım&quot; 1 ve &quot;tarama süresi&quot; &lt;1 sn. </li><li> &quot;Kanallar&quot; menüsünde, minimum lazer uyarımından maksimum flüoresan elde etmek için lazer gücü, ofset ve kazanç ayarlarını yapın ( örn., Lazer gücü:% 1-5); Yoğunluk doygunluğundan kaçınmak için ayarlayın. &quot;İğne deliği boyutu&quot; nu 2 μm olarak ayarlayın. </li><li> Ardından, &quot;Bölgeler&quot; menüsünde &quot;ROI çizim aracı&quot; nı seçin ve hedef hücrenin, referans hücrenin ve arka plan alanını işaretlemek için imleci kullanın. Gerekirse, photobleaching için birkaç hedef hücre seçin. </li><li> &quot;Ağartma&quot; menüsünde ( örneğin, yinelemeler: 9-14, ışıkla temizleme için lazer gücü:% 100, görüntü yakalama aralığı: 60 s, devir sayısı: 15) foto-ağartma ayarlarını yapın. 3 ilk taramadan sonra ağartmanın başlangıcını tanımlayın. </li><li> &quot;Z-Stack&quot; menüsünde, hücrelerin kalınlığına bağlı olarak z-stack alımının sınırlarını tanımlayın. &quot;Sayı o&quot; ayarlayınF z-katmanları &quot;yı 12 - 15&#39;e ayarlar. </li><li> FRAP denemesini başlatın ve flüorür iyileşmesini kaydedin. NOT: Bir FRAP deneyinin ayarları hücrenin türüne, flüoresan boyaya ve mikroskop sistemine bağlı olduğundan, FRAP için en uygun parametreleri belirlemek için pilot denemeler yapmak en iyisidir. Ağartma, ilk floresan yoğunluğunu en az% 50 azaltmak için yeterli olmalıdır. Tipik olarak, floresan iyileşmesi, plato fazına erişilinceye kadar 30-60 saniyede bir kaydedilmelidir. </li></ol></li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Elde edilen z-yığınlarının maksimum projeksiyonlarını oluşturun ve ağartılmış hedef hücrelerin, referans hücrenin ve arka planın flüoresan yoğunluk değerlerini elde edin. Mikroskopa özgü yazılımı kullanarak, &quot;İşleniyor&quot; → &quot;Maksimum yoğunluk projeksiyonu&quot; → dosya seçin → &quot;Uygula&quot; yı tıklayın. <ol><li> Alternatif olarak, eşdeğer bir görüntü analiz aracı ( <eM&gt; örneğin ImageJ). </li></ol></li><li> Hedef hücre, arka plan ve referans hücrenin tüm zaman noktalarında bulunan flüorens yoğunluk verilerini bir elektronik tabloya kopyalayın. <ol><li> Edinme işlemi sırasında oluşan photobleaching&#39;i düzeltmek için hedef hücrenin yoğunluk değerlerinden referans hücrenin arka plan yoğunluğunu ve yoğunluğunu çıkartın. Her zaman noktası için arka plan ve referans hücre düzeltmeleri yapın. </li><li> Düzeltilmiş FRAP verilerini, ilk flüoresan ile her bir değeri bölerek ağartmadan önce ilk flüoresans yoğunluğuna göre normalize edin. </li><li> FRAP eğrilerini elde etmek için, her bir zaman noktasının yoğunluk değerlerinden çıkararak çamaşır suyu bittikten hemen sonraki flüoresan yoğunluğuna taban çizgisini ayarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+state-of-the-art.">Small silencing RNAs: state-of-the-art.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).</li><li>Raghunathan, S., Patel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+small+interfering+RNA+in+cardiovascular+diseases.">Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases.</a> Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).</li><li>Sluijter, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+Cardiovascular+Regenerative+Medicine:+Directing+Tissue+Repair+and+Cellular+Differentiation.">MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation.</a> ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).</li><li>Li, M., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+MicroRNAs:+Potential+and+Emerging+Biomarkers+for+Diagnosis+of+Cardiovascular+and+Cerebrovascular+Diseases.">Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases.</a> Biomed Res Int. , 1-9 (2015).</li><li>Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+cardiovascular+disease:+an+introduction+for+clinicians.">MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians.</a> Heart. 101 (12), 921-928 (2015).</li><li>Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+and+pannexin+signaling+in+gastrointestinal+and+liver+disease.">Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease.</a> Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).</li><li>Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connexin+43+in+cardiovascular+diseases.">Role of connexin 43 in cardiovascular diseases.</a> Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).</li><li>Naus, C. C., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+and+challenges+of+connexin+connections+to+cancer.">Implications and challenges of connexin connections to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).</li><li>Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+modulate+glioma+invasion+by+direct+transfer+of+microRNA.">Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA.</a> Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).</li><li>Lee, H. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+deliver+synthetic+microRNA+mimics+to+glioma+cells+and+glioma+stem+cells+and+inhibit+their+cell+migration+and+self-renewal.">Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal.</a> Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).</li><li>Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+microRNA+is+transferred+between+glioma+cells.">Functional microRNA is transferred between glioma cells.</a> Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).</li><li>Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+mediated+miRNA+intercellular+transfer+and+gene+regulation:+A+novel+mechanism+for+intercellular+genetic+communication.">Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication.</a> Sci Rep. 6, 19884 (2016).</li><li>Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+connexin26+mutants+associated+with+human+hearing+loss+have+trans-dominant+effects+on+connexin30.">Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30.</a> Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).</li><li>Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+gap+junctions+in+monolayer+and+three-dimensional+cultures+of+human+tendon+cells+using+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching.</a> J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).</li><li>Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+requires+a+biphasic+modulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+caused+by+dynamic+changes+of+connexin43+expression.">Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).</li><li>Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+shuttling+of+miRNA+-+A+novel+pathway+of+intercellular+gene+regulation+and+its+prospects+in+clinical+application.">Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application.</a> Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).</li><li>Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+connexin43+in+the+EGF/EGFR+signalling+during+self-renewal+and+differentiation+of+neural+progenitor+cells.">Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells.</a> Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).</li><li>Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).</li><li>Laupheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Migration+of+Subpopulations+of+Bone+Marrow+Cells+along+an+SDF-1+&#945;+and+ATP+Gradient.">Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 &#945; and ATP Gradient.</a> Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).</li><li>Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+enhance+the+antiproliferative+effect+of+microRNA-124-3p+in+glioblastoma+cells.">Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells.</a> J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).</li><li>Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mobility+to+crosstalk.+A+model+of+intracellular+miRNAs+motion+may+explain+the+RNAs+interaction+mechanism+on+the+basis+of+target+subcellular+localization.">From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization.</a> Math Biosci. 280, 50-61 (2016).</li><li>Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+single+molecule+microscopy+reveals+two+kinetically+distinct+pathways+for+microRNA+assembly.">Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly.</a> EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).</li><li>Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photobleaching,+laser+illumination+unbinds+fluorescent+proteins.">Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins.</a> J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).</li><li>Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+generation+and+calcium+increase+induced+by+visible+light+in+astrocytes.">Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).</li><li>Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA:+Function,+detection,+and+bioanalysis.">MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis.</a> Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).</li><li>Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNA+expression+profiles+in+normal+human+tissues.">Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues.</a> BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat Commun. 2, 282 (2011).</li><li>Squadrito, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RNAs+Modulate+MicroRNA+Sorting+to+Exosomes+and+Transfer+to+Acceptor+Cells.">Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells.</a> Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).</li><li>Zhang, B., Farwell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs:+a+new+emerging+class+of+players+for+disease+diagnostics+and+gene+therapy.">microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).</li><li>Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+delivery+of+miRNAs+for+cancer+therapy:+Challenges+and+strategies.">In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

<html> MiRNAlar, hücresel fizyolojideki kilit aktörlerdir ve hücrelerarası değişim için bir yol olarak GJ&#39;leri 11 , 12 , 22 kullanarak - diğerlerinin yanında - kullanarak sinyal molekülleri olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Mevcut protokol , hücre kümelerinde flüoresan miRNA&#39;lar kullanarak bu GJ&#39;ye bağımlı mekikleşmeyi karakterize etmek için bir in vitro canlı hücre görü...

Küçük kodlamayan RNA&#39;lar hücresel gen düzenlemesinde önemli oyunculardır. Bu moleküller, belirli bir hedef mRNA&#39;ya bağlanan 20-25 nükleotidden oluşur, bu da translasyonun bloke edilmesine veya mRNA parçalanmasına yol açar 1 , 2 . MiRNA ve siRNA gibi küçük RNA&#39;lar tarafından üstlenilen gen düzenleyici süreç, birçok farklı türde 3 bulunmuş olan oldukça korunmuş bir mekanizmadır. Özellikle miRNA molekülleri çoğalma, farklılaşma ve rejenerasyon 4 , 5 dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçler için çok önemlidir. Buna ek olarak, miRNA ekspresyonunun düzensizliği, bir çok patolojik bozukluğa atfedilir. Buna uygun olarak, miRNA&#39;ların teşhis için biyolojik belirteç olarak ve gen terapisi için terapötik ajanlar olarak uygun olduğu gösterilmiştir 6,7 </sup&gt;. Boşluk kavşakları (GJs), iki bitişik hücrenin plazma zarında, 1 kD&#39;ye kadar bir molekül ağırlığına sahip moleküllerin difüzyonel değişimini sağlayan özel protein yapılarıdır. Dokuların gelişimi, farklılaşması, hücre ölümleri ve kanser veya kardiyovasküler hastalık 8 , 9 , 10 gibi patolojik bozukluklar için önemli oldukları gösterilmiştir. Birkaç molekül, iyonlar, metabolitler ve nükleotidler de dahil olmak üzere GJ kanallarını geçebilecek nitelikte olarak tarif edilmiştir. İlginç bir şekilde, GJ&#39;lerin küçük RNA&#39;ların hücre içi hareketi için bir yol sağladığı 11,12 bulundu. Dolayısıyla, miRNA&#39;lar yalnızca üretildikleri hücrede değil, aynı zamanda alıcı hücreler içinde de hareket edebilir. Bu, hücrelerarası sinyal iletim sisteminde miRNA&#39;ların rolünü vurgular. Aynı zamanda, veriler gösterilenBu boşluk bağlantılı hücresel-iletişim, miRNA fonksiyonuyla yakından ilişkilidir. MiRNA ve GJ&#39;lerin doku homeostazı, patoloji ve teşhis üzerindeki belirgin etkisi nedeniyle, GJ&#39;lerin ve miRNA&#39;nın ilgili hücre içi dinamikleri hakkında kapsamlı bir anlayış, miRNA&#39;ya dayalı hastalıkların mekanizmalarını aydınlatmaya ve yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır. MiRNA terapileri. Boşluk bağlantılı bağlanmanın derecesine bağlı olarak, miRNA moleküllerinin hücreler arasında aktarılması çok hızlı bir işlem olabilir. Bu nedenle, bu düzenleyici sinyal moleküllerinin hızlı hücresel hareketi görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesine izin veren bir yöntem gereklidir. Genellikle, akış sitometrisi ve moleküler biyolojik teknikler küçük RNA&#39;ların 11 , 12 , 13 , 14&#39;ün geçişini göstermek için uygulanmıştır. Bununla birlikte, FRAP mikrolarına karşıBu yaklaşımlar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip değildir, bu da GJs yoluyla miRNA değişimini analiz ederken zorunludur. Ayrıca, FRAP mikroskopisi daha az invazivtir ve bu nedenle birkaç hücre tipinde 15 , 16 , 17 moleküllerin GJ&#39;ye bağlı değişimini değerlendirmek için güçlü ve yeni bir canlı hücre görüntüleme tekniğini temsil eder. Burada, kardiyomiyositler arasındaki miRNA&#39;yı değerlendirmek için 3D-FRAP uygulamasını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Bu amaçla kardiyomiyositlere flüoresan etiketli miRNA transfekte edildi. Bu miRNA ile işaretlenmiş bir hücre fotobleached edildi ve bitişik hücrelere ait boşluk birleşimsel miRNA re-influx&#39;a zamana bağlı bir şekilde kaydedildi. FRAP deneylerinin yüksek zamansal çözünürlüğü, yaşayan hücreler arasında miRNA ve siRNA&#39;nın hücreler arası transferinin hassas değerlendirilmesi için kinetik çalışmalar yapma imkanı sunar. MoreoKüçük RNA&#39;lar farklı mekanizmalar vasıtasıyla çok farklı kinetiklerle değiştirilebildiğinden FRAP mikroskopisi, GJ&#39;lerin ilgili kepçme süreçlerinde ne dereceye kadar yer aldığını açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir 18 . Ek olarak, 3D-FRAP, GJ geçirgenliğinde fizyolojik ve patolojik değişiklikler ve bunun küçük RNA transferi üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir 15,19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">neonatal NMRI mice</td>
			<td style="width:159px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Gelatin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7041</td>
			<td style="width:179px;">0.1% solution in PBS, sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">PBS</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-53500</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Dulbecco&#180;s modified medium</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-03550</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:179px;">100 U/ml, 100&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P30-3306</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Cell culture plastic</td>
			<td style="width:159px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88281</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">HBSS</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88281</td>
			<td style="width:179px;">included in primary cardiomyocyte isolation kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250061</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">CP-004500-01-05</td>
			<td style="width:179px;">dissolve in RNAse free water, stock solution 20&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:243px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3139</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:159px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">T877.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28305.01</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium succinate</td>
			<td style="width:159px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">3195.1</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.05% Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:159px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">L2153</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">4-well- Glass bottom chamber slides</td>
			<td style="width:159px;">IBIDI</td>
			<td style="width:119px;">80827</td>
			<td style="width:179px;">coat with 0.1% gelatin solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Amaxa Nucleofector II</td>
			<td style="width:159px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;">program G-009 was used for Electroporation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td style="width:159px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Excel software</td>
			<td style="width:159px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">&#945;-actinin antibody</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab9465</td>
			<td style="width:179px;">dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Connexin43 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-9059</td>
			<td style="width:179px;">dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">goat anti-mouse Alexa 594 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">goat anti-rabbit Alexa 488 antibody&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Connexin43 siRNA</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM16708 ID158724</td>
			<td>&#160;final concentration 250nM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CellTrace Calcein Red-Orange</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI nuclear stain</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the gap junction-dependent transfer of mirna with 3d-frap microscopy

MiRNA ve siRNA gibi küçük antisens RNA&#39;lar, hücresel fizyoloji ve patolojide önemli rol oynar ve dahası, çeşitli hastalıkların tedavisinde terapötik ajanlar olarak kullanılabilir. MiRNA / siRNA tedavisi için yeni, yenilikçi stratejilerin geliştirilmesi, temel mekanizmalar hakkında kapsamlı bir bilgiye dayanmaktadır. Yeni veriler, küçük RNA&#39;ların hücreler arasında bir boşluk bağlantısına bağlı bir şekilde değiştirildiğini ve böylece alıcı hücrede gen düzenleyici etkilere yol açtığını düşündürmektedir. Moleküler biyolojik teknikler ve akış sitometrik analizi, miRNA&#39;nın hücrelerarası alışverişini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler moleküllerin boşluk birleşim akışını incelerken gerekli olan yüksek zamansal çözünürlüğü sağlamazlar. Dolayısıyla, miRNA / siRNA&#39;nın hücreler arası sinyal molekülleri olarak etkisini araştırmak için, bu küçük RNA&#39;ların hücresel seviyede analiz edilmesine izin verecek yeni araçlar gereklidir. Bu protokol, apKardiyak hücreler arasındaki miRNA moleküllerinin boşluk birleşimine bağımlı değişimini aydınlatmak için photobleaching (3D-FRAP) mikroskopisi sonrası üç boyutlu flüoresan iyileşmesinin plikasyonu. Önemlisi, bu basit ve non-invaziv canlı hücre görüntüleme yaklaşımı, yüksek zaman zamanlı çözünürlük ile gerçek zamanlı olarak floresanla işaretlenmiş küçük RNA&#39;ların boşluk birleşimsel geçişinde görselleştirme ve miktar tayini yapılmasına olanak tanır. 3D-FRAP tarafından elde edilen veriler, küçük hücrelerin içinde hücrelere sinyal düzenleyici moleküller olarak etki eden hücreler arası gen düzenlenmesinin yeni bir yolunu teyit etmektedir.

Burada, yenidoğan kardiyomiyositlerde flüoresan miRNA&#39;nın boşluğun junctional geçişini incelemek için non-invaziv bir teknik olarak 3D-FRAP mikroskobisini sunuyoruz. İzole edilen kardiyomiyositlerde, tipik olarak çizgili α-aktinin paterni görüldü ve hücreler arası hücre sınırları boyunca yüksek Cx43 plakları bulundu ( Şekil 1A , beyaz ok başları), bu da moleküllerin yüksek hücre içi akılarına izin verdi. İzole edilen kardi...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy at JoVE.com

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Burada, miRNA&#39;nın aralık bağlantısına bağımlı tomurcuk analizi için photobleaching (3D-FRAP) sonrası üç boyutlu floresan geri kazanımının uygulanmasını açıklıyoruz. Yaygın olarak uygulanan yöntemlerin aksine, 3D-FRAP, küçük RNA&#39;ların hücreler arası transferinin gerçek zamanlı olarak, yüksek uzaysal-zamanlı çözünürlük ile nicelendirilmesini sağlar.

3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

analysis-gap-junction-dependent-transfer-mirna-with-3d-frap

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Görüntüleme.  Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC).  Burada, miRNA'nın aralık bağlantısına bağımlı tomurcuk analizi için photobleaching (3D-FRAP) sonrası üç boyutlu floresan geri kazanımının uygulanmasını açıklıyoruz. Yaygın olarak uygulanan yöntemlerin aksine, 3D-FRAP, küçük RNA'ların hücreler arası transferinin gerçek zamanlı olarak, yüksek uzaysal-zamanlı çözünürlük ile nicelendirilmesini sağlar. 

Video: Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Biyomühendislik

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Genetik

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves different RNA-binding proteins in the nucleus. Mature miRNAs frequently mediate gene silencing, and this has become an important tool for comprehending post-transcriptional events. Besides that, it can be explored as a promising methodology for gene therapies. However, there is currently a lack of direct methods for assessing miRNA expression in mammalian cell cultures. Here, we describe an efficient and simple method that aids in determining miRNA biogenesis and maturation through confirmation of its interaction with target sequences. Also, this system allows the separation of exogenous miRNA maturation from its endogenous activity using a doxycycline-inducible promoter capable of controlling primary miRNA (pri-miRNA) transcription with high efficiency and low cost. This tool also allows modulation with RNA-binding proteins in a separate plasmid. In addition to its use with a variety of different miRNAs and their respective targets, it can be adapted to different cell lines, provided these are amenable to transfection.

We developed an intronic microRNA biogenesis reporter assay to be used in cells in vitro with four plasmids: one with intronic miRNA, one with the target, one to overexpress a regulatory protein, and one for Renilla luciferase. The miRNA was processed and could control luciferase expression by binding to the target sequence.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Kanser Araştırmaları

<meta charset="utf8"></head><body>smFRET-TIRF Çalışmaları için RNA'ların Çift Renkli Uç Etiketleme ve Vezikül Kapsüllenmesi

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their conformational changes over time. To monitor RNA dynamics with smFRET, we developed a method to covalently label RNAs at their termini with a FRET pair of fluorophores. This direct end-labeling strategy targets the 5&#39;-phosphate by carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS) activation and the 3&#39;-ribose by periodate oxidation, which can be adapted to other RNAs regardless of their size and sequence to study them independently of artificial modifications. Furthermore, the 5&#39;-EDC/NHS activation is of general interest to all nucleic acids with a 5&#39;-phosphate. The use of commercially available chemicals eliminates the need to synthesize RNA-specific probes.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy requires the surface-immobilized molecules of interest to be within the evanescent field to be illuminated. A sophisticated way of keeping the RNA molecules within the evanescent field is to encapsulate them in phospholipid vesicles. Encapsulation benefits from the best of both worlds, tethering the molecule to the surface while enabling free diffusion of the molecule. We ensure that each vesicle contains only a single RNA molecule, enabling single-molecule imaging. Upon dual-end labeling and encapsulation of the RNA of interest, smFRET measurements offer a dynamic and detailed view of RNA behavior.

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

This article describes the dual-color labeling of long RNAs at termini positions and their surface immobilization via encapsulation in phospholipid vesicles for single-molecule FRET TIRF microscopy applications. Combining these techniques enables precise visualization and analysis of RNA dynamics at the single-molecule level.

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

Biyokimya

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Biyoloji

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

3'LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme