Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Bu araştırmanın deneysel kısmı ABD-İsrail Bi Ulusal Bilim Vakfı (BM ve IL&#39;ye), İsrail Bilim Vakfı (ISF), Deutsch-İsrail Projeksiyon İşlemi (DIP) (BM&#39;ye) ve Biyoteknoloji Ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC Hibe Numaraları: BB / M007006 / 1 ve BB / D007585 / 1) RCH&#39;ye

<ol>
	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li><li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo.">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li><li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li><li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors.">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li><li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein,+phospholipase+C,+and+diacylglycerol+kinase.">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li><li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tüm hücre kayıtlarının D. melanogaster fotoreseptörlerine uygulanması TRP kanalları 27 , 28 , 29 ve INAD 30 , 31 , 32 iskele proteini gibi yeni sinyal proteinlerinin keşfedilmesine ve işlevsel aydınlatılmasına izin verdi. Bu tekniğin ilk tanıtımından bu yana, ışık tepkisinin iyonik mekanizması ve voltaja bağımlılığı ile ilgili uzun vadeli temel soruları çözdü. Bu, zar voltajını ve hücre dışı ve hücre içi iyonik kompozisyonu 19 , 28 doğru bir şekilde kontrol etme konusundaki yeteneği nedeniyle meydana geldi. D. melanogaster&#39;deki yama sıkıştırma tekniğinin büyük bir engeli izole ommatidia prepa&#39;nın kırılganlığı olmuşturrasyon. Ayrıntılı çalışmalar, phototransduction makinelerinin bütünlüğünün, özellikle ATP&#39;nin büyük bir tüketimine yol açan, ışık maruziyeti sırasında, ATP&#39;nin kesintisiz beslenmesine eleştirel olarak bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Ne yazık ki, yama pipeti ile fotoreseptör zarına ulaşmak için gerekli olan pigment ( yani glia) hücrelerinin mekanik olarak çizilmesi, ATP üretimi için gerekli metabolitlerin ana kaynağını ortadan kaldırmaktadır 33 . Harici ATP&#39;nin kayıt pipetine uygulanması, büyük oranda ATP gereksinimini kısmen yerine getirmektedir. Kısa bir ATP kaynağı, TRP kanallarının kendiliğinden aktivasyonuna ve ışık aktive kanallardan fototransdüksiyon mekanizmalarının ayrışmasına yol açar, bu da hücresel Ca2 + &#39; da büyük bir artışa ve normal tepkinin 34 , 35&#39;e ortadan kalkmasına neden olur. Bu olaylar dizisi,Fotoreseptörlere, aksine de ATP&#39;nin hücresel tükenmesine yol açar. Bu olayların meydana gelmesini önlemek ve normal ışık tepkileri sağlamak için, fotoreseptörler, yoğun ATP ışıklarını tüketen yoğun ışıklara maruz bırakılmamalıdır. Ayrıca, muhtemelen mitokondriyumda ATP üretimini kolaylaştırmak için NAD, kayıt pipetine dahil edilmelidir 18 , 36 . Spontan ve kuantum tümseklerin ölçümleri için yukarıdaki zorluk minimumdur, çünkü yalnızca loş ışıklar kullanılır. Uygulamada, kararlı bir tam hücreli kayıt ~ 20-25 dakika süreyle muhafaza edilebilir, ancak tepki kinetiği bu süre zarfında yavaşlama eğilimi gösterir. Ayrışmış ommatidia&#39;nın tek bir preparatı 2 saate kadar kullanılabilir kalabilir. İzole edilen ommatidia preparasyonunun ek bir eksikliği, mikropların erişilememesidir ve bu da TRP&#39;ye erişilememesine veTRPL kanallarını kayıt pipetine koyarak tek kanallı kayıtları engeller. Geliştirdikleri bir yöntemle Bacigalupo ve meslektaşları, doğrudan rhabdomere 37&#39;den tek kanallı etkinlik kaydetmeyi başardı. Bununla birlikte, bu kanal aktivitesi, doku kültürü hücrelerinde heterolog olarak ifade edilen TRPL kanallanndan ve izole ommatididen elde edilen atımlı ses analizinden türetilen TRP kanal aktivitesinden farklıdır 34 . Muhtemelen disseksiyon prosedürü bu yöntemi kullanırken fotoreseptör hücrelerine büyük zarar vermiştir.

100 yıldan fazla bir süre önce başlatılan Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) meyve sineği genetik çalışmaları, karmaşık biyolojik süreçlerin genetik diseksiyonu için son derece faydalı bir deney modeli olarak D. melanogaster sinekini kurdu. Aşağıda açıklanan metodoloji, D. melanogaster moleküler genetiğin birikmiş gücünü, tüm hücre yaması tutam kayıtlarının yüksek sinyal-gürültü oranı ile birleştirmektedir. Bu kombinasyon hem doğal ortamda hem de tekli moleküllerin en yüksek çözünürlüğünde inositol-lipit sinyallemesi ve TRP kanal düzenleme ve aktivasyonunun bir modeli olarak D. melanogaster fototransdüksiyonunun incelenmesine olanak tanır. Tüm hücre kayıt yönteminin D. melanogaster fotoreseptörlerine uygulanması, omurgasız fototransdüksiyon çalışmalarında devrim yarattı. Bu yöntem Hardie 1 ve bağımsız olarak geliştirilmiştir.Sonsuza dek Ranganathan ve meslektaşları tarafından 2 ila 26 yıl önce ve D. melanogaster&#39;ın geniş genetik manipülasyon araçlarından istifade etmek ve bunları fototransdüksiyon ve inositol-lipid sinyalizasyon mekanizmalarını ortaya çıkarmak için kullanmak üzere tasarlandı. İlk başta, bu teknik, detaylı niceliksel çalışmaları engelleyen, diseksiyon işlemi sırasında ışık hassasiyetinde hızlı bir düşüş ve ommatidia düşük bir hasar gördü. Daha sonra, yama pipetine ATP ve NAD ilavesi, preparatın uzun süreli niceliksel kayıtlar için uygunluğunu önemli ölçüde artırdı. Bundan sonra, moleküler düzeyde sinyal iletim mekanizmasının kapsamlı karakterizasyonu gerçekleştirildi. Halen, D. melanogaster fototransdüksiyonu, fosfoinositid sinyali ve TRP kanallarının tek molekül çözünürlüğünde ex vivo incelenebildiği az sayıdaki sistemden biridir. Bu, D. melanogasterin fototransdüksiyonunu yapar ve benBu mekanizmayı oldukça hassas bir model sistem olarak incelemek için geliştirilen trodoloji. Bu protokol, D. melanogaster retinanın ayrıştırılacağını ve çevredeki pigment (glia) hücrelerinden izole edilmiş ommatidiyi mekanik olarak soyduğunu açıklamaktadır. Bu, fotoreseptör hücre gövdeleri üzerinde bir giga sızdırmazlık elemanı ve bir tam hücre yama kelepçesi oluşumunu mümkün kılar. Neyse ki, en sinyal veren proteinler rabdomere ile sınırlıdır ve yayılmaz. İlaveten, sinyal bölmesi ile hücre gövdesi 3 , 4 arasında bulunan kalphotin adı verilen hareketsiz bir Ca 2+ tamponu ve mikrovillide Na + / Ca 2+ eşanjörünün (CalX) yüksek ekspresyon seviyesi vardır 5 . Birlikte, rhabdomere&#39;ye protein salıverme, calphotin tamponu ve CalX&#39;in yüksek ekspresyonu, gerekli bileşenlerin kaybı olmadan nispeten uzatılmış (yaklaşık ~ 20 dk&#39;ya kadar) tüm hücre kayıtlarına olanak tanırVe ışığa karşı yüksek duyarlılığı korurken. Aşağıdaki protokol izole ommatidia&#39;yı nasıl elde edeceğinizi ve fototranskülasyon kaskadının yerli özelliklerini koruyan tüm hücre kayıtlarını nasıl yapacağınızı açıklamaktadır. Ayrılmış hamam böceği ( Periplaneta americana ) 6 ve kriket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia üzerinde D-melanogaster için tarif edilene benzer şekilde tam hücre yama kelepçe deneyleri yapıldı . Ek olarak, file clam ( Lima scabra ) ve tarak ( Pecten irradians ) ayrıştırılmış fotoreseptörleri üzerindeki patch clamp deneyleri D. melanogaster üzerinde gerçekleştirilenlerden biraz daha farklı bir şekilde gerçekleştirildi , hem tüm hücre 8 hem de tek kanallı ölçümler yapıldı 9 . Burada, D. melanogaster&#39;te bu tekniği kullanarak elde edilen başlıca başarılar anlatılmaktadır. Tartışma iBu tekniğin bazı tuzakları ve kısıtlamaları tanımını içermez.

<table><tbody><tr><td>10 mL syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe with elongated tip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &amp;micro;m PVDF filter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Capillaries (for omatidia separation)</td><td></td><td></td><td>Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2 small beakers</td><td></td><td></td><td>50 mL or less</td></tr><tr><td>2 paraffin film sheets</td><td>Parafilm M</td><td></td><td>~5 x 5 cm</td></tr><tr><td>Bath chamber</td><td>home-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td></td><td></td><td>22 x 22 mm No. 0</td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma</td><td>Paraffin &amp;ndash; polyisobutylene mixture</td><td>To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td></tr><tr><td>Ground</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-1288</td><td>Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td></tr><tr><td>Headless micro dissection needle</td><td></td><td></td><td>Entomology, 12 mm</td></tr><tr><td>Micro dissecting needle holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vise</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td><td></td><td>Dumont #5, Biology&amp;nbsp;</td><td>0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td></tr><tr><td>Stereoscopic zoom Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>Cold light source</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter (Color) for cold light source</td><td>Schott</td><td>RG620</td><td></td></tr><tr><td>Delicate wipers</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-T10P</td><td>Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP 85</td><td>Huxley-Wall Style Micromanipulator</td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>home made</td><td></td><td>Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td></tr><tr><td>Anti-vibration Table</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Osilloscope</td><td>GW</td><td>GOS-622G</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-8P</td><td>Pinch valve control system</td></tr><tr><td>Perfusion valve controller</td><td>Scientific instruments</td><td>BPS-8</td><td></td></tr><tr><td>Suction system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Device</td><td>Axopatch-1D</td><td></td></tr><tr><td>Head-stage</td><td>Molecular Device</td><td>CV - 4</td><td>Gain: x 1/100</td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Device</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Device</td><td>10</td><td>software</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Molecular Device</td><td>10</td><td>software</td></tr><tr><td>Light source (Xenon Arc lamp)</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda LS</td><td></td></tr><tr><td>Light detector</td><td>home made</td><td></td><td>phototransistor</td></tr><tr><td>Filter wheel and shutter controller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td><td></td></tr><tr><td>Filters (Natural density filter)</td><td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td></td></tr><tr><td>Filter (Color)</td><td>Schott</td><td>OG590, Edge filter</td><td></td></tr><tr><td>Xenon Flash Lamp system</td><td>Dr. Rapp OptoElecftronic</td><td>JML-C2</td><td></td></tr><tr><td>Light guide</td><td></td><td></td><td>Quartz&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pulse generator</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71, Inverted</td><td></td></tr><tr><td>Red illumination filter (Microscope)</td><td></td><td></td><td>RG630 / RG645 &amp;oslash;45mm</td></tr><tr><td>Microscope objective</td><td>Olympus</td><td>X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon DU885K</td><td></td></tr><tr><td>NIS Element&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td>software</td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; indicator</td><td>Invitrogen</td><td>Calcium green 5N</td><td></td></tr><tr><td>Excitation &amp;amp; emission filters and dichroic mirror</td><td>Chroma</td><td>19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td><td></td></tr><tr><td>Vertical pipette puller</td><td>Narishige&amp;nbsp;</td><td>Model PP83</td><td>Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td></td></tr><tr><td>Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>3 mm trough or square box</td></tr><tr><td>Capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>borosilicate glass capillaries</td><td>1 x 0.58 mm</td></tr></tbody></table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Drosophila melanogaster fotoreseptörlerinden alınan tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtları, inositol-lipid sinyal verme ve Geçici Alıcı Potansiyel (TRP) kanallarını tek molekül seviyesinde incelemek için D. melanogaster moleküler genetiğin kullanılmasını sağlayan omurgasız görsel transdüksiyon alanını devrim yarattı. Bir avuç laboratuvar, yüksek kontrollü koşullardaki ışığa fizyolojik cevapların analizini sağlayan bu güçlü tekniği hakimiyet altına almıştır. Bu teknik, hücre içi ve hücre dışı ortamları kontrol etmeye izin verir; Membran voltajı; Ve çeşitli iyonik veya pH indikatörleri gibi farmakolojik bileşiklerin intra-ve hücre dışı medyaya hızlı uygulanması. Son derece yüksek bir sinyal-gürültü oranı ile bu yöntem, karanlık kendiliğinden ışığa neden olan üniter akımları ( örn. Spontan ve kuantum darbe) ve makroskopik Işık Tarafından Akıtan Akımları (LIC)Gle D. melanogaster fotoreseptörler. Bu protokol, hem elektrofizyolojik hem de optik kayıtları içeren bu tekniği gerçekleştirmek için gerekli olan tüm önemli adımları ayrıntılı bir şekilde özetlemektedir. Hamam odasında sağlam ve uygulanabilir ex vivo izole ommatidia elde etmek için sinek retina diseksiyon prosedürü anlatılmıştır. Tüm hücre ve floresan görüntüleme ölçümlerini gerçekleştirmek için gerekli ekipman da detaylandırılmıştır. Son olarak, uzun deneyler sırasında bu hassas preparatın kullanımındaki tuzaklar açıklanmaktadır.

Tanımlanan yöntem, spontan ve ışığa uyarılmış kuantum darbeleri üreten temel birim akımların doğru kayıt edilmesini sağladı ve bu kuantum darbe, makroskopik yanıtı tanımlanmış koşullar altında ışığa dönüştürmek için toplandı. Ayrıca, kritik sinyal moleküllerinde kusur bulunan vahşi tip ve mutant sinekler arasındaki karşılaştırmaya izin verildi ( Şekil 3 ve 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Buna ek olarak, bi-iyonik koşullar altında geri dönüşüm potansiyelini ölçme kabiliyeti, TRP ve TRP benzeri (TRPL) kanalların temel biyofiziksel özelliklerini ortaya çıkardı 18,19. Aynı zamanda, TRP&#39;nin gözenek alanındaki amino asit substitüsyonlarının etkilerini, Ca2 +Geçirgenlik 20 . Yama klemp tam hücreli kayıtlarla elde edilen ışık tepkisi, ışık yoğunluğunda doğrusal olarak en az 4 derece büyüklüğüne bağlıdır. Bu, ERG ve hücreiçi kayıt yöntemleri kullanılarak çözülemedi. Buna göre, artan şiddetin kısa süreli yanıp sönmesi ve yoğunluk tepki fonksiyonunun bir çizimi üzerine bir dizi yanıt, artan ışık şiddeti ile yanıp sönme tepkisinin katı bir doğrusallığını ortaya çıkardı. Sıkı doğrusallık en az yüz pA kadar tutar, ancak bundan sonra lineerlik mi yoksa kısmi kıvrılma kontrolü olup olmadığı tartışmalıdır ( Şekil 6 ). Bu sonuçlar, ışığa karşı makroskopik yanıtların, ışığa verilen üniter tepkilerin doğrusal bir toplamı olduğunu göstermektedir ( yani, kuantum darbeleri). Işık uyarı ışığını dim eden voltaj kayıtları kullanılarak iyi kurulmuştur.Birçok omurgasız türde ayrı voltaj dalgalanmaları ( yani kuantum darbeleri). D. melanogaster kuantum tümsekleri, ~ 15 TRP kanallarının ve ~ 2 TRPL kanallarının çarpma zirvesinin 18 en üstünde uyumlu bir şekilde açılmasından kaynaklanır. Her darbe, tek bir fotonun emilmesi ile üretilirken, daha yoğun ışıklara makroskopik tepki, bu temel tepkiler 14 , 21&#39;in toplamıdır. Uyarıcı koşulları aynı olsa bile, darbeler, gecikme, zaman yönü ve genlikte önemli ölçüde değişir. Damga üretimi, her etkili emilen fotonun sadece bir yumru oluşturduğu Poisson istatistiği tarafından tanımlanan stokastik bir süreçtir. Tekli foton-tekli-yumru ilişkisi, kademeli kademedeki her adımın sadece etkili bir &quot;açma&quot; mekanizmasını değil aynı zamanda etkili bir &quot;kapatma&quot; mekanizmasını içermesini gerektirir. Fonksiyonel avantajı, birGörsel sistemin gerektirdiği zamansal çözünürlük ve hassaslık için çok hızlı bir geçici tepki veren çok hassas foton sayacı. Aktif bir kapatma mekanizması için gereklilik, aktif fotopigment ( yani metarodopezin, M) veya hedefi G q α&#39;nın etkisiz hale getirilmesinde başarısız olması ve ışık kesildikten sonra uzun süre buruşukluk üretimine neden olması durumunda ortaya çıkar. 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Darbe TRP / TRPL kanallarının bir mikrovillus içindeki kooperatif faaliyetini temsil eder. Bu nedenle, kanal aktivasyonunun herhangi bir hipotezi kooperatif kanal aktivasyonunu da açıklamak zorundadır. Son zamanlarda, Hardie ve meslektaşları fotoreptörlerin hızlı kasılmalarını uyandırdığını göstermişler ve ışık hassasiyetininE kanalları (TRP / TRPL) mekanik olarak kaplanabilir 25 . Bu mekanik aktivasyon, PLC aracılı PIP 2 hidrolizi ile açığa çıkan gözlenen protonlarla birlikte TRP / TRPL kanallarının açılmasını teşvik eder ve yumru üretiminin kooperatif doğasını açıklar 26 . Şu anda, D. melanogaster fotoreseptörleri fosfoinositid sinyali ve TRP kanallarının in vivo incelenebildiği az sayıdaki sistemden biridir ve böylece D. melanogaster fototransdüksiyonu yapmaktadır ve bu mekanizmayı oldukça değerli bir model sistem olarak incelemek için geliştirilen metodoloji. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> Şekil 3: inaC P209 ve inaD P215 Mutantları, Işık ve Tekli Kuantum Tümsekleri için Makroskopik Yanıtın Yavaş Yanıt Vermesinin Sona Ermesi&#39;ni Ortaya Çıkarmaktadır. ( A ) İzole edilmiş ommatidyum prepaFloresan Lucifer Yellow CH boya (uyarma: 430 nm; emisyon: 540 nm) ile doldurulmuş bir yama pipeti ile rasyon, bütün hücre kayıt sırasında sunulmuştur. Floresan boya, tek bir fotoreseptör hücre gövdesine yayılmış ve etiketlenmiştir ve fotoreseptör hücre gövdeleri, uzatılmış aksonlarından ayrılır, ancak canlı kalırlar. Bu preparat aynı anda tüm hücre kayıtları ve görüntüleme deneyleri için uygundur. ( BD ) Üst paneller: WT, inaC P209 ve inaD P215 mutant sineklerinde sürekli loş ışığa (açık çubuk) tam hücreli voltaj sıkıştırmalı kuantum darbe tepkileri. InaC P209 ve inaD P215 mutantlarında WT sineklerine göre darbelerin yavaş yavaş sonlandırılması gözlemlenir. Aşağıdaki ilaveler, tek dirseklerin büyütülmüş şeklini görüntüler. Alt paneller: Yukarıdaki vahşi türün 500-ms&#39;lik bir ışık darbesine (1.5 x 105 foton / s) normalleştirilmiş tam hücreli makroskopik tepkiler<html> Ve mutant sinekler. (EG) Üst paneller: Vahşi tip, arr2 3 ve ninaC P235 mutant sineklerde tek foton yanıtları ortaya çıkaran kısa (1 ms), loş ışıkta tam hücreli voltaj sıkıştırmalı kuantum çarpma tepkileri. Arr2 3 ve ninaC P235 mutantlarında gözlemlenen darbenin trenini tek bir foton emilimine tepki olarak not edin. Alt paneller: Karşılık gelen mutantlarda 500 ms ışık pulsuna (1.5 x 104 foton / s) tam hücreli voltaj sıkıştırmalı normalleştirilmiş tepkiler. Arr2&#39;de gözlenen makroskopik tepkilerin yavaş sonlandırılmasına dikkat edin 3 Ve ninaC P235 mutant WT&#39;ye göre uçar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4: Sinyal ile indüklenen Ca 2+ Akışı Takip Eden Hücresel Ca 2+ Dinamiği, Calphotin&#39;den etkilenir. Işık uyarımı sırasında Ca 2+ göstergesinin flüoresansını gösteren vahşi tipli ve Cpn % 1&#39;lik fotoreptör görüntülerin bir zaman dizisi. Ham yoğunluk görüntüleri sahte renk kodlaması kullanılarak çizilir (çubuk = 10 μm; ok uçları pipete işaret eder). Şekil, Weiss ve diğerlerinin izniyle tekrar basıldı . 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> Şekil 5: WT, trp ve trpl Mutantlarının Elektrofizyolojik Özellikleri. ( A ) Tam Hücreli voltaj kelepçesi recoWT, trpl 302 ve trp P343 boş mutant sineklerde sürekli loş ışığa (açık çubuk) yanıt olarak kuantum darbe sayısı. Trp P34 3 darbelerinin oldukça azaltılmış amplitütleri gözlemlenir. Inset: Yabanıl tip ve trp P343 boş mutant sineklerin büyütülmüş tek kuantum darbeleri gösterilmiştir . ( B ) Yabani tipin ve ilgili mutantların 3 saniyelik ışık darbesine yanıt olarak tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtları. Trp P343 mutantının geçici kararlı durum yanıtı gözlemlenir . Başlangıç: WT ve trp P343 mutantlarının büyütülmüş ışık yanıtları gösterilmiştir. ( C ) Yukarıdaki sinek suşlarının ışıkla indüklenen akıntılarının bir ailesi, ters potansiyel (E devir ) etrafında ölçülen 3 mV&#39;luk voltaj adımlarında 20 ms&#39;lik bir ışık darbesine yanıt olarak ortaya çıkmıştır. ( D ) Vahşi türün ve çeşitli mutanların ortalama E rev&#39;sini gösteren bir histogramts. Hata çubukları SEM&#39;dir WT&#39;nin geri dönüş potansiyeli (E rev ), yalnızca TRP&#39;yi ifade eden trpl 302&#39;nin pozitif E rev değeri ile yalnızca TRPL&#39;yi ifade eden trp P343 boş mutantın E rev&#39;idir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> Şekil 6: Işık Yoğunluğu Artan Işık Tepkisi Kesinlikle Doğrusaltır. Artan ışık yoğunluğunun kısa süreli yanıp sönmeye karşı bir dizi güncel yanıt ve kısa yanıp sönen ışık yoğunluğuna ışık tepkisinin tepe amplitüdünün bağımlılığının bir çizimi. Bu ilişki, flaş tepkisi ile artan ışık yoğunluğu arasında katı bir doğrusallık ortaya koymaktadır. Bu katı doğrusallıkDoğrusallık mı yoksa sonradan kırılan kelepçe kontrolü olup olmadığı tartışılabilir iken, ışık şiddeti 4 dereceden fazla alanla en az yüz pA kadar tutmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (NaOH ile ayarlanır) </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Konsantrasyon (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Proline </td><td> 25 </td></tr><tr><td> alanin </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Not: Bu çözüm nominal olarak Ca 2+ içermez ancak Ca 2+ tamponları eklenmez ve dolayısıyla yaklaşık 5 - 10 μM iz Ca 2+ olacaktır. Ekstraselüler çözelti (ES) = 0.5 veya 1 M stok solüsyonundan CaCl2&#39;yi ES-0Ca 2+&#39; ye ekleyerek yapılan 1.5 mM CaCl2 ile ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Ca +2 içermeyen Ekstrasellüler Solüsyon (ES). Kimyasal tanımlama ve Ca +2 içermeyen ES üretmek için gereken spesifik miktarlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> Tutar </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 mL </td></tr><tr><td> sakaroz </td><td> 1.5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> 1.5 mL&#39;lik şişelerde 150 uL&#39;lik alikotlara bölün ve -20 ° C&#39;de saklayın 76 ° C. </td></tr><tr><td> Toz haline getirme çözeltisi (TS) </td><td> Diseksiyon sırasında kullanılan çözeltiyle eşleşecek şekilde, stok solüsyonunun 150 mL&#39;sinin 1 şişesini 1.350 mL ES veya ES-0Ca 2+ ile doldurun. </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Fetal Sığır Serumu (FBS) + Sakroz - Stok Çözeltisi. Kimyasal tanımlama ve fetüs sığırı serumu (FBS) + sakaroz stok solüsyonu üretmek için gereken spesifik miktarlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (KOH ile ayarlayın) </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Konsantrasyon (mM) </td></tr><tr><td> Potasyum glukonat (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnezyum tuzu (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP sodyum tuzu (Na2GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamid adenin dinükleotid hidrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Hücre içi çözelti (IS1). Kimyasal tanımlama ve çoğunlukla yoğunluk yanıtı ve kuantum darbe ölçümleri için kullanılan IS1 üretmek için gereken spesifik miktarlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (CsOH ile ayarlanır) </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Konsantrasyon (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnezyum tuzu (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP sodyum tuzu (Na2GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamid adenin dinükleotid hidrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tetra-etil-amonyum klorür (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Hücre içi çözelti (IS2). Kimyasal tanımlama ve çoğunlukla ışık kaynaklı akımın ters potansiyel ölçümleri için kullanılan Hücre içi Çözüm IS2&#39;yi üretmek için gereken spesifik miktarlar.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

electrophysiological-method-for-whole-cell-voltage-clamp-recordings

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

14.9K Görüntüleme.  Hebrew University.  Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar. 

Video: Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Yetişkin Drosophila Beyin Tüm Hücre Kayıtlar

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

Biyoloji

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

Dev Fiber Pathway Elektrofizyolojik Kayıtlar D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Nörobilim

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

Source: Juusola, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54142">Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

Drosophila Retinal Fotoreseptörlerinin Işık Uyaranlarına Voltaj Yanıtlarının Elektrofizyolojik Kaydı

1. Recording from R1-R6 Photoreceptors 

	Always be grounded when operating the microelectrode amplifier (for example by touching the metal surface of the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Investigating Prolonged Depolarizing Afterpotential (PDA) in Drosophila Photoreceptors

Source: Gutorov, R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63514">Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an experimental protocol to investigate the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) in white-eyed Drosophila. The fly&#39;s eye is exposed to intense blue light pulses to convert the photopigment rhodopsin to metarhodopsin, initiating a signaling cascade that opens positive ion channels and causes membrane depolarization. Because blue light prevents the reconversion of metarhodopsin to rhodopsin, the continuous influx of positive ions results in sustained depolarization, known as the prolonged depolarizing afterpotential (PDA).

Drosophila Fotoreseptörlerinde Uzun Süreli Depolarizan Afterpotential (PDA) Araştırılması

1. Measuring the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) using the electroretinogram

	Suitable rearing conditions for Drosophila melanogaster ...

Stimulation and Modulation Techniques

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Source:&#160; Katz, B., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55627">Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates recording electrical activity in the photoreceptor neurons of Drosophila&#39;s ommatidium by establishing a whole-cell configuration. It highlights the activation of transient receptor potential channels by light pulses, resulting in measurable quantum bumps.

Drosophila Fotoreseptörlerinden Tüm Hücre Voltaj Kelepçesi Kayıtları

NOTE: During all of the following steps, use only dim red light illumination and ensure that the ommatidia&#39;s exposure to light is minimal (i.e., work ...

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler