이 연구의 실험적 부분은 미국 이스라엘 바이 사이언스 재단 (BM 및 IL), 이스라엘 과학 재단 (ISF), 독일 - 이스라엘 프로젝트 개발 (DIP) (BM으로), 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC 교부금 번호 : BB / M007006 / 1 및 BB / D007585 / 1)에서 RCH

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	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li><li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo.">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li><li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. 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G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

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D. melanogaster 광 수용체에 대한 전체 세포 기록의 응용은 TRP 채널 27 , 28 , 29 및 INAD 30 , 31 , 32 스캐 폴드 단백질과 같은 새로운 신호 전달 단백질의 발견 및 기능적 해명을 가능하게했다. 이 기법을 처음 도입 한 이래로 이온 반응 메커니즘에 대한 장기적인 기본 문제를 해결할 수있었습니다. 이것은 멤브레인 전압과 세포 및 세포 내 이온 조성물 19 , 28 을 정확하게 제어 할 수있는 능력이 부여 되었기 때문에 발생했습니다. D. melanogaster 에서의 패치 클램핑 기술의 주요 장애는 격리 된 개 구균 제거제의 취약성이다정액. 상세한 연구에 따르면 광전도 기계 장치의 무결성은 ATP의 지속적인 공급, 특히 빛에 노출되는 동안 ATP의 대량 소모로 이어지는 것이 중요합니다. 불행히도 패치 피펫으로 광 수용체 막에 도달하는 데 필요한 안료 ( 즉, glia) 세포의 기계적 스트라이핑은 ATP 생산에 필요한 주요 대사 물질을 제거합니다 33 . 기록 피펫으로의 외인성 ATP의 적용은 다량의 ATP에 대한 요건을 부분적으로 충족시킨다. ATP의 공급 부족은 TRP 채널의 자발적인 활성화와 빛 활성화 된 채널에서 광 전달 메커니즘의 해리로 연결되어 세포질 Ca 2+의 증가와 빛에 대한 정상적인 반응의 폐지를 초래한다. 이러한 일련의 사건은해부 절차에 의해 광 수용체가 아니라 오히려 ATP의 세포 고갈. 이러한 일련의 사건이 발생하지 않도록하고 정상적인 빛 반응을 유지하려면 광 수용체를 강렬한 빛에 노출 시켜서는 안되며 많은 양의 ATP를 섭취해야합니다. 또한, NAD는 기록 피펫에 포함되어야하며 아마도 미토콘드리아에서 ATP 생산을 촉진해야한다. 자발적 및 양자 범프의 측정을 위해서는 희미한 조명 만 사용되기 때문에 위의 어려움은 최소화됩니다. 실제적으로 안정된 전체 세포 기록은 ~ 20 ~ 25 분 동안 유지 될 수 있지만, 반응 속도론이이 기간 동안 느려지는 경향이있다. 해리 된 각화 증의 단일 제제는 최대 2 시간 동안 생존 할 수있다. 고립 된 개조 제제의 또 다른 단점은 TRP의 접근 불가능 성으로 해석되는 미생물의 접근 불가능 성이며,TRPL 채널을 녹음 피펫에 연결하여 단일 채널 녹음을 방지합니다. 그들이 개발 한 방법을 사용하여, Bacigalupo와 동료들은 횡문 면도 37 에서 단일 채널 활동을 직접 기록하는 데 성공했다. 그러나,이 채널 활성은 조직 배양 세포에서 이종적으로 발현 된 TRPL 채널의 것과는 다르며, 고립 된 개 구균 34 에서 얻은 샷 잡음 분석에서 파생 된 TRP 채널 활성과는 다릅니다. 아마도,이 방법을 사용할 때 해부 절차는 광 수용체 세포를 크게 손상 시켰습니다.

약 100 년 전에 시작된 초파리 Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) 에 대한 광범위한 유전 연구는 D. melanogaster fly를 복잡한 생물학적 과정의 유전 적 해부를위한 매우 유용한 실험 모델로 확립했다. 아래에서 설명하는 방법은 D. melanogaster 분자 유전학의 누적 된 출력과 전체 셀 패치 클램프 녹음의 높은 신호 대 잡음 비율을 결합합니다. 이 조합은 네이티브 환경과 단일 분자의 최고 해상도 모두에서 이노시톨 - 지질 시그널링 및 TRP 채널 조절 및 활성화의 모델로서 D. melanogaster 광 변환의 연구를 허용한다. D. melanogaster photoreceptors에 대한 전체 세포 기록 방법의 적용은 무척추 동물의 phototransduction에 대한 연구에 혁명을 일으켰습니다. 이 방법은 Hardie 1 과 indep가 개발했습니다.Ranganathan과 동료들에 의해 2 ~ 26 년 전에 끝내었고 , D. melanogaster 의 광범위한 유전자 조작 도구를 이용하고 phototransduction과 inositol-lipid signaling의 메커니즘을 밝히기 위해 사용되었다. 처음에는이 기술은 해부학 과정에서 빛 민감도가 급격히 감소하고 개복 수확량이 낮아 세부적인 정량 연구가 어려웠습니다. 나중에 패치 피펫에 ATP와 NAD를 첨가하면 장기간의 정량적 레코딩을위한 준비의 적합성이 크게 증가했습니다. 그 후, 분자 수준에서 신호 전달 메커니즘의 광범위한 특성이 실현되었다. 현재, D. melanogaster 광전 변환은 phosphoinositide 신호 및 TRP 채널이 단일 분자 분해능으로 생체 외에서 연구 될 수있는 몇 안되는 시스템 중 하나입니다. D. melanogaster 광전 변환과 저를 만듭니다 .thodology는이 메커니즘을 매우 민감한 모델 시스템으로 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 망막을 해부하고 주위 안료 (glia) 세포에서 분리 된 ommatidia를 기계적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 이것은 photoreceptor 세포 몸에 기가 씰과 전체 세포 패치 클램프의 형성을 가능하게합니다. 다행히 대부분의 신호 전달 단백질은 횡문근 막에만 국한되며 확산되지 않습니다. 또한 신호 구획과 세포 사이에는 칼포틴 (calciumphotin)이라고 불리는 움직일 수없는 칼슘 2+ 완충액이 있으며, 미포 질에서 Na + / Ca 2+ 교환기 (CalX)의 발현 수준이 높습니다. 함께 rhabdomere, calphotin 완충액 및 CalX의 높은 발현에 단백질 감금은 필수 구성 요소의 손실없이 상대적으로 연장 된 ( 즉 ~ 20 분까지) 전체 세포 녹음을 허용합니다빛에 대한 높은 감도를 유지하면서 광전도 공정의 다음 프로토콜은 고립 된 눈꺼풀 아래를 얻는 방법과 광 변환 캐스케이드의 고유 특성을 보존하는 것처럼 보이는 전체 세포 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 된 바퀴벌레 ( Periplaneta americana ) 6 및 크리켓 ( Gryllus bimaculatus ) 7 외피에 대한 전체 세포 패치 클램프 실험은 D. melanogaster 에 대해 기술 된 것과 유사하게 수행 되었다. 또한 파일 클램프 ( 리마 scabra )와 가리비 ( Pecten의 irradians )의 dissociated photoreceptors에 대한 패치 클램프 실험은 전체 셀 8 및 단일 채널 측정을 허용 디 melanogaster 에 실시와 약간 다른 방식으로 수행되었다 9 . 여기,이 기술을 사용하여 디 melanogaster 에서 얻은 주요 업적이 설명되어 있습니다. 토론 나는이 기법의 몇 가지 함정과 한계에 대한 설명은 없습니다.

<table><tbody><tr><td>10 mL syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe with elongated tip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &amp;micro;m PVDF filter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Capillaries (for omatidia separation)</td><td></td><td></td><td>Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2 small beakers</td><td></td><td></td><td>50 mL or less</td></tr><tr><td>2 paraffin film sheets</td><td>Parafilm M</td><td></td><td>~5 x 5 cm</td></tr><tr><td>Bath chamber</td><td>home-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td></td><td></td><td>22 x 22 mm No. 0</td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma</td><td>Paraffin &amp;ndash; polyisobutylene mixture</td><td>To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td></tr><tr><td>Ground</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-1288</td><td>Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td></tr><tr><td>Headless micro dissection needle</td><td></td><td></td><td>Entomology, 12 mm</td></tr><tr><td>Micro dissecting needle holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vise</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td><td></td><td>Dumont #5, Biology&amp;nbsp;</td><td>0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td></tr><tr><td>Stereoscopic zoom Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>Cold light source</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter (Color) for cold light source</td><td>Schott</td><td>RG620</td><td></td></tr><tr><td>Delicate wipers</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-T10P</td><td>Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP 85</td><td>Huxley-Wall Style Micromanipulator</td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>home made</td><td></td><td>Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td></tr><tr><td>Anti-vibration Table</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Osilloscope</td><td>GW</td><td>GOS-622G</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-8P</td><td>Pinch valve control system</td></tr><tr><td>Perfusion valve controller</td><td>Scientific instruments</td><td>BPS-8</td><td></td></tr><tr><td>Suction system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Device</td><td>Axopatch-1D</td><td></td></tr><tr><td>Head-stage</td><td>Molecular Device</td><td>CV - 4</td><td>Gain: x 1/100</td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Device</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Device</td><td>10</td><td>software</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Molecular Device</td><td>10</td><td>software</td></tr><tr><td>Light source (Xenon Arc lamp)</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda LS</td><td></td></tr><tr><td>Light detector</td><td>home made</td><td></td><td>phototransistor</td></tr><tr><td>Filter wheel and shutter controller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td><td></td></tr><tr><td>Filters (Natural density filter)</td><td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td></td></tr><tr><td>Filter (Color)</td><td>Schott</td><td>OG590, Edge filter</td><td></td></tr><tr><td>Xenon Flash Lamp system</td><td>Dr. Rapp OptoElecftronic</td><td>JML-C2</td><td></td></tr><tr><td>Light guide</td><td></td><td></td><td>Quartz&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pulse generator</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71, Inverted</td><td></td></tr><tr><td>Red illumination filter (Microscope)</td><td></td><td></td><td>RG630 / RG645 &amp;oslash;45mm</td></tr><tr><td>Microscope objective</td><td>Olympus</td><td>X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon DU885K</td><td></td></tr><tr><td>NIS Element&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td>software</td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; indicator</td><td>Invitrogen</td><td>Calcium green 5N</td><td></td></tr><tr><td>Excitation &amp;amp; emission filters and dichroic mirror</td><td>Chroma</td><td>19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td><td></td></tr><tr><td>Vertical pipette puller</td><td>Narishige&amp;nbsp;</td><td>Model PP83</td><td>Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td></td></tr><tr><td>Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>3 mm trough or square box</td></tr><tr><td>Capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>borosilicate glass capillaries</td><td>1 x 0.58 mm</td></tr></tbody></table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Drosophila melanogaster 광 수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록은 단일 분자 수준에서 이노시톨 - 지질 신호 및 과도 수용 수용체 (Transient Receptor Potential, TRP) 채널을 연구하기 위해 D. melanogaster 분자 유전학의 사용을 가능하게하는 무척추 동물 영상 전달 분야를 혁신했습니다. 소수의 연구실에서는이 강력한 기법을 익혔으며 고도로 제어 된 조건에서 빛에 대한 생리적 반응을 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 내 및 세포 외 매체를 제어 할 수 있습니다. 막 전압; 및 다양한 이온 성 또는 pH 지시약과 같은 약리학 적 화합물의 세포 내 및 세포 외 매체로의 신속한 적용을 포함한다. 예외적으로 높은 신호 대 잡음비로,이 방법은 어두운 자발적 및 광 유도 단일 전류 (자발적 및 양자 범프)와 거시적 인 빛 유도 전류 (LIC)를 죄로부터 측정 할 수 있습니다gle D. melanogaster 광 수용체. 이 프로토콜은 전기 생리 학적 및 광학적 기록을 모두 포함하는이 기술을 수행하는 데 필요한 모든 주요 단계를 아주 자세하게 설명합니다. 목욕실에서 손상되지 않고 생존 가능한 생체 외 고립성 구강 내막염 제거를위한 파리 망막 해부 절제술이 기술되었다. 전체 셀 및 형광 이미징 측정을 수행하는 데 필요한 장비도 자세히 설명합니다. 마지막으로, 확장 된 실험 동안이 섬세한 준비를 사용함에있어서 함정이 설명됩니다.

기술 된 방법은 정의 된 조건 하에서 빛에 대한 거시적 인 응답을 생성하기 위해 합계하는 자발적이고 광 유발 된 양자 범프를 생성하는 기본 단위 전류의 정확한 기록을 가능하게했다. 그것은 또한 중요한 신호 분자 ( 그림 3 과 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18에 결함이있는 야생형과 돌연변이 파리 사이의 비교를 허용했습니다. 또한, bi-ionic 조건 하에서 reversal potential을 측정하는 능력은 TRP와 TRP-like (TRPL) 채널의 기본적인 생물 물리적 특성을 밝혀냈다. 그것은 또한 Ca 2+ 를 변형시킨 TRP의 세공 영역에서 아미노산 치환 효과를 측정 할 수있게 해 주었다투자율 20 . 패치 클램프 전체 셀 기록에 의해 얻어진 빛 응답은 적어도 4 차수의 광 강도에 선형 적으로 의존합니다. 이것은 ERG 및 세포 내 기록 방법을 사용하여 해결할 수 없습니다. 따라서, 증가하는 강도의 간단한 섬광에 대한 일련의 반응 및 강도 반응 함수의 플롯은 광 세기가 증가함에 따라 플래시 응답의 엄격한 선형성을 나타내었다. 엄격한 선형성은 적어도 수백 pA까지 유지되지만, 이후에는 선형성 또는 고장을 일으키는 클램프 제어인지 여부는 논쟁의 여지가 있습니다 ( 그림 6 ). 이러한 결과는 빛에 대한 거시적 인 반응이 빛에 대한 단일 응답 ( 즉, 양자 범프)의 선형 합계임을 시사한다. 그것은 빛 자극 ind를 어둡게하는 전압 기록을 사용하여 잘 확립되어왔다.대부분의 무척추 동물에서 개별적인 전압 변동 ( 즉, 양자 범프)이 발생합니다. D. melanogaster 양자 범프는 범프 18 의 피크에서 ~ 15 TRP 채널과 ~ 2 TRPL 채널의 공동 개통으로 인해 발생합니다. 각각의 범프는 단일 광자의 흡수에 의해 생성되는 반면,보다 강렬한 빛에 대한 거시적 인 반응은 이들 기본 응답의 합계 14 , 21 이다. 범프는 자극 조건이 동일한 경우에도 대기 시간, 시간 경과 및 진폭이 크게 다릅니다. 범프 발생은 포아송 (Poisson) 통계에 의해 기술 된 확률 과정 ​​(stochastic process)으로, 효과적으로 흡수 된 각각의 광자는 단지 하나의 범프만을 유도한다. 단일 - 광자 - 단일 범프 관계는 캐스케이드의 각 단계가 효율적인 &quot;턴온&quot;메커니즘뿐만 아니라 똑같이 효과적인 &quot;턴 오프&quot;메커니즘을 포함 할 것을 요구합니다. 기능적 이점은매우 민감한 광자 카운터는 시각적 시스템에 필요한 감도와 시간 해상도에 매우 적합한 빠른 과도 응답을 제공합니다. 능동적 인 photopigment ( 즉, metarhodopsin, M) 또는 그것의 타겟 인 G q α가 불 활성화되지 않고 빛이 꺼진 후에도 계속적으로 범프가 생성 될 때 효율적인 턴 오프 메커니즘에 대한 요구 사항이 드러난다. 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . 범프는 미세 융모에서 TRP / TRPL 채널의 협력 활동을 나타냅니다. 이와 같이, 채널 활성화의 임의의 가설은 협력 채널 활성화를 또한 설명해야한다. 최근 하디 (Hardie)와 동료들은 빛이 광 수용체의 빠른 수축을 불러 일으킨다는 것을 보여 주었는데, 이는 감광제e 채널 (TRP / TRPL)은 기계적으로 게이팅 될 수 있습니다 25 . 이 기계적 활성화는 PLC 매개 PIP 2 가수 분해에 의해 방출 된 관찰 된 양성자와 함께 TRP / TRPL 채널의 개방을 촉진하고 범프 생산의 협동 특성을 설명한다. 현재 D. melanogaster 광 수용체는 phosphoinositide 신호 전달 및 TRP 채널 을 생체 내 에서 연구 할 수있는 몇 가지 시스템 중 하나이므로 D. melanogaster 광전 변환을 만들고이 메커니즘을 연구하는 방법이 개발되어 매우 유용한 모델 시스템입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> 그림 3 : inaC P209 와 inaD P215 돌연변이 체는 빛과 단일 양자 범프에 대한 거시적 반응의 느린 응답 종료를 나타냅니다. ( A ) 고립 된 개 모세 혈관 예비형광 루시퍼 옐로우 CH 염료 (여기 : 430 nm, 방출 : 540 nm)로 채워진 패치 피펫으로 배양 한 후 전체 세포를 녹음 하였다. 형광 염료는 하나의 광 수용체 세포 몸체를 확산 및 표지하고 광 수용체 세포 몸체는 길쭉한 축색 돌기에서 분리되지만 생존력을 유지한다는 점에 유의하십시오. 이 준비는 전체 세포 녹음 및 영상 실험을 동시에 수행하는 데 적합합니다. ( BD ) 상단 패널 : WT, inaC P209 및 inaD P215 돌연변이 플라이에서 연속 희미한 빛 (열린 막대)에 대한 전체 셀 전압 클램프 된 양자 범프 응답. 범프의 느린 종결은 WT 파리에 비해 inaC P209 및 inaD P215 돌연변이에서 관찰됩니다. 아래의 삽 입은 단일 범프의 확대 된 모양을 표시합니다. 하단 패널 : 정규화 된 전체 세포는 위의 야생형의 500ms 광 펄스 (1.5 x 10 5 광자 / 초)에 대한 거시적 인 응답을 기록했습니다.<html> 돌연변이 파리. (EG) 상단 패널 : 야생형, arr2 3 및 ninaC P235 돌연변이 파리에서 단일 광자 반응을 유발하는 짧은 (1 ms) 희미한 빛에 대한 전체 셀 전압 클램프 된 양자 범프 응답. 단일 광자 흡수에 대한 반응으로 arr2 3 및 ninaC P235 돌연변이 파리에서 관찰 된 범프 트레인에 주목하십시오. 하단 패널 : 전체 셀 전압은 대응하는 돌연변이 체에서 500 ms 광 펄스 (1.5 x 10 4 광자 / s)에 대한 정규화 된 응답을 고정했습니다. arr2 3 에서 관찰 된 거시적 반응의 느린 종결에 주목하십시오 및 ninaC P235 돌연변이 체는 WT에 비하여 파리. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> d / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4 : 신호 유도 된 칼슘 2+ 주입 후 세포질 칼슘 2+ 역학은 칼 포틴에 의해 영향을받습니다. 야생형과 Cpn 1 % 의 광 수용체 이미지의 시계열은 빛 자극 동안 Ca 2+ 지시약의 형광을 나타냅니다. 원시 강도 영상은 잘못된 색상 코딩 (막대 = 10 μm, 화살촉은 피펫을 나타냄)을 사용하여 플롯됩니다. Weiss 외의 허가를 받아 증쇄 된 그림 . 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> 그림 5 : WT, trp 및 trpl 돌연변이 체의 전기 생리 학적 성질. ( A ) 전체 셀 전압 클램프 리코WT, trp 302 및 trp P343 null 돌연변이 플라이의 연속적인 희미한 빛 (열린 막대)에 대한 응답으로 양자 범프의 돌출부. trp P34 3 범프의 크게 감소 된 진폭이 관찰됩니다. 삽입 : wildtype과 trp P343 null 돌연변이 플라이의 확대 된 단일 양자 범프가 표시됩니다. ( B ) 야생형의 3 초 광 펄스 및 해당 돌연변이 체에 대한 반응으로 전체 세포 전압 클램프 기록. trp P343 돌연변이 체의 일시적인 정상 상태 응답이 관찰됩니다. 삽입 : WT 및 trp P343 돌연변이 체의 확대 된 빛 반응이 표시됩니다. ( C ) 역전 전위 (E rev )를 중심으로 측정 한 3 mV의 전압 단계에서 20 ms 광 펄스에 반응하여 유도 된 상기 플라이 변형의 중첩 된 광 유도 전류 군. ( D ) wildtype의 평균 E rev 와 다양한 mutan을 플로팅하는 히스토그램ts. 오류 막대는 SEM입니다. WT의 역전 전위 (E rev )는 TRP 만 나타내는 trpl 302 의 양의 전자 레인지와 TRPL 만 나타내는 trp P343 null 돌연변이의 전자 레인지 사이에 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> 그림 6 : 플래시 응답은 빛의 강도가 증가함에 따라 엄밀히 선형입니다. 빛의 강도가 증가하는 간단한 섬광에 대한 현재의 일련의 반응과 짧은 빛의 섬광의 증가하는 강도에 대한 빛의 반응의 피크 진폭의 의존성에 대한 플롯. 이 관계는 플래시 응답과 증가하는 광 강도 간의 엄격한 선형성을 나타냅니다. 이 엄격한 선형성빛의 강도가 4 차수 이상에 걸쳐서 적어도 수백 pA를 유지하는 반면 선형성이든 아니면 이후에 고장 나게되는 클램프 제어인지는 논쟁의 여지가있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (NaOH로 조절) </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 농도 (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 프롤린 </td><td> 25 세 </td></tr><tr><td> 알라닌 </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C에서 보관하십시오. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 참고 :이 솔루션은 명목상 Ca 2+ 가 없지만 Ca 2+ 완충액이 첨가되지 않았으므로 약 5 - 10μM의 Ca 2+가 추가 됩니다. Extracellular solution (ES) = ES-0Ca 2+ 에 1.5 또는 1 M 재고 용액에서 CaCl 2 를 첨가하여 만든 1.5 mM CaCl 2의 ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> 표 1 : Ca +2 없는 세포 외 용액 (ES). 화학적 설명 및 Ca +2가 없는 ES의 생산에 필요한 특정 양. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 mL </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 1.5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> 1.5 mL 바이알에 150 μL 분량으로 나누어 -20 °에 보관하십시오 76, C. </td></tr><tr><td> 연화 액 (TS) </td><td> 해부 동안 사용 된 용액과 일치하도록 원액 150 mL의 1 바이알에 1,350 mL의 ES 또는 ES-0Ca 2+ 를 채 웁니다. </td></tr></tbody></table> 표 2 : 태아 소 혈청 (FBS) + 자당 스톡 용액. 태아 소 혈청 (FBS) + 자당 스톡 솔루션의 생산에 필요한 화학적 설명 및 특정 양. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (KOH로 조정) </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 농도 (mM) </td></tr><tr><td> 글루 콘산 칼륨 (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP 마그네슘 염 (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP 나트륨 염 (Na2GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> β- 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오타이드 수화물 (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C에서 보관하십시오. </td></tr></tbody></table> 표 3 : 세포 내 용액 (IS1). 화학적 설명과 IS1 생산에 필요한 특정 양은 주로 강도 응답 및 양자 범프 측정에 사용됩니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (CsOH로 조정) </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 농도 (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP 마그네슘 염 (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP 나트륨 염 (Na2GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> β- 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오타이드 수화물 (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 테트라 에틸 - 염화 암모늄 (TAE) </td><td> 15 명 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C에서 보관하십시오. </td></tr></tbody></table> 표 4 : 세포 내 용액 (IS2). 광학적 유도 전류의 역전 전위 측정에 주로 사용되는 세포 내 용액 IS2를 생성하는 데 필요한 화학적 설명 및 특정 양.

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Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

14.9K 조회수.  Hebrew University.  Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다. 

비디오: Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

성인 Drosophila의 머리에서 전체 셀 레코딩

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

연구

생물학

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

의 거대한 섬유 패스에서 Electrophysiological 레코딩 D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

신경과학

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

Source: Juusola, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54142">Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

1. Recording from R1-R6 Photoreceptors 

	Always be grounded when operating the microelectrode amplifier (for example by touching the metal surface of the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Investigating Prolonged Depolarizing Afterpotential (PDA) in Drosophila Photoreceptors

Source: Gutorov, R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63514">Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an experimental protocol to investigate the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) in white-eyed Drosophila. The fly&#39;s eye is exposed to intense blue light pulses to convert the photopigment rhodopsin to metarhodopsin, initiating a signaling cascade that opens positive ion channels and causes membrane depolarization. Because blue light prevents the reconversion of metarhodopsin to rhodopsin, the continuous influx of positive ions results in sustained depolarization, known as the prolonged depolarizing afterpotential (PDA).

초파리 광수용체(Drosophila Photoreceptor)에서 PDA(Prolonged Depolarizing Afterpotential) 조사

1. Measuring the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) using the electroretinogram

	Suitable rearing conditions for Drosophila melanogaster ...

Stimulation and Modulation Techniques

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Source:&#160; Katz, B., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55627">Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates recording electrical activity in the photoreceptor neurons of Drosophila&#39;s ommatidium by establishing a whole-cell configuration. It highlights the activation of transient receptor potential channels by light pulses, resulting in measurable quantum bumps.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptor(초파리 광수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록)

NOTE: During all of the following steps, use only dim red light illumination and ensure that the ommatidia&#39;s exposure to light is minimal (i.e., work ...

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법

요약

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