Moustafa Saleh ve Jay Tourigny&#39;ye el yazması ile Steven Hahn ve Steven Henikoff&#39;un eleştirel okumaları için ChEC-seq&#39;in gelişimi boyunca rehberlik ve destek için ve arabulucu kompleksine uygulanmasından dolayı teşekkür ediyoruz. SG, NIH bağışları R01GM053451 ve R01GM075114 tarafından desteklenmektedir ve GEZ, Indiana Üniversitesi başlangıç ​​fonlarıyla desteklenmektedir.

1. Maya Suşlarının Üretimi <ol><li> MNase ile işaretlenmiş ilgi faktörünü taşıyan bir maya suşu üretin. <ol><li> PCR belirtilen reaksiyon karışımını ( Tablo 2 ) ve bisiklet koşullarını ( Tablo 3 ) kullanarak MNase etiketleme kasetini istenen vektörden ( Tablo 1 ) yükseltin. 5 μL PCR reaksiyonu ve 1 μL 6X DNA yükleme boyası karıştırın. Her bir PCR alikotu,% 0.8 agaroz jeli üzerinde 120 V&#39;de 40 dakika boyunca çalıştırın. Beklenen ürün boyutu ~ 2.3 kb&#39;dir. </li><li> Standart lityum asetat dönüşümü 22 kullanarak amplifiye edilmiş etiketleme kasetini seçme suyuna dönüştürün ve seçim yapın. </li><li> Etiketleme kasetinin koloni PCR ile doğru şekilde entegrasyonunu doğrulayın. <ol><li> Belirlenen reaksiyon karışımını ( Tablo 4 ), taranacak koloni sayısı için hazırlayın. Gerekirse buzda tutun. </li><li> Her bir koloni için tes için bir parça seçinSteril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak bir PCR tüpünün altına yerleştirildi. </li><li> Toplanan kolonileri 1 dakika yüksek güçte mikrodalga ile yıkayın. </li><li> Mikro dalgalı koloni ve pipet her biri için 50 μL PCR karışımı ( Tablo 4 ) ekleyin ve karıştırın. Belirtilen döngü koşullarını kullanarak PCR gerçekleştirin ( Tablo 5 ). </li><li> Her bir PCR tüpüne 50 μL PCR reaksiyonu ve 10 μL 6X DNA yükleme boya maddesi karıştırın. Her bir örnekten 10 uL,% 1 agaroz jeli üzerinde 120 V&#39;de 40 dakika boyunca çalıştırın. Beklenen ürün boyutu ~ 700 bp&#39;dir. NOT: İstenirse, MNase füzyon proteininin uygun ekspresyonunu western blotting yoluyla doğrulayın. Etiketli proteinin moleküler ağırlığında ~ 20.6 kilodaltonluk bir kayma bekleniyor. </li></ol></li></ol></li><li> İlgi geninin promotörünün pGZ136&#39;ya (Tablo 1) homoloji bazlı klonlanması ve adım 1.1.2&#39;deki gibi transformasyon ve seleksiyon yoluyla serbest bir MNase suşu üretin. <ol><li> AlternatiAyrıca ilgi geninin promotörünü ve 3xFLAG-MNase-SV40 NLS&#39;yi bir plazmid vektörüne birleştirin, transformasyon yapın ve adım 1.1.2&#39;de olduğu gibi seçin ve plazmanın idame ettirilmesi için uygun seçici durumda streyni büyütün. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> ChEC deneyinden önceki günün öğleden sonra / akşamı, MNase etiketli faktörü taşıyan tek bir koloni bulunan 3 mL maya pepton-dekstroz (YPD) veya uygun seçici besiyerini aşılayın. Bu kültüre gece boyunca inkübe edin (180 RPM sallayarak, 30 ° C). </li><li> ChEC deneyinin sabahı sabah, gece kültürü 50 mL ortam içine 600 nm&#39;de (OD 600 ) 0,2-0,3 optik yoğunluğa kadar sulandırın. Bu kültürü kuluçkalayın (180 RPM sallayarak, 30 ° C), 0.5-0.7&#39;lik bir OD 600&#39;e ulaşıncaya kadar inkübe edin. Kültür uygun OD 600&#39;e yaklaştıkça, ısı bloğu veya su banyosu 30 ° C&#39;ye ayarlanır ve çözülmeye başlar Tampon A katkı maddeleri ( Ta6). </li><li> Kültür başına 5 mL Tampon A artı katkı maddeleri ( Tablo 6 ) hazırlayın. Prosedür sırasında tampon A&#39;yı RT olarak tutun. </li><li> Toplanan her zaman noktası için 90 μL durdurma çözeltisi ( Tablo 7 ) ve 10 μL% 10 SDS içeren mikrofuge tüpleri hazırlayın. Analiz edilen her yeni faktör için 0 s, 30 s, 1 dak, 2.5 dak, 5 dak ve 10 dakıktaki örnekleri alın. </li><li> 1 saat boyunca 1,500 xg ve oda sıcaklığında (RT) 50 mL konik tüp ve santrifüj içine boşaltılmış kültür. </li><li> Hücreleri 1 mL Tampon A&#39;ya iyice süspanse edin ve yeniden süspanse edilen hücreleri bir mikrofüzyon tüpüne aktarın. Pelet, hücreleri, 1.500 xg&#39;de ve 30 saniye süreyle oda sıcaklığında bir mikrofuge&#39;de yeniden askıya aldı. </li><li> Süpernatantı aspire edin ve yukarı ve aşağı pipetleme yapılarak hücreleri 1 mL Tampon A&#39;ya iyice süspansiyon haline getirin. Pelet, hücreleri, 1.500 xg&#39;de ve 30 saniye süreyle oda sıcaklığında bir mikrofuge&#39;de yeniden askıya aldı. Bu adımı bir kez tekrarlayın. </li><li> Hücreleri, 570 μL Tampon A içinde iyice süspansiyon haline getirin. 30 μL% 2&#39;lik digitonin ekleyin(% 0.1 son konsantrasyon) ilave edin ve karışımı tersine çevirin. </li><li> Isı blokunda veya su banyosunda 30 ° C&#39;de 5 dakika boyunca hücrelerin geçirgen hale getirilmesi. </li><li> Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için reaksiyonu yukarı ve aşağı doğru pipetleyin. Durma çözeltisi ve SDS (adım 2.4) içeren bir mikrofuze tüpüne negatif bir kontrol olarak geçirgen hale getirilmiş hücrelerin 100 uL&#39;lik bir bölümünü çıkarın ve karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin. </li><li> MNase&#39;i aktive etmek için permeabilize hücrelere 1.1 uL 1 M CaCl 2 (2 mM nihai konsantrasyon) ilave edin ve birkaç kez çabucak ters çevirin veya karıştırmak için kısa sürede vorteksleyin. Karışık reaksiyonu hemen 30 ° C&#39;ye getirin ve bir zamanlayıcı başlatın. </li><li> Toplanacak her zaman noktada, hücrelerin eşit bir şekilde dağılımını sağlamak için tepkiyi pipetle aşağı ve yukarı doğru pipetleyin, daha sonra karışımı durdurmak için çözelti ve SDS ve vorteks içeren bir mikrofuge tüpüne 100μL&#39;lik bir alıkon sıvı atın. Analiz edilen her yeni faktör için 0 saniye (CaCI 2 eklenmemiştir), 30 saniye, 1 dakika, 2.5 dakika, 5 dakika ve 10 dakika zaman noktaları. NOT: 30 ° C&#39;de DNA&#39;yı hızla bölen faktörlere sahip ChEC deneyleri, MNase bölünme kinetiğini yavaşlatmak için daha düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilebilir. </li><li> Tüm zaman noktaları toplandıktan sonra, her bir numuneye 4 mg&#39;lik 20 mg / mL proteinaz K ilave edin, karıştırmak için kısa bir süre vorteksleyin ve 30 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir numuneye 200 uL 25: 24: 1 fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin, iyice karıştırmak için girdapla çalkalayın ve 5 dakika boyunca bir mikrofuzudaki maksimum hızda ve RT&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Her sulu fazı (~ 150 mcL) yeni bir tüp haline getirin. 30 μg glikojen ve 500 μL% 100 etanol ilave edin. Kuru buz üzerinde 10 dakika boyunca veya çözelti viskoz olana kadar karıştırmak ve çökelmek için şiddetle girdaplayın. </li><li> Pelet DNA&#39;yı maksimum hızla ve 4 ° C&#39;de bir mikrofüjde 10 dakika çöktürdü. </li><li> Süzüntü süpernatantları ve 1 mL RT% 70 etanol ile yıkanır peletler. </li><li> Kararsız etanol, geri kalan kısmınD kağıt havlu üzerindeki tüplere hafifçe vurarak. Örnekleri bir tezgah üstü santrifüj kullanarak kısaca döndürün ve pelleti bozmamaya dikkat ederek artık etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Hava-kuru pelletler oda sıcaklığında 5 dk. </li><li> Pelletler kuruyorken, her biri 10 mg / mL RNaz A&#39;nın her biri pH 8,0 + 1 μL olan Tris 29 mcL&#39;de kurutulmuş peletleri tekrar süspanse etmek için bir ana karışım hazırlayın. RNA&#39;yı 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca sindirin. </li><li> Her bir örnekten 5 μL&#39;lik 6X DNA yükleme boyası ile 1 μL karıştırın ve 40 dakika süreyle 120 V&#39;de% 1.5 agaroz jeli üzerinde çalıştırın. </li></ol> 3. Boyut Seçimi NOT: Boyut seçiminin amacı, çok kilobarlı genomik DNA fragmanlarını örneklenecek örnekten çıkarmak ve yaklaşık 150 bp (yaklaşık olarak nükleozomal DNA boyutu) veya daha küçük fragmanlarını zenginleştirmektir. Sıralama verisinde, &lt;400 bp&#39;lik fragmanlar, nükleozomal DNA boyutu (yaklaşık 150 bp) çevresinde belirgin bir zirve ve subnükleozomal fragmanların doruğa veya geniş dağılımı ile zenginleştirilmiştir. &lt;ol&gt; <li> Her bir numuneye, bir polietilen glikol (PEG) çözeltisi içinde 75 μL katı faz reversible immobilizasyon (SPRI) boncuk ekleyin ve karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Boncuk: DNA karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> SPRI boncuk inkübasyonu sırasında, her örnek için 96 uL 10 mM Tris, pH 8.0 ve 4 uL 5 M NaCl içeren mikrofuge tüpleri hazırlayın. </li><li> Tüpün yan tarafında boncuklar toplamak için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. Boncukların tüpün yan tarafında 2 dakika boyunca toplanmasına izin verin. </li><li> Her süpernatanı, Tris ve NaCl içeren yeni bir tüpe aktarın (adım 3.2). </li><li> Her bir numuneye 200 uL 25: 24: 1 fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin, karıştırmak için girdapla ve maksimum hızda santrifüjleyin ve 5 dakika boyunca bir mikrofüjde RT edin. </li><li> Her sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın. 30 μg glikojen ve 500 μL% 100 etanol ilave edin. Kuru buz üzerinde 10 dakika veya çözelti viskoz olana kadar DNA&#39;yı çöktürün. </li><li> Pellet preciKurutulmuş DNA en yüksek hızda ve 4 ° C mikrofüjde 10 dakika boyunca. </li><li> Süzüntü süpernatantları ve 1 mL% 70 etanol ile yıkanır peletler. </li><li> Çökmeyen etanol, kalanı ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerindeki tüplere yavaşça dokunarak çıkarın. Örnekleri bir tezgah üstü santrifüj kullanarak kısaca döndürün ve pelleti bozmamaya dikkat ederek artık etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Hava-kuru pelletler oda sıcaklığında 5 dk. </li><li> Kurutulmuş pelletleri 25 μL Tris, pH 8.0 içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Yüksek hassasiyetli bir test kullanarak örnek konsantrasyonunu belirleyin. TF ChEC deneyleri için, boyut seçildikten sonra 10-100 ng DNA rutin olarak toparlanır. </li><li> Sıralama kütüphanelerini hazırlayın. Daha önce açıklandığı gibi, boyut seçimi özelliğine sahip olmayan kütüphane hazırlama protokolleri, geniş bir yelpazedeki parçacık boyutlarının sıralamasına (25-500 bp) izin vermek için arzu edilir. </li><li> Eşleştirilmiş bit modunda sıralama kitaplıkları. Her uçta en az 25 baz dizisi, yüksek kaliteli okuma için gereklidirharitalaması. 1 ila 2 milyon okuma, bir MEÖ örneği için yeterli kapsam sağlar. NOT: ChEC-seq verilerinin analizi karmaşık bir prosedürdür ve bu makalenin kapsamı dışındadır. Veri analizi ile ilgili ayrıntılı bilgi önceki yayın 1 , 21&#39;de bulunabilir ve analiz için kullanılan özel komut dosyaları GitHub&#39;da mevcuttur (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu), ChEC-seq verilerinin komut satırı analizi için de kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells.">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast.">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).</li><li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+promoters+give+rise+to+false+positive+'Phantom+Peaks'+in+ChIP-seq+experiments.">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models.">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li><li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast.">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li><li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets.">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).</li><li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries.">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).</li><li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses.">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution.">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin.">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li><li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1.">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042 (2014).</li><li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dam+it's+good!+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions.">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li><li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins.">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins.">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules.">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li><li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup-PI:+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast.">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li><li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+Ca2++by+yeast+vacuoles.">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li><li>Gr&#252;nberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters.">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective,+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+regulatory+factors+by+immunoprecipitation+from+native+chromatin.">Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin.</a> Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities.">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies.">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li><li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells.">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li><li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants.">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li><li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints.">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li><li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells.">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li><li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines.">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Calcium+in+Neurons.">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

ChEC&#39;in kromatin üzerinde çeşitli maya protein sınıflarını haritalayabileceğini ve bunun mayada farklı TF&#39;ler ailelerine ve diğer kromatin bağlayıcı faktörlere uygulanabileceğini öngörüyoruz. ChEC-seq, çapraz bağlanma, kromatin çözünürlüğü veya antikorları gerektirmediğinden avantajlıdır. Dolayısıyla, ChEC, X-ChIP-seq&#39;de potansiyel olarak mevcut hâllerde bulunan hiper-ChIPable eser 3 , 4 ve yerli ChIP gibi, eksik pro...

Transkripsiyon faktörlerinin (TF&#39;ler), kromatin yeniden biçimlendiricilerin ve diğer kromatin ile ilişkili düzenleyici faktörlerin bağlanma yerlerinin haritalandırılması, tüm kromatin esaslı işlemleri anlamak için anahtardır. Kromatin immüno çökeltme ve yüksek verimli sekanslama (ChIP-seq) yaklaşımları, genom biyolojisine ilişkin birçok önemli bilgiler edinmek için kullanılmış olsa da, önemli sınırlamalara sahiptir. Kısa süre önce, bu dezavantajları ortadan kaldırmak için kromatin endojen bölünme ve yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) 1 olarak adlandırılan alternatif bir yöntem sunduk. ChIP-seq sıklıkla protein-DNA etkileşimlerini korumak için bir başlangıç ​​formaldehid çapraz bağlama basamağı (X-ChIP-seq) ile gerçekleştirilir. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan bir dizi çalışma, X-ChIP-seq&#39;in geçici veya nonspesifik protein-DNA etkileşimleri 2 , 3 , 4 , 5 &lt;6 , 7 , 8 , yanlış pozitif bağlanma yerlerine neden olur. Ek olarak, X-ChIP-seq deneylerinde kromatin parçalanmak için yaygın olarak kullanılan sonikasyon, açık kromatin bölgelerini keser ve bu bölgelerdeki fragmanların önyargılı olarak geri kazanılmasına neden olur 9 , 10 . Sonikasyon ayrıca, bir eksonukleç sindirim adımı eklenmesiyle 11 , 12 çözünürlüğünü büyük ölçüde artırabilecek olsa da, sonuç olarak bağlanma yeri çözünürlüğünü sınırlayan bir parçacık uzunluğunun heterojen bir karışımını üretir. Afinite ile saflaştırılmış doğal olarak izole edilmiş kromatin (ORGANIC) 13 gen alanlarının işgal edilmiş bölgeleri gibi yerli ChIP yöntemleri, formaldehit çapraz bağlanma ve sonikasyon ile ilişkili potansiyel önyargıları hafifleterek mikrokakal nükleazla (MNase) çapraz bağlama ve fragman kromatin kullanmazlar. Ancak,Doğal kromatin ekstraksiyonu için gerekli nispeten ılımlı koşullardaki birçok kromatin bağlı proteininin çözünürlüğü zayıf olup, potansiyel olarak dinamik aralık ve / veya yanlış negatiflerin azalmasına neden olur14. ChIP-seq&#39;ün çeşitli yinelemeleri, genom çapında protein-DNA etkileşimlerinin haritalanması için en çok kullanılan yöntem olmasına rağmen, ilgilenilen proteinlerin çeşitli DNA modifıye eden enzimlere kaynaşmasına dayanan çeşitli haritalama teknikleri de uygulanmıştır. Bu tür bir yaklaşım DNA&#39;nın adenine metiltransferaz tanımlaması (DamID) 15&#39;dir, burada ilgilenilen bir kromatin-bağlayıcı protein Genetik olarak Baraja kaynaştırılır ve bu füzyon, hücrelerde veya hayvanlarda eksprese edilir ve böylece GATC dizilerinin protein için bağlanma bölgelerine yakın metillenmesine yol açar. DamID, immüno çökeltiye dayanmadığı ve dolayısıyla çapraz bağlanma, antikorlar veya kromatin çözünürlüğünden kaçınması bakımından avantajlıdır. Aynı zamanda in vivo da gerçekleştirilir. ancak, DamID&#39;in çözünürlüğü kilobaz ölçeği ile sınırlıdır ve Baraj füzyon proteininin metilasyon aktivitesi yapıcıdır. Enzimatik füzyona dayanan ikinci bir yöntem Call-Card-seq 16&#39;dır ; bu, bir transpozaza bir ilgi faktörünün füzyonunu uygular ve transposonların sahaya özgü entegrasyonunu yönlendirir. DamID gibi, Calling Card-seq, immüno çöktürmeye dayalı değildir ve dolayısıyla artan çözünürlüğün ilave yararı ile benzer avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, Calling Card-seq, transpozazların sekans yanlılıkları ile sınırlanabilir ve transposon ekleme bölgelerine yakın kısıtlama alanlarının varlığına da bağımlıdır. Laemmli laboratuvarında geliştirilen üçüncü bir enzimatik füzyon yöntemi, kromatin endojen bölünme (ChEC) 17 dir . ChEC&#39;de, bir kromatin ile ilişkili protein ve MNase arasındaki bir kaynaşma, hücrelerde eksprese edilir ve MNase&#39;i aktive etmek için kalsiyum ilave edildikten sonra, DNA, etiketlenen bağlanma yerlerine proksimal olarak bölünürFaktörü ( Şekil 1 ). Güney blot ile bağlantılı olarak, ChEC maya 17 , 18&#39;de bir dizi bireysel lokusta kromatin yapısını ve protein bağlanmasını karakterize etmek için kullanılmıştır ve nükleer gözenek bileşenlerinin maya ile etkileşimini araştırmak için düşük çözünürlüklü mikro-dizi analizi ile birleştirilmiştir Genom 19 . ChEC, DamID ve Calling Card-seq&#39;ye benzer fayda sunar ve çözünürlüğü, primer uzantısı 19 ile analiz edildiğinde neredeyse tek-bazlı çifti oluşturmaktadır. ChEC de kontrol edilebilir: MNase tarafından sağlam DNA bölünmesi, canlı maya hücrelerinde gözlemlenen düşük serbest kalsiyum konsantrasyonlarında MNase&#39;in inaktif olmasını sağlayan, milimolar kalsiyum ilavesi ile ilgilidir. Daha önce, ChEC&#39;yi yüksek verimli sıralama (ChEC-seq) ile birleştirmenin, TF bağlama alanlarının yüksek çözünürlüklü haritalarını sağlayacağını varsaydık. Nitekim ChEC-seq, genom boyunca tomurcuklanan maya genel düzenleyici faktörlerin (GRF&#39;ler) Abf1, Rap1 ve Reb1&#39;in yüksek çözünürlüklü haritalarını üretti. ChEC-seq&#39;u, doğrudan DNA&#39;ya temas etmeyen ve ChIP-seq ile eşlenmeyen megadalton-boyutlu komplekslere uygulanabilirliğini genişleten, korunmuş, önemli bir global transkripsiyonel koaktivatör 21 olan modüler Mediator kompleksine başarıyla uyguladık. Tabanlı yöntemler. ChEC-seq, ChIP-seq sonuçlarının bağımsız olarak doğrulanması ve kromatin yerleşik süreçlerin düzenlenmesine ilişkin yeni anlayışların oluşturulması için güçlü bir yöntemdir. Burada, mayalanma mayasında bu yöntemin uygulanması için bir adım adım protokol sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin, High Purity</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td></tr><tr><td>MagneSphere magnetic rack</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

Genom çapında protein-DNA etkileşim haritalama, gen regülasyonunu, kromatin yeniden şekillendirmeyi ve diğer kromatin yerleşik süreçleri anlamak için kritiktir. Genom biyolojisine birçok değerli bilgi kazandırmak için kromatin immüno çökeltme ve ardından yüksek verimli sekanslama (X-ChIP-seq) ile yapılan formaldehit çapraz bağlama işlemi kullanılmıştır. Bununla birlikte, X-ChIP-seq&#39;in çapraz bağlama ve sonikasyon ile bağlantılı önemli sınırlamalar vardır. Yerli ChIP, bu dezavantajları çapraz bağlama yapılmadan çıkarmaktan kaçınır, ancak sıklıkla kromatin bağlı proteinlerin iyileşmesinde zayıflamaya neden olur. Buna ek olarak, tüm ChIP tabanlı yöntemler antikor kalitesi hususlarına tabidir. Protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için ilgi konusu bir proteinin bir DNA modifiye eden enzime kaynaştırılmasını içeren enzimatik yöntemler protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için de kullanılmıştır. Son zamanlarda ChEC-seq olarak yüksek verimli sekanslama ile böyle bir metot olan kromatin endojen bölünmeyi (ChEC) kombine ettik. ChEC-seq, bir kromatin-assokun kaynaşmasına dayanıyorCanlı hücrelerde kalsiyum varlığında hedeflenmiş DNA bölünmesi üretmek için mikrokakal nükleaz (MNase) ile ilgilidir. ChEC-seq, bağışıklık çökmesine dayalı değildir ve çapraz bağlama, sonikasyon, kromatin çözünürlüğü ve antikor kalitesi ile potansiyel endişeleri ortadan kaldırırken, minimum arka plan sinyali ile yüksek çözünürlüklü haritalama sağlar. ChEC-seq&#39;in ChIP için güçlü bir muadil olacağını ve ChIP-seq bulgularını doğrulamak ve genomik düzenlemeye yeni bakış açıları keşfetmek için bağımsız bir araç sağlayacağını düşünüyoruz.

Başarılı bir ChEC deneyinde, DNA&#39;nın agaroz jel elektroforezi ile analizi, genomik DNA&#39;nın bulaşması ve nihai olarak tamamen sindirilmesiyle gösterildiği gibi, DNA fragmentasyonunda zamanla kalsiyuma bağlı bir artış gösterecektir. Bazı durumlarda, geleneksel bir MNaz sindirimiyle görülen bantlara benzer bir bant merdiveni uzun süre sindirildikten sonra gözlemlenir. Nükleozom tükenmiş bölgelerini (NDR) bağlayan genel düzenleyici bir faktör olan Reb1&#39;i...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K Görüntüleme.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz. 

Video: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Genetik

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Biyokimya

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biyoloji

Maya Hücrelerinden Locus'a Özgü Kromatin İzolasyonu

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Yazar Spotlight: Kromatin Araştırmalarını Geliştirme ve Yüksek Zenginleştirme Locus'a Özgü Kromatin İzolasyon Protokolü ile Sınırlamaların Üstesinden Gelme 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama