Este estudo foi inspirado no trabalho de Levine et al. , Que descreveu este método experimental e forneceu uma descrição abrangente do desenvolvimento vascular em Xenopus laevis. Agradecemos aos membros do nosso laboratório por sua contribuição. Este estudo foi apoiado pela Universidade de Yonsei Iniciativa de Investigação Futuro de 2015 (2015-22-0095) eo Programa de Desenvolvimento de Tecnologia Biológica e Médica da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planeamento Futuro NRF-2013M3A9D5072551)

Todos os experimentos obedeceram a protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Yonsei. 1. Preparação de Xenopus tropicalis Embryos NOTA: Os embriões de Xenopus tropicalis foram produzidos como descrito anteriormente 10 , com ligeira modificação. Os embriões de Xenopus tropicalis foram encenados de acordo com as tabelas de Nieuwkoop e Faber 11 . <ol><li> Indução da ovulação <ol><li> Para pré-primário, injetar gonadotropina coriônica humana (hCG) no saco linfático dorsal de um par de rãs (um macho e uma fêmea) no dia anterior ao dia do acasalamento. Injectar 20 unidades por rã fêmea e 10 unidades por macho. Casa um macho e uma fêmea no mesmo tanque durante a noite (por mais de 18 h). </li><li> Para iniciar, no dia seguinte, injetar 200 unidades de hCG para a fêmea pré-preparada e 100 unidades de hCG para o pré-fermentadomasculino; A fêmea iniciada começará a pôr ovos em aproximadamente 3 h e continuará a fazê-lo durante todo o dia. Manter o par macho e fêmea juntos para acasalamento natural ou em tanques separados para fertilização in vitro (passo 1.2). </li></ol></li><li> Fertilização NOTA: Os ovos podem ser fertilizados por acasalamento natural ou fertilização in vitro . No acasalamento natural, os ovos são fertilizados como eles são colocados, e, portanto, o momento da fertilização não pode ser controlada. Alternativamente, uma rã fêmea preparada pode ser alojada num tanque separado e os ovos não fertilizados podem ser recolhidos para fertilização in vitro , o que gera centenas de embriões fertilizados ao mesmo tempo. A última abordagem é útil quando a microinjecção dirigida a blastómeros será realizada antes da marcação do vaso. Nesta abordagem, no entanto, um macho é sacrificado. <ol><li> Acasalamento natural <ol><li> Deixe o par preparado fêmea e macho no mesmo tanque. O macho fecho a fLevando à fertilização imediata dos ovos postos. Recolher os ovos com uma pipeta de vidro ou plástico e transferi-los para uma placa de Petri. Para evitar que os ovos fiquem presos à pipeta, revestir a superfície interna da pipeta com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA). </li></ol></li><li> Fertilização in vitro (FIV) <ol><li> Separar o macho aprisionado do macho após a iniciação. A fêmea começará a pôr os ovos espontaneamente em aproximadamente 3 h. Transferir alguns ovos colocados usando uma pipeta revestida com BSA para uma placa de Petri e verificar a sua qualidade sob um microscópio. Se os ovos saudáveis ​​(pigmento claro, elástico em forma de bola) foram colocados, prepare-se para dissecar os testículos do macho preparado. </li><li> Faça 0,4% de metanossulfonato de Tricaine (MS222) para a eutanásia e injete 300 μL no saco linfático dorsal do macho preparado. Em aproximadamente 10 min, o macho perderá seu senso de equilíbrio e permanecerá à tona; Confirmar que o macho é eutanizado por beliscar uma perna traseira com umaPar de fórceps rombos e observando nenhuma resposta. </li><li> Dissecar os dois testículos, limpá-los rapidamente batendo-os em papel sem fiapos e transferi-los para um microtubo contendo 1 mL de 60% de Leibovitz&#39;s L-15 Medium (60%) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS); Um procedimento detalhado é descrito em outra parte 10 . </li><li> Mergulhe suavemente os testículos com um pilão para extrair o esperma. Nesta concentração ( isto é, 2 testículos em 1 mL de FBS a 10% em 60% de L-15), algumas gotas da solução de testículo (0,1 mL) podem fertilizar cerca de 300 ovos. O esperma restante pode ser armazenado a 4 ° C em um tubo hermeticamente fechado e usado para FIV no dia seguinte. </li><li> Esprema os ovos da fêmea em uma pequena placa de Petri. Segure a parte superior da fêmea de cabeça para baixo na palma da mão e coloque o indicador entre as patas traseiras. Espalhe as patas traseiras com o dedo indicador e a outra mão para expor a cloaca. Toque a cloaca para a placa de Petri. CasacoEle prato de Petri com 0,5% de BSA para distribuir uniformemente os ovos como uma monocamada durante a FIV. </li><li> Adicionar algumas gotas (0,1 mL) de espermatozóide contendo L-15 meio para os ovos. Para fertilização síncrona, mexa suavemente a solução de esperma através do prato. Após 4 min à temperatura ambiente, encher a placa de Petri com 0,01x de solução salina de Barth modificada (MBS), incubar durante 10 min e substituir a solução por 0,1 x MBS. Os ovos fertilizados sofrerão a primeira clivagem em aproximadamente 1 h à temperatura ambiente. 1x MBS é NaCl 88 mM, KCl 1 mM, NaHCO3 2,5 mM, HEPES 5 mM, MgSO4 1 mM e CaCl2 0,7 mM, pH 7,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Opcional) Injecï¿½o de oligonucleï¿½idos (MOs) e / ou ARNm morfolino anti-sentido <ol><li> Para investigar o efeito de um gene de interesse na formação de vasos, efectuar a microinjecção de MO e / ou mRNAs anti-sentido. </li><li> Para tais experiï¿½cias, desengorduram os ovos com 2% de L-cisteï¿½a em 1x MBS (pH 7,5-7,8).Substituir 0,1x MBS no prato contendo os embriões fertilizados com 2% de L-cisteína em 1x MBS. Agitar suavemente o prato para misturar a solução. NOTA: Geralmente leva cerca de 5 min para que os embriões sejam desjelados. Durante esta etapa, monitorar os ovos com freqüência para garantir que eles não estão sobre-expostos à solução. Se os ovos são sobre-expostos, eles vão perder elasticidade e tornar-se achatado, o que irá causar desenvolvimento aberrante e letalidade. </li><li> Lavar os ovos de gelatina cinco vezes com 0,1 x MBS. Realizar a microinjeção em Ficoll 4% dissolvido em 0,1x MBS. Tipicamente, injectar 4 ng de MO e 600 pg de mRNA por blastómero no estádio de duas células. Injetar em uma célula para manipular a expressão gênica em apenas um lado do embrião. Use o lado não injetado do mesmo embrião como um controle. </li><li> Como outro controlo para a especificidade da manipulação de genes, injetar a mesma quantidade de um controlo MO (CoMO) ou ARNm de controlo ( eg, mARN de beta-galactosidase). CoMO deve ter o mesmo mOlecular como o MO específico do gene e não deve alvejar nenhum gene no genoma de Xenopus . Para visualização fácil do lado injetado, use MO marcado com fluoresceína ou co-injeção de um marcador ( eg, EGFP mRNA). </li><li> Deixar os embriões injetados em Ficoll 4% por 2 h e, em seguida, transferi-los para uma nova placa de Petri 60 mm preenchido com 0.1x MBS. </li></ol></li><li> Elevação <ol><li> Levantar os embriões a 23 ° C. Embora a velocidade de desenvolvimento possa ser abrandada ou acelerada usando temperaturas abaixo ou acima de 23 ° C, respectivamente (intervalo: 16-26 ° C), recomenda-se elevá-los a 23 ° C. </li></ol></li><li> (Opcional) Tratamento com reagentes farmacológicos <ol><li> Para manipulações farmacológicas, administrar medicamentos aos embriões em desenvolvimento por aplicação de banho. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de Injecção de DiI-AcLDL <ol><li> Faça uma pipeta de vidro afilada usando um micr padrãoOpipette puller. Coloque um tubo de vidro de borossilicato no extrator de micropipeta e use as seguintes configurações: pressão, 200; Calor, 30; Puxar, 30; Velocidade, 120; Tempo, 200. </li><li> Armazenar a solução-mãe DiI-AcLDL a 4 ° C. Tome a parte clara superior da solução para injeção, mas não as partículas precipitadas no fundo do tubo. Qualquer detrito na pipeta de vidro irá perturbar a ejecção adequada da solução. </li><li> Encher a pipeta de vidro preparada com uma quantidade adequada de solução DiI-AcLDL (~ 5 μL) usando um microcarregador. </li><li> Retirar a ponta da pipeta de vidro pouco a pouco usando um fino par de pinças (número 55). Configure o sistema de injeção controlado por pressão para que aproximadamente 5 nL de solução seja ejetado de cada vez; 50-60 nL de solução DiI-AcLDL é suficiente para manchar os vasos de um embrião. </li><li> Não deixe a pipeta carregada com DiI-AcLDL no ar por um longo período de tempo para evitar a secagem. Manter a ponta da pipeta submersa em MS a 0,04%222 em solução de MBS a 0,1X. Antes de injectá-lo no embrião (passo 4.2.1), verifique se a mesma quantidade de corante é ejectada. </li></ol> 3. Configuração da Injeção <ol><li> Molde Sylgard <ol><li> Para preparar um pequeno molde de Sylgard, misture a base de Sylgard e o agente de cura com uma razão de peso de 10 para 1. Encha aproximadamente metade de uma pequena placa de Petri (placa de 35 mm ou 60 mm) com esta solução mista e deixe-a solidificar durante aproximadamente 48 h à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Anestesia <ol><li> Utilizar 0,04% de MS222 em 1x MBS (pH 7,5-8,0) para anestesia. Quando é necessária anestesia prolongada ( por exemplo, durante a imagiologia ao vivo), use MS222 a 0,04% em 0,1x MBS para reduzir o desequilíbrio osmótico. Para ajustar o pH, adicione algumas gotas de NaOH (~ 20 μL) e verifique o pH usando papel pH. </li><li> Espere até que os embriões transferidos parar de se mover. Toque as barbatanas dorsais dos embriões e verifique se eles respondem para confirmarNestesia. </li></ol></li><li> Posicionamento de embriões para injeção <ol><li> Recorte a superfície do molde Sylgard endurecido com uma lâmina fina e afiada. Faça um recuo côncavo em forma de V para colocar os embriões (ver Figura 2D ). Coloque um embrião anestesiado, lado ventral para cima, de forma ligeiramente oblíqua (aproximadamente 30 °) ( Figura 2D ). </li><li> Encha o molde com solução MS222 e coloque os embriões no molde. </li></ol></li></ol> 4. Injecção DiI-AcLDL <ol><li> Incisão da pele sobre o coração <ol><li> Preparar dois pinos (Minutiens, 0,10 mm) para cortar a pele sobre o coração. Aperte firmemente cada pino em um porta-pinos; O coração deve ser facilmente identificável à medida que pulsa ( Figura 2A-2C , rosa). </li><li> Perfure a pele de um embrião com um alfinete. Insira o pino através do orifício no espaço entre o coração ea pele ( Figura 2C </strOng&gt;, seta sólida). Não perfure o coração. Posicione a parte inserida deste pino na região onde a incisão será feita. </li><li> Faça uma incisão linear esfregando suavemente o outro pino segurado fora da pele contra o pino inserido. Gentilmente alargar esta incisão com dois pinos, expondo o coração ( Figura 2B &#39; e 2D&#39; , seta). A pipeta carregada com DiI-AcLDL pode agora aproximar-se directamente do coração ( Figura 2D &#39; ). </li></ol></li><li> Injeção <ol><li> Insira a ponta da pipeta de vidro carregada no coração e injete 50-60 nL de solução DiI-AcLDL em aproximadamente 10 pulsos de ejeção. Não injetar uma quantidade excessiva de solução, pois faz com que o coração se rompa. Verifique se o coração continua a bater após a injeção. Após cada injeção, verifique se a mesma quantidade de DiI-AcLDL é ejetada; Caso contrário, a ponta da pipeta pode ser bloqueada (ver passo 2.5). </li></ol></li><li><stroNg&gt; Recuperação e rastreio visual <ol><li> Transfira os embriões injetados para uma nova placa de Petri cheia de 0,1x MBS para recuperação. Após 5-10 min, os girinos devem recuperar a consciência e começar a se mover. Neste momento, os vasos marcados podem ser visualizados. Recomenda-se a visualização visual de embriões marcados com sucesso sob um microscópio de fluorescência ( Figura 3A e 3B ). Se uma quantidade insuficiente de DiI-AcLDL é injetada em um embrião, ela pode ser injetada novamente ( Figura 3C ). </li><li> Descarte os girinos que têm outros órgãos rotulados ( Figura 3D ). Continue até obter o número necessário de embriões marcados com êxito. </li></ol></li><li> (Opcional) Fixação dos embriões <ol><li> Para uma imagem mais completa dos vasos sanguíneos, use microscopia confocal; Pode ser mais fácil fixar os embriões marcados para microscopia confocal. Primeiramente, anestesiar os embriões marcados em MS222 a 0,04% em 1x MBS (pH 7,5-8,0) e depois fixa-os em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) durante 1 h à temperatura ambiente. Embriões fixos podem ser armazenados por vários dias a 4 ° C; Proteger as amostras injectadas da luz para evitar o foto-branqueamento da DiI. </li></ol></li></ol> 5. Imagem de Di-AcLDL <ol><li> Imagem estereoscópica <ol><li> Tomar fotografias sob microscópio estereoscópico de fluorescência ( Figura 3 ) para avaliar a morfologia geral da vasculatura. </li><li> Derreta 1% de agarose em 1x PBS para embriões fixos ou em 1x MBS para imagens ao vivo. Derrame a agarose derretida em uma placa de Petri e espere até solidificar. Faça um recuo raso na superfície do gel de agarose que irá encaixar o embrião a ser visualizado quando deitado em seu lado lateral. Encha o prato com tampão (solução MS222 para embriões anestesiados ou 1x PBS para embriões fixos). </li></ol></li><li> Microscopia de fluorescência (Rhodamine filter seT) <ol><li> Como DiI é um corante verde-excitado e emissor vermelho, imagem usando um conjunto de filtros padrão para rodamina ou fluoróforos relacionados espectralmente (excitação máxima a 554 nm e emissão a 571 nm). Colocar os embriões injetados nas cavidades no molde de agarose e tirar fotografias ( Figura 3 ). </li></ol></li><li> Microscopia confocal NOTA: Para uma análise mais detalhada da arquitetura vascular, use microscopia confocal. <ol><li> Se estiver usando um microscópio invertido, posicione os embriões num prato de fundo de vidro. Adicionar algumas gotas de 1x PBS e imobilizá-los, colocando um cobertor no topo. Remova o excesso de PBS. Se os embriões vivos forem fotografados, use embriões anestesiados e use 0,015% MS222 em 0,1x MBS em vez de PBS. </li><li> Para imagens de baixa ampliação, use um objetivo de 4X a 10X para localizar a área de interesse; A parte rostral da veia cardinal posterior (PCV) é uma região útil para investigar a angiogênese do desenvolvimento (Figura 4,Caixas). <ol><li> Use um ajuste de aquisição para um fluoróforo de emissão vermelha (tal como Rhodamine). </li><li> Faça imagens z-empilhadas por imagem da metade lateral de um embrião. Primeiro, focalize o PCV no lado lateral perto do objetivo e, em seguida, defina o limite inferior do foco na posição onde os vasos mais próximos do objetivo estão em foco. Defina o limite superior na posição em que a parte mediana do PCV que está sendo fotografado pode ser focalizada. Imagem toda esta metade lateral do embrião. Use um software que armazena metadados nas configurações de aquisição, como escalas x, y e z, uma vez que são necessários para calcular os comprimentos do vaso. </li><li> Se necessário, use o modo de varredura de telha para imagem toda a vasculatura de um embrião. Empiricamente determinar o número de telhas horizontais e verticais. </li></ol></li><li> Para imagens de alta ampliação, siga os procedimentos acima para a imagem da parte rostral do PCV e 4 rostral mais veias intersomitic (ISVs) ( Figura 4 ,Caixa tracejada). Ajuste o número de pilhas (z-stack) e tiles (tile scan) apropriadamente. </li></ol></li></ol> 6. Quantificação de vasos marcados com DI NOTA: Os recipientes Di-rotulados podem ser rastreados manualmente ou usando software. Usamos o &quot;Simple neurite tracer&quot;, um plugin ImageJ (NIH) gratuito, que permite o rastreamento semi-automático de estruturas semelhantes a tubos, como vasos sanguíneos e neurites 12 . Usando este software livre, os seguintes parâmetros podem ser calculados. Um procedimento detalhado para o uso deste software é descrito em outro lugar (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Abaixo, usamos exemplos da vasculatura de embriões em que a sinalização de Tie2 é inibida ou aumentada ( Figura 4A-4C ) 5 . A exposição de embriões injectados Tie2MO anti-sentido reduz a angiogénese e reduz os ISVs ( Figura 4B ), enquanto que a co-injecção de Tie2 constitutivamente activoMRNA mutante (mRNA caTie2) sobre-resgata este fenótipo, resultando em exuberantes ramos ISV ( Figura 4C ). <ol><li> Comprimentos ISV <ol><li> Usando o traçador de neurite simples, calcule o comprimento de cada vaso traçado. Calcule os comprimentos dos 4 ISVs mais rostral. </li></ol></li><li> Filiais de ISV NOTA: Em embriões de tipo selvagem, apenas alguns ramos curtos brotam do rostral, a maioria dos ISVs no estágio 42. <ol><li> No traçador de neurite simples, rastrear esses pequenos vasos após fazer o ISV de onde eles originam o ramo primário. Calcule os seguintes parâmetros desses ramos originários dos ISVs. </li><li> Número total de filial <ol><li> Uma vez que todos os ISVs e os ramos associados sejam rastreados, calcule o número total de ramos ( Figura 5B-5D ). </li></ol></li><li> Ordem de filial <ol><li> Como simples neurite traçador registra a ordem de cada ramo ( Figura 5A ), calculatE o número de agências para cada ordem. A maioria dos vasos em embriões de tipo selvagem deve ser ramos primários ( ie, ISVs). </li></ol></li><li> Índice de complexidade veia (VCI) <ol><li> Como VCI é um parâmetro útil para a complexidade do vaso, o que dá mais peso aos ramos de ordem superior, calcule o VCI para cada embrião usando a fórmula na Figura 5A . Por exemplo, os embriões injectados com Tie2MO têm uma VCI inferior em comparação com o controlo ( Figura 5B e 5C ) e os embriões injectados com mRNA caTie2 têm uma VCI mais elevada ( Figura 5D ). </li></ol></li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado aqui foi desenvolvido pela primeira vez por Ali H. Brivanlou e colegas para investigar eventos de desenvolvimento durante a formação vascular em Xenopus laevis 4 , mas, como mostrado neste manuscrito, pode ser aplicado a outros pequenos animais. Injecção de corante no coração é simples de realizar, e toda a rede vascular pode ser visualizada sob um microscópio de dissecção de fluorescência, bem como um microscópio confocal. Se o corante é injetado no ...

A vasculogênese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir de células endoteliais recém-nascidas ea angiogênese, a formação de novos vasos de vasos pré-existentes, são dois processos distintos que moldam a vasculatura embrionária 1 . Qualquer desregulação nestes processos resulta em várias doenças cardíacas e anormalidades estruturais dos vasos. Além disso, o crescimento tumoral está associado com o crescimento descontrolado do vaso. Como tal, os mecanismos moleculares subjacentes à vasculogênese e à angiogênese são objeto de intensa investigação 2 . Xenopus e zebrafish são modelos de vertebrados atraentes para estudos de vasculogênese e angiogênese, por várias razões. Primeiro, seus embriões são pequenos; Portanto, é relativamente fácil imaginar toda a vasculatura. Em segundo lugar, o desenvolvimento embrionário é rápido; Leva apenas um par de dias para toda a vasculatura desenvolver, durante o qual o desenvolvimento vascular<html> Pode ser visualizada. Em terceiro lugar, as intervenções genéticas e farmacológicas antes e durante a formação do vaso são fáceis de realizar, como por meio da microinjeção de morfolino nucleótidos antisentido (MOs) no embrião em desenvolvimento ou através da aplicação do banho de fármacos 3 , 4 , 5 . A vantagem única de Xenopus sobre o peixe-zebra é que as manipulações embriológicas podem ser realizadas porque Xenopus segue clivagens holoblásticas estereotipadas eo mapa de destino embrionário é bem definido 6 . Por exemplo, é possível gerar um embrião em que apenas um lado lateral é geneticamente manipulado por injecção de um MO anti-sentido a uma célula no estádio de duas células. É também possível transplantar o primórdio cardíaco de um embrião para outro para determinar se o gene exerce a sua função por um mecanismo intrínseco ou -extrínseco da célulaAss = &quot;xref&quot;&gt; 7. Embora essas técnicas tenham sido desenvolvidas principalmente em Xenopus laevis , que é alotetraplóide e, portanto, não é ideal para estudos genéticos, elas podem ser aplicadas diretamente a Xenopus tropicalis , uma espécie diploide estreitamente relacionada 8 . Uma forma de visualizar a vasculatura num embrião vivo de Xenopus é injectar um corante fluorescente para marcar os vasos sanguíneos. A lipoproteína de baixa densidade acetilada (AcLDL) marcada com uma molécula fluorescente tal como DiI é uma sonda muito útil. Ao contrário da LDL não acetilada, a AcLDL não se liga ao receptor LDL 9, mas é endocitados por macrófagos e células endoteliais. A injecção de DiI-AcLDL no coração de um animal vivo resulta na marcação fluorescente específica das células endoteliais, e toda a vasculatura pode ser visualizada por microscopia de fluorescência em embriões vivos ou fixos 4 . Aqui, nós presProtocolos detalhados para a visualização e quantificação de vasos sanguíneos usando DiI-AcLDL em Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Fornecemos pontos-chave práticos, com exemplos de experiências bem sucedidas e mal sucedidas. Além disso, fornecemos um método direto para a análise quantitativa da complexidade vascular, que pode ser útil na avaliação dos efeitos de fatores genéticos e ambientais na formação da rede vascular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

Os vasos sanguíneos fornecem oxigênio e nutrientes em todo o corpo, ea formação da rede vascular está sob controle de desenvolvimento apertado. A eficiente visualização in vivo dos vasos sanguíneos e a quantificação fiável da sua complexidade são fundamentais para a compreensão da biologia e da doença da rede vascular. Aqui, nós fornecemos um método detalhado para visualizar vasos sanguíneos com um corante fluorescente comercialmente disponível, complexo DiI de lipoproteína de baixa densidade acetilada no plasma humano (DiI-AcLDL) e para quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser marcados por uma simples injeção de DiI-AcLDL no coração batendo de um embrião, e os vasos sanguíneos em todo o embrião podem ser visualizados em embriões vivos ou fixos. Combinado com a perturbaï¿½o genï¿½ica pela microinjecï¿½o direccionada de ï¿½idos nucleicos e / ou a aplicaï¿½o em banho de reagentes farmacolï¿½icos, as funï¿½es de um gene ou de uma via de sinalizaï¿½o no desenvolvimento vascular podem ser inveStigated dentro de uma semana sem recorrer a sofisticados animais geneticamente modificados. Devido ao sistema venoso bem definido de Xenopus e sua angiogênese estereotipada, o surgimento de vasos pré-existentes, complexidade vascular pode ser quantificado eficientemente após experimentos de perturbação. Este protocolo relativamente simples deve servir como uma ferramenta facilmente acessível em diversos campos da investigação cardiovascular.

Cronologia dos experimentos (Figuras 1 e 2) Logo após a fecundação, a microinjecção direccionada pode ser realizada para modular a expressão do gene. Por exemplo, um MO anti-sentido que se liga especificamente ao codão de iniciação do ARNm de Tie2 endógeno pode ser injectado, inibindo a tradução do mRNA alvo de Tie2 por impedimento estérico. Um MO pode ser conjugado com fluoresceína para o rastreio visual fácil de ...

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Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

visualization-quantitative-analysis-embryonic-angiogenesis-xenopus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

8.4K visualizações.  Yonsei University College of Medicine.  Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo . 

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Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação em<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Pesquisa do câncer

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologia

Utilizando larvas de peixe-zebra para estudos eficientes de tumores in vivo

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autor em destaque: Avançando na terapêutica do câncer usando xenotransplante tumoral em peixe-zebra

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária

Resumo

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Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado

Utilizando Análise de confocal

Stem Cell-like

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

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