Bu çalışma Levine ve ark.&#39;nın eserlerinden esinlenmiştir. , Bu deneysel yöntemi açıkladı ve Xenopus laevis&#39;teki vasküler gelişimin kapsamlı bir tanımını sağladı . Girişleri için laboratuvarımızın üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, 2015 Yonsei Üniversitesi&#39;nin Geleceğin Öncü Araştırma Girişimi (2015-22- 0095) ve Bilim, BİT ve Gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı&#39;nın (NRF) Biyo ve Tıbbi Teknoloji Geliştirme Programı tarafından desteklenmektedir ( NMK-2013M3A9D5072551)

Tüm deneyler, Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan protokollerle uyumludur. 1. Xenopus tropicalis Embriyolarının Hazırlanması NOT: Xenopus tropicalis embriyoları daha önce tarif edildiği gibi 10 hafif bir değişiklikle üretilmiştir. Xenopus tropicalis embriyoları , Nieuwkoop ve Faber 11&#39;in tablolarına göre sahnelendi. <ol><li> Yumurtlamayı indüksiyon <ol><li> Eşleştirme gününden önceki gün bir çift kurbağanın (bir erkek ve bir bayan) dorsal lenf kesesine insan koryonik gonadotropin (hCG) enjekte etmek için pre-prime uygulayın. Dişi kurbağa başına 20 birim ve erkek başına 10 birim enjekte edin. Evde bir erkek ve bir kadın aynı tankta gece boyunca (18 saatten fazla süreyle) evde bırakın. </li><li> Ertesi gün, ön-astarlanmış dişi 200 ünite hCG ve ön-astarlanmış 100 ünite hCG enjekte edinerkek; Astarlanan kadın yaklaşık 3 saat içinde yumurta bırakmaya başlayacak ve gün boyunca bunu yapmaya devam edecektir. Erkek ve dişi çiftleri doğal çiftleşme için veya in vitro fertilizasyon için ayrı tanklarda (adım 1.2) tutun. </li></ol></li><li> dölleme NOT: Yumurtalar doğal çiftleşme veya in vitro fertilizasyon ile döllenir. Doğal çiftleşmede, yumurtalar serildikçe döllenir ve bu nedenle döllenme zamanlaması kontrol edilemez. Alternatif olarak, astarlanmış bir dişi kurbağa ayrı bir depoda barındırabilir ve aynı zamanda döllenmiş yüzlerce embriyo üreten in vitro fertilizasyon için verimsiz yumurta toplanabilir. Bu yaklaşım, blastomer hedefli mikroenjeksiyon damar etiketlemeden önce gerçekleştirildiğinde yararlıdır. Ancak bu yaklaşımda bir erkek kurban edilir. <ol><li> Doğal çiftleşme <ol><li> Astarlanmış dişi ve erkek çifti aynı tankta bırakın. Erkek fEmale, bırakılan yumurtaların derhal döllenmesine yol açar. Yumurtaları bir cam veya plastik pipetle toplayın ve bir Petri kabına aktarın. Yumurtaların pipete yapışmasını önlemek için, pipetin iç yüzeyini% 0.5 sığır serumu albumin (BSA) ile kaplayın. </li></ol></li><li> In vitro fertilizasyon (IVF) <ol><li> Astarlandıktan sonra astarlanmış dişi erkeğinden ayrılmalıdır. Kadın yaklaşık 3 saat içinde kendiliğinden yumurta bırakmaya başlar. BSA kaplı bir pipet kullanarak birer tane koyulmuş yumurtayı bir Petri kabına aktarın ve mikroskop altında kalitelerini kontrol edin. Sağlıklı yumurtalar (berrak pigment, elastik top şeklinde) atılırsa, astarlı erkekten testisleri ayırmaya hazır olun. </li><li> Ötenazi için% 0.4 Tricaine metansülfonat (MS222) yapın ve astarlı erkek dorsal lenf bezi içine 300 μL enjekte edin. Yaklaşık 10 dakika sonra erkek denge duygusunu kaybedecek ve ayakta kalacaktır; Erkeklerin bir arka bacağını bir tutarak euthanize olduklarını onaylayınKünt forseps çifti ve yanıt gözlemlemek. </li><li> İki testisin parçalarını temizleyin, tüysüz kağıda hızlı bir şekilde dokundurarak temizleyin ve 1 mL% 60 Leibovitz&#39;in L-15 Medium (% 60) içeren% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte bir mikro tüp içine aktarın; Ayrıntılı bir prosedür, başka yerde 10&#39;da anlatılmıştır. </li><li> Testisleri sperm elde etmek için yavaş yavaş bir havanla kestirin. Bu konsantrasyonda ( yani, % 60 L-15&#39;de 1 mL% 10 FBS&#39;de 2 testis) birkaç damla testis solüsyonu (0.1 mL) yaklaşık üç yüz yumurta dölleyebilmektedir. Kalan sperm sıkıca kapatılmış bir tüp içerisinde 4 ° C&#39;de saklanabilir ve ertesi gün IVF için kullanılabilir. </li><li> Dişi yumurtaları küçük bir Petri kabına sıkıştırın. Dişi üst kısmını avuç içine ters olarak tutun ve işaret parmağını arka ayakları arasına koyun. Arka bacaklarını işaret parmağı ile, diğer elinizle yayarak ortaya çıkın. Petri kabına girmek için dokunun. Coat tO IVF sırasında yumurta tek bir kat olarak eşit dağıtmak için% 0.5 BSA ile Petri tabağı. </li><li> Yumurtalara birkaç damla (0.1 mL) sperm içeren L-15 ortam ekleyin. Eşzamanlı dölleme için, sperm solüsyonunu çanakta hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 4 dakika sonra, Petri kabını 0.01x Modifiye Barth&#39;s Saline (MBS) ile doldurun, 10 dakika inkübe edin ve çözeltiyi 0.1x MBS ile değiştirin. Döllenmiş yumurtalar oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat içinde ilk bölünmeye uğrayacaklardır. 1x MBS, 88 mM NaCl, 1 mM KC1, 2.5 mM NaHC03, 5 mM HEPES, 1 mM MgS04 ve 0.7 mM CaCl2, pH 7.5&#39;tir. </li></ol></li></ol></li><li> (İsteğe bağlı) Antisens morfolino oligonükleotidleri (MO&#39;lar) ve / veya mRNA&#39;ların enjeksiyonu <ol><li> İlgili bir genin damar oluşumu üzerine etkisini araştırmak için antisense MO ve / veya mRNA&#39;ların mikroenjeksiyonunu gerçekleştirin. </li><li> Bu tür deneyler için, yumurtaları 1x MBS&#39;de (pH 7.5-7.8)% 2 L-sistein ile de jölleyin.1x MBS&#39;de% 2 L-sistein ile döllenmiş embriyoları içeren çanakta 0.1x MBS&#39;yi değiştirin. Çözümü karıştırmak için çanağı yavaşça döndürün. NOT: Embriyoların jel haline getirilmesi genellikle yaklaşık 5 dakika alır. Bu adım esnasında, yumurtaları çözeltiye aşırı maruz kalmamalarını sağlamak için sık sık izleyin. Yumurtalara aşırı maruz kaldıklarında elastikiyetlerini kaybederler ve yassılaşırlar ve bu da anormal gelişim ve ölümcüllük yaratır. </li><li> Jöle silinmiş yumurtaları 0.1x MBS ile beş kez yıkayın. 0.1x MBS&#39;de çözünmüş% 4 Ficoll içinde mikroenjeksiyon uygulayın. Tipik olarak, iki hücreli evrede blastom başına 4 ng MO ve 600 pg mRNA enjekte edin. Embriyonun sadece bir tarafında gen ekspresyonunu manipüle etmek için bir hücreye enjekte edin. Kontrol olarak aynı embriyonun enjekte edilmemiş tarafını kullanın. </li><li> Gen manipülasyonunun özgüllüğü için bir başka kontrol olarak, aynı miktarda bir kontrol MO (CoMO) veya kontrol mRNA&#39;yı ( örneğin, beta-galaktosidaz mRNA) enjekte edin. CoMO aynı m&#39;ye sahip olmalıdırOleole ağırlık olarak gen-spesifik MO&#39;dır ve Xenopus genomundaki herhangi bir geni hedef almamalıdır. Enjekte edilen tarafın kolay görselleştirilmesi için floresan etiketli MO kullanın veya bir izleyici birlikte uygulayın ( ör. EGFP mRNA). </li><li> Enjekte edilen embriyoları 2 saat boyunca% 4 Ficoll&#39;a bırakın ve sonra bunları 0.1x MBS ile dolu yeni bir 60 mm Petri kabına aktarın. </li></ol></li><li> Yükselen <ol><li> Embriyoları 23 ° C&#39;de kaldırın. Gelişme hızı sırasıyla 23 ° C&#39;nin (aralık: 16-26 ° C) altındaki sıcaklıklarda veya yavaşlatıldığında hızlanabilirken, 23 ° C sıcaklıkta yükseltilmesi önerilir. </li></ol></li><li> (İsteğe bağlı) Farmakolojik reaktiflerle işleme <ol><li> Farmakolojik manipülasyonlar için, gelişen embriyolara banyo uygulamasıyla ilaçlar verin. </li></ol></li></ol> 2. DiI-AcLDL Enjeksiyonunun Hazırlanması <ol><li> Standart mikr kullanarak inceltici bir cam pipet yapınOpipet çektirme makinesi. Mikro pipet çekiciye bir borosilikat cam tüp yerleştirin ve aşağıdaki ayarları kullanın: basınç, 200; Isı, 30; Çekin, 30; Hız, 120; Zaman, 200. </li><li> DiI-AcLDL stok solüsyonunu 4 ° C&#39;de saklayın. Enjeksiyon çözeltisinin üst kısmını temizleyin, ancak tüpün altındaki çökelmiş partikülleri atmayın. Cam pipet içindeki herhangi bir pislik çözeltinin doğru bir şekilde boşaltılmasına engel olacaktır. </li><li> Hazırlanan cam pipeti, bir mikro yükleyici kullanarak uygun miktarda DiI-AcLDL çözeltisi (~ 5 μL) ile doldurun. </li><li> İnce bir forseps çifti (numara 55) kullanarak cam pipetin ucundan kük çıkartın. Basınç kontrollü enjeksiyon sistemini bir seferde yaklaşık 5 nL solüsyonun atılması için ayarlayın; 50-60 nL DiI-AcLDL çözeltisi bir embriyo damarlarını lekelemek için yeterlidir. </li><li> Kurumayı önlemek için DiI-AcLDL yüklü pipetini havaya uzun süre bırakmayınız. Pipetin ucunu% 0,04&#39;lük MS&#39;ye batırın222 0.1X MBS çözümü. Embriyonun içine enjekte etmeden önce (adım 4.2.1), aynı miktarda boya çıkıp çıkmadığını kontrol edin. </li></ol> 3. Enjeksiyon Ayarı <ol><li> Sylgard kalıp <ol><li> Küçük bir Sylgard kalıbı hazırlamak için, Sylgard tabanı ve sertleştirici ajanı 10 ila 1 ağırlık oranında karıştırın. Karışık çözeltiyle küçük bir Petri kabının (35 mm veya 60 mm bulaşıklık) yaklaşık yarısını doldurun ve yaklaşık olarak katılaşması için bırakın 48 saat oda sıcaklığında. </li></ol></li><li> Anestezi <ol><li> Anestezi için 1x MBS&#39;de (pH 7.5-8.0) 0.04% MS222 kullanın. Uzun anestezi gerektiğinde ( örneğin canlı görüntüleme sırasında), ozmotik dengesizliği azaltmak için 0.1x MBS&#39;de% 0.04 MS222 kullanın. PH&#39;ı ayarlamak için birkaç damla NaOH (~ 20 μL) ilave edin ve pH kağıdını kullanarak pH değerini kontrol edin. </li><li> Aktarılan embriyoların hareketi durana kadar bekleyin. Embriyoların dorsal yüzgeçlerine dokunun ve bunların tamamlandığını onaylamak için yanıt verip vermediğini kontrol edinnesthesia. </li></ol></li><li> Enjeksiyonluk embriyoların konumlandırılması <ol><li> Sertleştirilmiş Sylgard kalıbın yüzeyini ince ve keskin bir bıçakla girinti yapın. Embriyoların yerleştirileceği V-şeklinde içbükey girinti yapın (bkz. Şekil 2D ). Anestezi uygulanmış bir embriyo, ventral yüz yukarı eğik olarak (yaklaşık 30 °) yerleştirin ( Şekil 2D ). </li><li> Kalıbı MS222 solüsyonuyla doldurun ve embriyoları kalıba yerleştirin. </li></ol></li></ol> 4. DiI-ACLDL Enjeksiyonu <ol><li> Kalbin üstünde cilt insizyonu <ol><li> Kalbi çevreleyen cildi kesmek için iki iğne hazırlayın (Minutiens, 0.10 mm). Her iğneyi bir iğ tutucuya sıkıca sabitleyin; Titreşirken kalp kolayca tanınabilir olmalıdır ( Şekil 2A-2C , pembe). </li><li> Bir iğne ile bir embriyo cildi delin. İğneyi, kalp ve cilt arasındaki boşluğun deliğinden geçirin ( Şekil 2C </strOng&gt;, katı ok). Kalbi delmeyin. Bu iğnenin yerleştirilen kısmını, insizyon yapılacak bölgede konumlandırın. </li><li> Deri dışına tutulan diğer pimi, sokulan pime nazikçe ovarak doğrusal bir kesik açın. Bu kesiyi iki pimle hafifçe genişletin, kalbi ortaya çıkarın ( Şekil 2B &#39; ve 2D&#39; , ok). DiI-AcLDL ile yüklenen pipet doğrudan kalbe yaklaşabilir ( Şekil 2D &#39; ). </li></ol></li><li> Enjeksiyon <ol><li> Yüklenen cam pipetin ucunu kalbe yerleştirin ve yaklaşık 10 emisyon atımında 50-60 nL DiI-AcLDL solüsyonu enjekte edin. Aşırı miktarda solüsyonu enjekte etmeyin, çünkü kalp rüptürüne neden olur. Enjeksiyondan sonra kalbin atmaya devam edip etmediğini kontrol edin. Her enjeksiyondan sonra, aynı miktarda DiI-AcLDL&#39;nin atılıp çıkarılmadığını kontrol edin; Aksi halde, pipetin ucu bloke olabilir (bkz. Adım 2.5). </li></ol></li><li><stroNg&gt; Kurtarma ve görsel tarama <ol><li> Enjekte edilen embriyoları toparlanma için 0.1x MBS ile dolu yeni bir Petri kabına aktarın. 5-10 dakika sonra tadpoles bilinç kazanmalı ve hareket etmeye başlamalıdır. Şu anda, etiketli gemiler görüntülenebilir. Embriyoların floresan mikroskop altında başarıyla etiketlendiği görsel olarak taranması önerilir ( Şekil 3A ve 3B ). Bir embriyoya yeterli miktarda DiI-AcLDL enjekte edilmezse tekrar enjekte edilebilir ( Şekil 3C ). </li><li> Etiketli diğer organları olan tadpoles&#39;u atın ( Şekil 3D ). Gereken sayıda embriyo elde edilene kadar devam edin. </li></ol></li><li> (İsteğe bağlı) Embriyoların fiksasyonu <ol><li> Kan damarlarının daha ayrıntılı olarak görüntülenmesi için, konfokal mikroskopi kullanın; Konfokal mikroskopi için işaretlenmiş embriyoları düzeltmek daha kolay olabilir. İlk önce 1x MB&#39;de% 0.04&#39;lük MS222&#39;de işaretlenmiş embriyoları anestezi edinS (pH 7.5-8.0) ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içerisinde% 4 paraformaldehid içinde sabitleyin. Sabit embriyolar birkaç gün boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir; Enjekte edilen numuneleri, DiI&#39;in ışığa maruz kalmamak için ışığa karşı koruyun. </li></ol></li></ol> 5. DiI-AcLDL&#39;nin görüntülenmesi <ol><li> Stereoskopik görüntüleme <ol><li> Vasculature genel morfolojisini değerlendirmek için bir fluoresans stereoskopik mikroskop ( Şekil 3 ) altında fotoğraf çekin. </li><li> Sabit embriyolar için 1x PBS&#39;de% 1 agaroz eritin veya canlı görüntüleme için 1x MBS&#39;de eritin. Bir Petri kabına eritilmiş agaroz dökün ve katılaşıncaya kadar bekleyin. Agaroz jelinin yan tarafında yatarken imgelenecek embriyonun sığacağı sığ bir girinti yapın. Çanağı tamponla doldurun (anestezi uygulanmış embriyolar için MS222 çözeltisi veya sabit embriyolar için 1x PBS). </li></ol></li><li> Floresan mikroskobu (Rhodamine filtresit); <ol><li> DiI, rodamin veya spektral ilgili fluoroforlar için standart bir filtre seti kullanarak (maksimum 554 nm&#39;de uyarma ve 571 nm&#39;de emisyon) yeşil-uyarılan ve kırmızı yayan bir boya görüntüsüdür. Enjekte edilen embriyoları agaroz kalıbındaki girintilere yerleştirin ve fotoğraf çekin ( Şekil 3 ). </li></ol></li><li> Konfokal mikroskobi NOT: Vasküler mimariyi daha yakından incelemek için konfokal mikroskopi kullanın. <ol><li> Ters bir mikroskop kullanılıyorsa, embriyoları cam altı bir tabağa yerleştirin. Birkaç damla 1x PBS ekleyin ve üstüne bir kapak kayışı yerleştirerek onları hareketsiz hale getirin. Fazla PBS&#39;yi çıkarın. Canlı embriyolar görüntülenecekse, anestezi uygulanmış embriyolar kullanın ve PBS yerine 0.1x MBS&#39;de% 0.015 MS222 kullanın. </li><li> Düşük büyütmeli görüntüleme için ilgi alanını bulmak için 4X - 10X arasında bir hedef kullanın; Posterior Kardinal Ven&#39;in (PCV) rostral kısmı, gelişimsel anjiyogenezi araştırmak için yararlı bir bölge (Şekil 4, kesiklikutular). <ol><li> Kırmızı bir emisyon floroforu (Rhodamine gibi) için edinme ayarı kullanın. </li><li> Bir embriyonun yanal yarısını görüntüleyerek z-yığılmış görüntüler yapın. Önce, objektifin yan tarafındaki PCV&#39;ye odaklanın ve objektifin en yakınındaki kapların odaklandığı konumdaki odakın alt sınırını ayarlayın. Üst sınırı, PCV&#39;nin görüntüleneceği medial bölümünün odaklanabileceği konuma ayarlayın. Embriyonun tüm yan yarısını görüntüleyin. Gemi uzunluklarını hesaplamak için gerekli olduğu gibi x, y ve z ölçekleri gibi satın alma ayarlarındaki meta verilerini depolayan yazılımları kullanın. </li><li> Gerekirse, bir embriyonun tüm damar yapısını görüntülemek için karo tarama modunu kullanın. Ampirik olarak yatay ve dikey döşeme sayısını belirler. </li></ol></li><li> Yüksek büyütmeli görüntüleme için, PCV&#39;nin rostral bölümünü ve 4 rostral en intersomitik venleri (ISV&#39;ler) imge için yukarıdaki prosedürleri izleyin ( Şekil 4 ,Kesikli kutu). İstiflerin sayısını (z yığını) ve fayansları (fayans tarama) uygun şekilde ayarlayın. </li></ol></li></ol> 6. DiI-etiketli gemilerin miktarının tespiti NOT: DiI etiketli kaplar el ile veya yazılım kullanılarak izlenebilir. Kan damarları ve nevritler gibi tüp benzeri yapıların yarı otomatik olarak izlenmesine izin veren ücretsiz bir ImageJ (NIH) eklentisi olan &quot;Basit nevrit tracer&quot; kullanıyoruz 12 . Bu özgür yazılım kullanılarak aşağıdaki parametreler hesaplanabilir. Bu yazılımın kullanımı için ayrıntılı bir prosedür, başka yerlerde (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) açıklanmıştır 12 . Aşağıda, Tie2 sinyalinin inhibe edildiği veya çoğaltıldığı embriyoların vaskülatür örneklerini kullanıyoruz ( Şekil 4A-4C ). Antisens Tie2MO enjekte edilen embriyolar, anjiyogenezi düşürür ve ISV&#39;leri kısaltır ( Şekil 4B ), oysa yapısal olarak aktif Tie2&#39;nin birlikte enjeksiyonuMutant mRNA (caTie2 mRNA), bu fenotipi kurtararak aşırı derecede ISV dalları oluşturur ( Şekil 4C ). <ol><li> ISV uzunlukları <ol><li> Basit nevrit tracer&#39;ı kullanarak, izlenen her gemi uzunluğunu hesaplayın. 4 rostral en ISV&#39;lerin uzunluklarını hesaplayın. </li></ol></li><li> ISV şubeleri NOT: Vahşi embriyolarda, sahnede 42 rostral en ISV&#39;lerden sadece birkaç kısa dallar filizlenir. <ol><li> Basit nevrit tracer&#39;da, bu küçük damarları, birincil dalı oluşturduğu ISV&#39;yi yaptıktan sonra izleyin. Bu dalların ISV&#39;lerden kaynaklanan aşağıdaki parametrelerini hesaplayın. </li><li> Toplam şube sayısı <ol><li> Tüm ISV&#39;ler ve ilişkili dallar izlandıktan sonra toplam dal sayısını hesaplayın ( Şekil 5B-5D ). </li></ol></li><li> Şube siparişi <ol><li> Simple neurite tracer, her dalın sırasını kaydettiğinden ( Şekil 5A ), calculatE her sipariş için şube sayısı. Vahşi tipli embriyolardaki damarların çoğunluğu birincil dallar olmalıdır ( yani ISV&#39;ler). </li></ol></li><li> Damar kompleksite indeksi (VCI) <ol><li> VCI, yüksek dereceli dallara daha fazla ağırlık veren, karmaşıklık için yararlı bir parametredir, Şekil 5A&#39;daki formülü kullanarak her embriyo için VCI&#39;yi hesaplayın. Örneğin, Tie2MO enjekte edilen embriyolar, kontrol ( Şekil 5B ve 5C ) ile karşılaştırıldığında daha düşük bir VCI&#39;ye sahiptir ve caTie2 mRNA enjekte edilen embriyoların daha yüksek bir VCI&#39;ye sahiptir ( Şekil 5D ). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+morphogenesis+and+homeostasis+through+the+angiopoietin-Tie+system.">Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+endothelial+cells+allows+in+vivo,+continuous+characterization+of+the+vascular+development+of+Xenopus+laevis.">Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+Mediates+Ca2+-Dependent+Inhibition+of+Tie2+Signaling+and+Acts+as+a+Developmental+Brake+During+Embryonic+Angiogenesis.">Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Xenopus+laevis+tissues+to+determine+the+ability+of+motor+neurons+to+acquire+a+novel+target.">Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target.</a> PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).</li><li>Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+as+a+model+organism+for+genetics+and+genomics:+past,+present,+and+future.">Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future.</a> Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).</li><li>Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lysine+residues+of+plasma+lipoproteins+in+high+affinity+binding+to+cell+surface+receptors+on+human+fibroblasts.">Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts.</a> J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+collection+and+in+vitro+fertilization+of+the+western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Cha, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+repurposed+networks+reveal+the+well-known+antifungal+drug+thiabendazole+to+be+a+novel+vascular+disrupting+agent.">Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent.</a> PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).</li><li>Ny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Xenopus+laevis+reporter+model+to+study+lymphangiogenesis.">A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis.</a> Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).</li><li>Bussmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+provide+essential+guidance+cues+for+lymphatic+endothelial+cells+in+the+zebrafish+trunk.">Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk.</a> Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).</li><li>Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+acetylated+low-density+lipoprotein+uptake+and+low+tyrosine+kinase+with+immunoglobulin+and+epidermal+growth+factor+homology+domains-2+(Tie2)+promoter+activity+distinguish+sinusoids+from+other+vessel+types+in+murine+bone+marrow.">High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow.</a> Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada sunulan protokol ilk olarak Xenopus laevis 4&#39;te vasküler oluşum sırasında gelişme olaylarını araştırmak için Ali H. Brivanlou ve arkadaşları tarafından geliştirildi, ancak bu el yazmasında gösterildiği gibi diğer küçük hayvanlara uygulanabilir. Kalbe boya enjeksiyonu gerçekleştirmek kolaydır ve tüm vasküler ağ, bir floresan diseksiyon mikroskopu altında bir konfokal mikroskop altında görüntülenebilir. Boya damar gelişiminde kalbe enjekte edilir...

Vaskülojenez, yeni doğan endotel hücrelerinden yeni kan damarlarının oluşumu ve önceden var olan damarlardan yeni damarların oluşumu olan anjiyogenez, embriyonik vaskülatürü şekillendiren iki ayrı süreçtir 1 . Bu işlemlerdeki herhangi bir düzensizlik, çeşitli kalp hastalıklarına ve damarların yapısal anormalliklerine neden olur. Dahası, tümör büyümesi, kontrolsüz damar büyümesi ile ilişkilidir. Bu nedenle, vaskülojenezin ve anjiyogenezinin altında yatan moleküler mekanizmalar yoğun araştırma konusudır 2 . Xenopus ve zebra balığı çeşitli nedenlerle vaskülogenez ve anjiyogenez çalışmaları için cazip omurgalı modelleridir. Birincisi, embriyoları küçüktür; Bu nedenle, tüm vaskülatürün görüntüsünü görmek nispeten kolaydır. İkincisi, embriyonik gelişme hızlıdır; Tüm vaskülatürün gelişmesi yalnızca birkaç gün alır, bu süre boyunca gelişmekte olan vaskül<html> Resimlenebilir. Üçüncü olarak, gelişmekte olan embriyoya antisens morfolino nükleotidlerinin (MO&#39;lar) mikroenjeksiyon veya ilaçlar 3 , 4 , 5&#39;in banyo uygulaması yoluyla uygulanması gibi, damar oluşumu öncesi ve sırasında genetik ve farmakolojik müdahalelerin gerçekleştirilmesi kolaydır. Xenopus&#39;un zebra balığı üzerindeki benzersiz avantajı, Xenopus&#39;un stereotipik holoblastik bölünmeleri izlemesi ve embriyonik kader haritasının iyi tanımlanmış olması nedeniyle 6 embriyolojik manipülasyonların gerçekleştirilebilmesidir. Örneğin, iki hücreli evredeki bir hücrede bir antisense MO enjekte edilerek yalnızca bir yanal bölgenin genetik olarak manipüle edildiği bir embriyo üretmek mümkündür. Kalbin primordiumun bir embriyodan diğerine nakledilmesi, genin işlevini hücre içi veya ekstrensek mekanizma ile uygulayıp uygulamadığını belirlemek de mümkündürAss = &quot;xref&quot;&gt; 7. Bu teknikler çoğunlukla allotetraploid olan ve bu nedenle genetik araştırmalar için ideal olmayan Xenopus laevis&#39;de geliştirilmiş olmakla birlikte , yakından ilişkili bir diploid tür olan Xenopus tropikalis&#39;e doğrudan uygulanabilirler8 . Canlı bir Xenopus embriyosunda vaskülatürün görselleştirilmesinin bir yolu, kan damarlarını etiketlemek için bir flüoresan boya enjekte etmektir. DiI gibi bir floresan molekülü ile etiketlenmiş asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (AcLDL) çok yararlı bir probdur. Asetilasid LDL&#39;nin aksine, AcLDL LDL reseptörüne 9 bağlamaz, ancak makrofajlar ve endotel hücreleri tarafından endositize edilir. Canlı bir hayvanın kalbine DiI-AcLDL enjeksiyonu, endotel hücrelerinin spesifik flüoresan etiketlenişiyle sonuçlanır ve tüm vaskülatür, canlı veya sabit embriyoların flüoresan mikroskopisi ile görüntülenebilir. İşte biz presXenopus tropikalis&#39;teki DiI -AcLDL&#39;yi kullanarak kan damarlarının görüntülenmesi ve nicelenmesi için ayrıntılı protokoller ( Şekil 1 ). Başarılı ve başarısız deney örnekleri ile önemli pratik noktalar sağlarız. Buna ek olarak, vasküler ağın şekillendirilmesinde genetik ve çevresel faktörlerin etkilerini değerlendirmede yararlı olabilecek, vasküler kompleksitenin kantitatif analizi için basit bir yöntem sunuyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

Kan damarları vücuda oksijen ve besin sağlarlar ve vasküler ağ oluşumu sıkı gelişim kontrolü altındadır. Kan damarlarının etkili in vivo görselleştirilmesi ve karmaşıklığının güvenilir bir şekilde ölçülmesi, damar şebekesinin biyolojisi ve hastalığını anlamanın anahtarıdır. Burada, piyasada bulunan bir flüoresan boya, insan plazması asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein DiI kompleksi (DiI-AcLDL) ile kan damarlarını görselleştirmek ve Xenopus tropicalis&#39;deki karmaşıklığını ölçmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz . Kan damarları, bir embriyonun atan kalbine basit bir DiI-AcLDL enjeksiyonuyla etiketlenebilir ve tüm embriyo içindeki kan damarları canlı veya sabit embriyolarda görüntülenebilir. Nükleik asitlerin hedeflenen mikroenjeksiyonu ve / veya farmakolojik reaktiflerin banyo uygulaması ile gen pertürbasyonuyla kombine edildiğinde, bir genin veya sinyal yolunun vasküler gelişim üzerindeki rolleri inve edilebilirSofistike genetik mühendisliğe tabi tutulmuş hayvanlara başvurmadan bir hafta içinde denendi. Xenopus&#39;un iyi tanımlanmış venöz sistemi ve stereotipik anjiyojenezinden dolayı, var olan damarların filizlenmesi, karmaşıklık, pertürbasyon deneylerinden sonra verimli bir şekilde nicelleştirilebilir. Bu nispeten basit protokol, çeşitli kardiyovasküler araştırmalarda kolay erişilebilir bir araç olarak kullanılmalıdır.

Deneylerin zaman çizelgesi (Şekiller 1 ve 2) Döllenmeden kısa bir süre sonra, gen ekspresyonunu modüle etmek için hedeflenmiş mikroenjeksiyon yapılabilir. Örneğin, endojen Tie2 mRNA&#39;nın başlatma kodonuna spesifik olarak bağlanan bir antisense MO, enjekte edilebilmekte ve Tie2 hedef mRNA&#39;sının translasyonunu sterik engelleyerek inhibe edebilmektedir. Bir MO, başarıyla enjekte edilen embriyoların kolay g?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis at JoVE.com

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis&#39;deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

visualization-quantitative-analysis-embryonic-angiogenesis-xenopus

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

8.4K Görüntüleme.  Yonsei University College of Medicine.  Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir. 

Video: Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Manipülasyon ve

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Konfokal Analizi Kullanımı

Kök hücre benzeri

Transcriptome Profil

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun