Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

CSIC Mariana Di Doménico confocal mikroskobu ile onun teknik yardım almak için bu projeye verilen mali destek için teşekkür etmek istiyorum; onun el yazması düzeltmeler için José Leonardo Báez için; Luciano Correa video kurulması için yaptığı özveri için için; Rosano sesini video için ve bu çalışmada kullanılan hisse senetleri sağlamak için Bloomington Drosophila stok merkezi borç verme için Natalia için. Monoklonal anti-Ptc geliştirilen Apa1 Isabel Guerrero tarafından gelen gelişim çalışmaları Hibridoma banka (DSHB)'da NICHD elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Iowa City, IA 52242 tarafından yapılmaktadır.

Gün 1
1. toplama ve kültür pupa.
<ol>
	<li>Puparium oluşumu (APF) veya ıslak fırça kültürlü şişeleri kullanarak prepupae sonra 0 h kaldırmak ve neredeyse Geliştirme süresini tamamlamak için yeni şişeleri koyun (bkz: 2,1 ve 2,2). 
	Not: Sinekler sağlıklı bir nüfusa standart kodlamayla protokolleri kullanarak sağlanmalıdır. Üç ya da dört gün sonra içinde yumurta koyulur yetişkin bireylerin en uygun bir gelişme izin vermek için şişeleri kaldırılabilir. Üçüncü INSTAR larva pupation başlatmak kadar onlar sabit bir sıcaklıkta tutulur. Larva/pupa geçiş 0 h APF kabul prepupa oluşumu ile işaretlenir. Prepupa anterior vızıltısı çıkıntılı şekli yuvarlak bir dikdörtgen vardır hareketsiz bir beyaz larva var.</li>
</ol>
2. gün
2. Aktarım, diseksiyon ve fiksasyon.
<ol>
	<li>Pupa (geliştirme zamanı gelmeden 2 s tamamlamak) için bir fırça ile aktarmak için mikroskop slayt çift taraflı bant ile yapıştırılır. Pupa aynı yöne bakarak bir satır yukarı ve Sefalik dorsal yanlarıyla biter forma yerleştirin.</li>
	<li>Sabit sıcaklık için mikroskop slayt dönmek ve pupa uygun gelişim zaman (Yani 24-30 h APF) tamamlamak izin. 
	Not: Çift taraflı bant ile mikroskop slayt pupa durumu (aşağıya bakın) kaldırmak için bir geçici diseksiyon platform olacak. Zaman atlamalı (şişe dışında) mikroskop slaytta yapım o Forseps ile kolayca kırılabilir pupa durumda kuru için yardımcı olur.</li>
	<li>Operculum forseps kullanarak pupa durumundan çıkarın.</li>
	<li>Durum (videoda gösterildiği gibi) Forseps ile kırmak pupa tarafında bir satır Kaudal sonuna kadar yapma. Uygun aydınlatma ile menteşe üstüne sadece bir boşluk pupa kanat belirgin hale pupa iç şeklini tespit etmek mümkündür. Bu alan pupa zarar vermeden açılış gerçekleştirmek için bir rehber olarak hizmet vermektedir.</li>
	<li>Tarafından açılan sınır alacak ve onları nerede çift taraflı bant onları tutacaktır ters tarafına taşıyan dava bölümlerini kaldırın. Diseksiyon sonunda Pupa "neredeyse çıplak" sadece küçük bir parça kasanın arka uç kapsayan olacak, olacak. Not: durum küçük bir miktar üst Kaudal ucunda bırakarak amacı çift taraflı bant ile slayda davasından pürüzsüz bir yayın sağlamaktır. Bu eylem arkasındaki mantık olduğunu çünkü çok fazla kaldırmak durumunda büyük ölçüde pupa zarar riski. Çok az kaldırırsanız, öte yandan pupa kolayca durumunda ücretsiz gelmeyecek.</li>
	<li>(Forseps ile) durumda kalan aşağı doğru itin. Bu hareketin baş ve göğüs uymaları ve sonraki adımda aktarılacak tercihli bir pozisyonda kalmak için izin pupa, ön sonu yükseltin.</li>
	<li>Çift taraflı bant ile yeni bir slayt al ve pupa veya pupa satır tersine çevirin. Pupa kırılma önlemek için stereomicroscope yardımı ile hareketleri gözlemleyerek bu yaklaşım yapmak tavsiye.</li>
	<li>Biraz teybe sopa ve yavaşça pupa servis taleplerini geri kalanından kaldırmak için slayt kayma pupa yapmak için tuşuna basın. Mikroskop slayt Invert: pupa başlarının düzeyinde dorsal tarafta sıkışmış / göğüs alan.</li>
	<li>%4 paraformaldehyde ile çıplak pupa kapak ve 10 dakika bekleyin. Deneyim, sabitleştirici zamanla bu sukut yapım o sağlam, daha az yapışkan ve kolay kütikül tutarlılığını değiştirmek için yardımcı olur. 
	Not: Ribonükleik asit (RNA) ayıklama gerçekleştirmek için RNase ile yapılan yedek paraformaldehyde fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) için su ücretsiz ve her ek parça menteşe turistik yakınındaki (makas yardımıyla) bir kesim yapmak pupa kanatları kaldırın. Forseps kullanarak, Pupa kanat microcentrifuge tüp guanidinium thiocyanate ve fenol reaktif 1 mL ile aktarın. Toplam 50-80 kanat topladıktan sonra microcentrifuge tüp-80 ° C'de RNA ayıklama10,11performans kadar saklayın.</li>
	<li>Küçük bir insizyon attım menteşe bölgesi, kanat veya yakınında olun. Kanat epitel ulaşmak sabitleştirici izin. Bir pipet (p200) floş sabitleştirici kanat üzerinde kullanarak. Ne zaman değiştir kızarma kirlenmiş yeni ile bağlamak. Sonra kızarma, kanat sabitleştirici 5 min için unutmayın. 
	Not: Her ne kadar bu manevra uzakta bulaşıcı doku çoğunluğu temizlemek için yardımcı olur, bazı hemocytes ve yağ damlacıkları dorsal ve ventral epitel katmanları kanat arasında sıkışıp kalabilir ( şekil 1A' ya bakınız).</li>
	<li>(Videoda gösterildiği gibi) gözyaşı kütikül sınırları üzerinden Forseps ile deliği genişleyen ve kütikül sac kanat epitel sürümünden etkinleştirme. Kanat doku yayımlandıktan sonra fiksasyon 30 dk tamamlamak için paraformaldehyde çözüm bırakın.</li>
	<li>Bir plastik tabak 4 benzetti dolu PBST ile sabit kanatlar aktarmak (Triton X-100% 0.05). Mağaza gecede 4 ° C'de</li>
</ol>
3. gün
3. birincil antikor kuluçka dönemiydi.
<ol>
	<li>PBST pupa kanatlarda kuluçka doku permeabilize (Triton X-100% 0,2) için nazik bir sıvı orta hareketi kolaylaştırmak için sallanan bir platform kullanarak 15dk. 
	Not: Örnekleri montaj kadar adımları sallanan bir platform kullanılarak gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>PBSTA kullanarak örnekleri engelleme (BSA % 3, Triton X-100% 0.1) 1 h için.</li>
	<li>Birincil antikor (fare anti-Ptc, 1: 100) sulandırmak ve pupa kanatları gecede 4 ° C'de kuluçkaya için aynı arabellek kullanın</li>
</ol>
4. gün
4. ikincil antikor kuluçka dönemiydi.
<ol>
	<li>Yıkama örnekleri 4 x 10 dk her PBST ile (Triton X-100% 0.05)</li>
	<li>İkincil antikor (Birleşik fluorochrome içinörneğin, Anti-fare) ile kuluçkaya PBSTA uygun konsantrasyon için seyreltilmiş (BSA % 3, Triton X-100% 0.1) 2 h için karanlık oda sıcaklığında. 
	Not: Uygun olup olmadığını, doku counterstain için 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve/veya phalloidin kullanın. Bu sonda emisyon dalga boyu sinyalleri çakışma önlemek için fluorochromes dikkate alarak ikincil antikor ile ekleyin.</li>
	<li>Yıkama örnekleri 4 x 10 dk her PBST ile (Triton X-100% 0.05)</li>
</ol>
5. montaj
<ol>
	<li>Bir örnek slayt onlar köşeleri kare sanki mikroskop slayt üzerinde şeffaf oje 4 nokta koyarak hazırlamak.</li></ol>Onlar nereye coverslips dinlenme, puan olacak doku kırma önlemek için yardım.
	<li>Medya (gliserol/Tris-HCl % 80) herhangi bir köşe (nokta) dokunmadan oje ile yapılan noktaların Meydanın ortasındaki montaj yer 30 µL. Bir pipet ile sarı kırpılmış bahşiş almak, bazı montaj medya yüklemek ve sonra birkaç pupa kanatlarda çizin.</li>
	<li>Pupa kanatları ortam mikroskop slayt üzerinde takma nokta aktarın. Bahşiş yardımıyla onları yüzen gelen önlemek için pupa kanatları lavabo ve montaj medya yayıldı. Cam üzerinde yerleştirildiğinde kanatlar düz kalırsa doku morfolojisi tutulacaktır. Cam yerleştirmeden önce hava kabarcıkları kaldırın.</li>
	<li>Coverslip hava kabarcıkları nesil engellemeye çalışan örnekleri üzerine indir. Bu hareketin forseps yardımıyla yapılabilir.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu videoda açıklanan diseksiyon yöntem teknikleri birçok türleri için farklı geliştirme aşamalarını Drosophila pupa kanat örnekleri kaliteli hazırlamak için kullanılabilir (Örneğin, ayirt, cDNA sentezi için PCR deneyleri, Tüp Bebek kanat geliştirme). Bu yöntem açısından bilim adamı dahil 24-30 h APF kullandık. Ancak genç ya da yaşlı pupa diseksiyon temel adımları içinde hiçbir engel olmalıdır. Değişiklikler daha küçük sahne pupa karşılamak için yapıl...

Drosophila kanat kanat Imaginal disklerinden geliştirilir. Bu kanat diskler ilkel konur bir kenara embriyonik epitel invaginate 20-30 Imaginal hücre küçük gruplar olarak embriyonik gelişim sırasında. Larva üçüncü INSTAR Sahne Alanı'na büyüyor sırasında mitoz Imaginal hücrelerde, numaraları (yaklaşık 50000 hücreleri) yükselterek ve kanat oluşturan1,2,3disk belirli karakteristik zamanlarda oluşur, 4. Hücrelerin prolifere olarak, onlar kendi kendine katlanır bir kompakt spiral kaynaklanan bir borulu epitel moda. Pupation sırasında disk epitel dışarı formu iki katmanlı kanat teleskoplar ve boyuna damarlar lacunae aralarında, olarak iki kez kanat gelişimsel5,6sırasında oluştuğu başlar.
Damarlar düzenlenmesi her zaman özdeş bir deseni vardır; kolayca her değişiklik damar oluşumu içinde tanımlama yeteneği mutasyonlar son derece görünür (örneğin eksik veya fazla damarlar, değişiklikler ven pozisyonlar, vb.) yapar. İlginçtir, fenotip çeşitleri genellikle kanat geliştirme için uygun olan yollar sinyal, bilinen ya da roman bileşenleri mutasyonların kanıtı vardır. Bir konumu belirleme ve ven ve intervein bölgeleri korumak bir rol oynar yollar kirpi (Hh) yolu6,7,8' dir.
Pupa kanat önemi bir modeli sistem olarak göz önüne alındığında, çalışmak için kaliteli örneklerini almak önemli olacaktır. Geçmişte, protokolleri kopyalayabilmek Drosophila kanatlar için yayımlamış bilim adamları uygulanabilir örnekleri ulaşmak için uygun bir rehber vermedin. Bir araştırmacı rehberlik bir açıkça işlemi görselleştirmek olamaz. Bu alternatif diseksiyon yaklaşımlar pupa iki, ayıran kanat doku çevreleyen bölünmüş ve enkaz kaldırmak için tekrar tekrar yıkadım. Bu tür bir yaklaşım talep ücretsiz olarak kanat bırakmak kirlenmektedir ama önceki yılların deneyimi daha yavaş bir süreçtir ve kırılgan kanatları9yapısını ödün bir yüksek şans olduğunu.
Burada açıklanan yordamı pupa kanat örneklerini spesifik proteinlerin veya immunodetection iletişim kuralları veya Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) deneyleri kullanarak transkript algılamaya uygun almak için hızlı ve etkili bir yöntem bulmak için talep tarafından geliştirilmiştir. Bu, ifade ve yerelleştirme yamalı (Ptc veya Hh yolu kurallı reseptör) göstermek için başarıyla tam taşımak için ilgili ayrıntıları içeren bir protokolü sağlayan pupa kanat yapılan tespit yordam.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with cool light illumination</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plastic dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 or p200 pipette</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated water</td><td>MO.BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol&lt;br/&gt; (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (fly stock)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Drosophila melanogaster kanat geliştirme morfogenez doku düzeyinde eğitim için ideal bir modeldir. Kanat Imaginal diskler embriyonik gelişim sırasında oluşan adlandırılmış hücreler bir grup bu ekleri geliştirmek. Larva aşamasında Imaginal diskler, onun hücre sayısı artan ve monolayered epitel yapıları oluşturan büyümek. Pupa çantasının içinde Imaginal diskler dışarı ahbap ve bilayers kanat gelecekteki marjı olur bir çizgi boyunca içine katlayın. Bu işlem sırasında boyuna primodia damar damar hücreleri kanat potansiyel dorsal ve ventral yüzeylerinde kaynaklanır. Pupa aşamasında damar hücreleri her yüzey çizgili sıkı tüpler oluşturmak için iletişim kurma; aynı zamanda, çapraz-damarlar onların oluşumu başlar.
Uygun moleküler işaretleyiciler yardımıyla, kanat gelişimi sırasında beste büyük öğeleri tanımlamak mümkündür. Bu nedenle, doğru bir şekilde transkript veya proteinler bu yapısında algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme kanat geliştirme süreciyle ilgili eğitim için önemlidir.
Yordamı pupa kanat kanat pupa aşamasında incelemek konusunda ayrıntılı yönergeler sağlama, manipüle üzerinde odaklanır burada açıklanan. Pupa doku diseksiyon üçüncü INSTAR larva meslektaşlarına gerçekleştirmek daha zordur. Bu yüzden bu yaklaşım hızlı ve verimli kaliteli örneklerini almak için geliştirilmiştir. Nasıl immunostain ve mount ayrıntılarını iletişim kuralında proteinler veya hücre bileşenleri, görselleştirme izin vermek için bu kanat örnekleri sağlanır. Küçük uzmanlığı ile 8-10 kaliteli pupa kanatları kısa bir miktarda toplamak mümkündür.

Protokol kanat tanıdık Morfoloji korumak pupa kanat örnekleri elde etmek için basit bir yöntem sunmaktadır. Bu hazırlıklar yığınlar olarak 2-B veya 3-b, dağıtım ve/veya proteinler zenginleştirme kanat farklılaşma sırasında araştırmak için öngörülen görüntüleri elde etmek mümkündür. Benzer bir Protokolü (2,9 nota bakın) büyük pupa kanat örnek (içeren 50-80 pupa kanatları) tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA), PCR reaksiyonları içinde kullanı...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Doğru bir şekilde transkript veya proteinler Drosophila dokularda algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme için geliştirme süreci ile ilgili eğitim için önemlidir. Pupa kanatları incelemek için basit bir yordam açıklaması burada. Bu kanatlar örnekleri çeşitli teknikler (immünhistokimya, PCR tahlil, vb) olarak kullanılabilir.

Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K Görüntüleme.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. Doğru bir şekilde transkript veya proteinler Drosophila dokularda algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme için geliştirme süreci ile ilgili eğitim için önemlidir. Pupa kanatları incelemek için basit bir yordam açıklaması burada. Bu kanatlar örnekleri çeşitli teknikler (immünhistokimya, PCR tahlil, vb) olarak kullanılabilir.

Video: A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetik

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Nörobilim

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Gelişim Biyolojisi

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Drosophila Wing Disc'ten Görüntüleme Dpp Salınımı

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biyoloji

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Drosophila Pupal Notum'un Diseksiyonu, Sabitlenmesi ve Görselleştirilmesi

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

Drosophila Larva Hayali Disk Diseksiyonu: Gelişmekte Olan Epiteli Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...