Yazarlar işlevsel tahlil ile yardım için bu göz ablasyon tekniği, Taylor Birkholz mükemmelleştirmek için Michelle Deochand teşekkür etmek istiyorum, Peltier plakaları hakkında bilgi almak için, anti-arrestin antikoru Michael Levin ve Junji Morokuma. Bu çalışma WSB Batı Michigan Üniversitesi&#39;nden SFSA hibe ile desteklenmiştir.

1. Hayvan Kültür ve Taşıma NOT: Bu protokol Schmidtea mediterranea, yaygın rejenerasyon araştırma için kullanılan bir sıralı genomun 16, 17 ile diploit planarian türler kullanır. Bununla birlikte, deney gibi Girardia tigrina ve Girardia dorotocephala (ticari olarak temin edilebilir) gibi başka türler ile aynı başarılıdır. <ol><li> Ultra saf (ya da süzülmüş deiyonize edilmiş) su içinde 0.5 g / L deniz tuzu yapılan &quot;sonsuz su&quot; solucanlar koruyun. Sonsuz su tutmak için steril bir polipropilen ya da cam kaplar kullanın. Bkz <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Ek Dosya 1</a> solucan su hazırlama ile ilgili ayrıntılar için. Not: sabun gibi kaplar (ya da diğer malzemeleri) temizlemek için sabun kullanmayın solucan için toksiktir; yerine% 70 etanol ile silin ve kurumaya bırakın. &lt;ol&gt; <li> mikroplardan korunmak için Planarya çalışırken eldiven giyin. Not: Solucanlar sabun, ağartıcı, şampuan, saç kremi, ve el temizleme dahil olmak üzere çevresel toksinler ve kimyasallar, çok hassastır. </li></ol></li><li> Kapaklı polipropilen gıda kapları Ev koloniler, ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) hava değişimi için kısmen açık bıraktı. Petri kutuları ya saklayın deney kurtlar (100 mm tabak için 20 solucanlar) veya non-muamele edilmiş doku kültürü plakaları (12 oyuklu plakalar için oyuk başına 1 solucan). Stresi azaltmak karanlıkta hem koloniler ve deneyleri tutmak. NOT: Koloniler solucan litre suya en fazla 500-1000 den solucanlar olmalıdır. Hava akımı bu yemeklerin içine tasarlanmıştır beri deneyler için, tam yerinde kapaklarını bırakın. </li><li> Bir transfer pipeti ile ilgili püresi bırakarak kap boyunca yiyecek damla yerleştirerek püre haline getirilmiş organik et ve tavuk karaciğer haftada bir deneysel olmayan solucanlar besleyin. içinde gıda tüketmek Worms 2 saat izin verkabını temizlemeden önce koyu (adım 1.4). Uzun süreli (ay) C, mağaza kısa süreli (haftalar) boyunca -20 ° C&#39;de püre ya da -80 Kullanımdan önce; (Bakteri çiçek ve solucanlar zarar verebilir gibi) yeniden kullanım için püresi dondurursam yoktur. Not: Karaciğer bir hormon veya antibiyotik içerir ve tercihen önceden dondurulmuş edilemez. Santrifüj, dondurmadan önce püresi (ya da teknolojide beslemeye) havanın çıkartılması ve yüzer gıda önlemek için kullanılırlar. Gıda kabın dibine batar gerekir. püresi 1 mL 500-1,000 solucanlar için yeterlidir. </li><li> Kolonilerin ve deneyler hem taze solucan su ile haftada bir kez Değişim su. Koloni kaplar da ağartılmamış kağıt havlu ile silinmiştir edilmelidir (mukus lekeleri çıkarmak için tuzak atıklar) (besleme ve tekrar 2 gün sonra 2 saat sonra), besleme solucanlar için haftada iki kez solucanlar açlıktan veya bir haftada bir kez. biyofilm muhafaza etmek için, kabın% 80&#39;den fazla silme yoktur. </li><li> Kaplarla (ya da cerrahi Setu arasında solucanlar taşıp) Bir transfer pipeti kullanarak. kap yüzeylerine yapışan serbest solucan için, yüzeyin serbest bırakmak için solucan / arkasında üzerinde su fışkırtma. pipet alt inç (tiner) kısmı içinde solucan tutmaya çalışırken Ardından, pipet içine solucan emmek. <ol><li> onları emmeye önce solucan küçük bir su miktarı ile Backload pipetler. </li><li> pipet ile dokunarak yumuşak bedenli solucanlar yırtılma önlemeye yardımcı olmak için, daha doğrusu solucan kendisinden daha, solucan etrafında su taşımak için deneyin. </li><li> solucanlar transfer veya su yerine sürece örtülü deneysel yemekler tutun. </li></ol></li></ol> 2. Hazırlık <ol><li> Deneylerden önce solucanlar az bir hafta beslenmesi durdurun. <ol><li> ≥1 hafta boyunca beslenirler ve uzunluk olarak en az 5-7 mm edilmemiş olan solucanlar seçin. solucan su dolu bir Petri kabı 2/3 solucan aktarın ve çanak altına bir cetvel kaydırarak solucan uzunluğunu onaylayın. w ölçünnormlar ise tamamen uzatılmış ve hareketli. NOT: Sonraki .bağışık ve in situ hibridizasyon analiz içinde, daha büyük solucanlar (8-10 mm) performans ile çalışmak daha kolay olduğunda daha küçük (5-7 mm) solucanlar daha iyi çalışırken - özellikle aşındırılması için öğrenme. </li><li> solucanlar, bütün hasarsız ve yakın zamanda yenileyici değildir emin olun. NOT: Normal solucanlar kıyasla rejenerasyon solucanlar, baş ve / veya arka bölgede daha hafif (veya hiç) pigment olacaktır. </li><li> solucanlar üzerinde RNAi&#39;yi veya farmakolojik tedaviler gerçekleştirmek, bu noktada bunu. kurtlar tedavisi (RNAi için gibi) bir parçası olarak beslenen olsaydı, 2.2 adıma devam etmeden önce en az 7 gün son beslenmeden sonra bekleyin. </li></ol></li><li> % 70 etanol ile çalışma alanı ve diseksiyon mikroskobu baz temizleyin ve tamamen kurumasına izin verin. Kapsamı solundaki seçilen solucanların koyunuz. Kapsamı sağında, 5/16 inç insülin iğne 1 ile 5. forseps bir çift, bir 31 G yerml şırınga ve temiz bir aktarım pipet. <ol><li> alet tezgah (kontaminasyona neden olabilir) dokunmasını tutulmasını sağlamak. temiz forseps, iğne ve pipet tutmak için (örneğin bir çubuk geri kalanı gibi) sert bir öğesini kullanın. Alternatif olarak, yeni bir kahverengi (ağartılmamış) ve kağıt havlu üstüne yer araçlar. NOT: Sağ elini bireyler ilgilendirmeyen Bu ve sonraki talimatlar yazılır. Solak bireyler sağ / sol yön ters olmalıdır. </li></ol></li><li> Sonraki bir çalışma alanı için ve lif içermeyen doku mendillerin bir kutu, taze sonsuz bir su kaynağı, ve (tezgah üstü korunmuş olarak) ilave bazı aktarım pipetler yerleştirin. yayma kolaylığı için bir plastik yıkama şişesinde yer solucanı su. Ayrıca ablasyona Hayvan toplam kapsamına sağındaki işaretlenmiş bir 12-kaynaklı plaka (veya 100 mm Petri kabı) yerleştirin. </li><li> Ismarlama bir Peltier plakası kullanılarak solucanlar hareketsiz hale getirmek için ise, t depresyon içine Peltier plakası pozisyonO mikroskop taban ve Peltier plakasının çalışma yüzeyi yeterince soğuk kadar DC güç kaynağı çıkış ayarlayabilirsiniz (tipik olarak ~ 5 V) .Alternatively, yarım su ile dolu bir 100 mm Petri kabı doldurarak soğuk plaka yapmak ve en az 24 saat süre ile dondurma. Kapağı atın ve kesici bir alan tabanındaki 100 mm tabak için alt tarafının, daha sonra buz (Şekil 1A) yüzeyine doğrudan baş aşağı bir 60 mm Petri kabı kapağını yerleştirin. <ol><li> Su, 100 mm tabak içinde dondurulur sonra, bir buz &quot;volkan&quot; plakasının merkezinde bir görünebilir. Bu durumda, yüzeyden herhangi bir düzensizlik kaldırmak için, buz düz kazımak için bir tıraş bıçağı kullanma. NOT: ameliyatları sırasında buz, erimeye çok daha zor ablasyon yapma olacaktır. önceden birkaç buz yemekleri hazırlayın, ve en kısa sürede 60 mm yemeğin kapak yüzen başlar başlamaz tahlil sırasında olanları eritmek için donmuş olanları değiştirin. </li></ol></li><li> hazırlamakcerrahi yüzeyi. Plastik parafin film bir 5 cm x 10 cm parça kesin (4 cm2 olursa petri soğuk plaka kullanılarak) ve hareketsiz hale getirme cihazının merkezi üzerine yerleştirin. Bir lifsiz bir doku Katlama bir kare yaklaşık 2 cm2 olarak mendil ve filmin üzerine yerleştirin. Beyaz filtre kağıdı 1.5-2 cm2 &#39;lik bir parça kesin ve mendilin üzerine yerleştirin. Şekil 1B-1E bakın. <ol><li> katlanmış tutun eldivenli parmak ile yerinde silin ve hafifçe katlanmış devam etmesini sağlamanın silin kırmak için solucan su kullanmayın. düz mendil rulo bir transfer pipeti kenarıyla. NOT: Soğuk sıcaklık hareket solucanlar tutmaya yardımcı olur. Çalışma &quot;kuru&quot; da hareketsiz hale yardımcı olur. Doku kurtlar (öldürücü olan) tamamen kurumasına izin vermeden, ameliyat sırasında nemli solucan tutarak, filtre kağıdı içinden su fitilleme eylemleri silin. </li></ol></li></ol> 3. Cerrahi Ablasyon <ol><li> Yerleştirmek üzere bir transfer pipet kullanınfiltre kağıdı üzerine, e solucan sırt tarafı yukarı. Işık kaynağını açın ve hafif solucan odaklanmış şekilde Goosenecks yönlendirmek. Gözleri (tüm solucan görünümünde olması gerekmez) açıkça görünecek şekilde diseksiyon kapsamı odağı ve büyütme ayarlayın; 5X büyütmede iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Kafa (mikroskop ön tarafına doğru) araştırmacı doğru işaret şekilde sağa doğru, açılı 30-40 derece parafin filmi döndürerek solucan döndürün. <ol><li> Aşırı solucan hareket etmesini önlemek için parlak ışık kullanımından kaçının. Planaryalar olumsuz phototaxis görüntülemek ve parlak ışık kaçmasına dener. </li><li> Solucan (boğaz görünür açılış) yukarı bakacak şekilde ventral yana konumlandırılmış, yavaşça (gözleri görünür olan) sonsuz dorsal tarafına kadar yeniden konumlandırmak için forseps donuk tarafında kullanır. hayvan yeniden konumlandırma zaman yumuşak doku yoluyla yırtılma riskini en aza indirmek için forseps sivri ucu ile hayvanın yaklaşan kaçının. </li><li&gt; Gözler odakta açıkça böylece mikroskop odağı ayarlayın. Ayrıca gözleri ve çevresindeki kafa dokuları hem görünümde olmasını sağlamak. </li></ol></li><li> O (başparmak ve işaret parmağı arasında) kalem sanki sağ elinde taze bir iğne / şırınga tutun. Peltier plakasına (veya Petri kabı soğuk plaka) karşı sola başparmak Brace ve şırınganın alt kısmı dinlenme olan bir dayanak noktası (Şekil 2A) ve sol baş kullanımı. Mikroskopla Bak ve iğne konik görünür olmasını sağlamak. NOT: İğneler çok keskindir. Onları tutarken dikkatli olun. lateks veya nitril eldiven giyerek biraz koruma sunabilir. <ol><li> prosedürü boyunca sürekli iğne / şırınga tutun yardımcı ve tokalaşarak önlemek için sol baş parmağını kullanın. </li><li> Ameliyat yüzey stabil tutmak yardımcı olmak için sol başparmak ve (cerrahi yüzeyinde parmağı ile) sol işaret parmağı ile yaklaşık 40 ° &#39;lik bir açı olun. </li></ol></li><li> İle(Kaşık gibi) yukarı doğru bakacak şekilde iğne konik, göz (Şekil 2B) dik açılarda iğne yerleştirin. yavaşça sağdan sola scooping gözün optik fincan (beyaz, pigmentsiz bölge) üzerinde uzanan doku ince tabaka nüfuz iğne ucu kullanın. Çok nazikçe dibe delinme veya optik fincan sınırlarını yok etmek değil dikkat ederek optik fincan içinde yer alan herhangi bir pigmentli dokuyu. <ol><li> Sonsuz işlemi sırasında herhangi bir noktada&gt; 1-2 dakika için bir filtre kağıdı üzerinde kalmışsa, solucan rehidrate sonsuz bir su damla ekleyin. NOT: Dehidrasyon müthiş yaralanmalara solucanın duyarlılığını artıracaktır. </li></ol></li><li> Tekrar siyah pigmentli dokularda (pigment hücreleri) her kadar adım 3.3, hem de optik fincan (fotoreseptör hücrelerinin dendritler) beyaz dokuların her olarak çıkarılır. dikkatli bir doku temizleme ile silerek iğnenin ucuna yapışmış kesilmiş dokuları çıkarın. çift ​​göz abla isesiyon, istenen bu noktada ikinci gözü baskılamak edilir. Not: zarar görmesini önlemek için, iğneler daha sonra silme uzak başparmak ve işaret parmağı arasından yoluyla iğne çekmek için diğer elini kullanarak, başparmak ve işaret parmağı ile yapılan mendil temiz bir doku ile iğne kavranarak temizlenebilir. Seçenek olarak ise, iğne ıslak bir doku temizleme yüzeyi üzerine sürülmüştür ve temizlik için incelenebilir. </li><li> Tamamlandığında taze solucan su içeren bir etiketlenmiş çanak solucan taşımak için bir transfer pipet kullanın. Grup verileri analiz için, bir tek 100 mm Petri tabağına 20 solucanlar yerleştirebilir. Zamanla aynı bireylerde rejenerasyonu izleme Eğer bir 12 plaka her kuyuya 1 solucan yerleştirin. Tüm solucanlar transfer edildikten sonra, tabaklar / kuyu tüm solucan suyun çıkarılması ve daha fazla taze solucan su ile değiştirerek solucanlar yıkayın. <ol><li> filtreden solucanlar kaldırmak için, sonsuz küçük bir su miktarı ile pipet backload ve solucan üzerine su bırakın. Bu t kaldırması gerektiğinifiltre kağıdı kapalı o solucan, derhal transfer için pipet içine emilmesine. </li></ol></li><li> ışıktan korunmalıdır ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) deneyleri inkübe edin ve rejeneratif süreci takip. NOT: Solucanlar sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek sıcaklık kontrollü inkübatör içinde saklanabilir, ancak bu kesinlikle gerekli değildir. Çoğu oda sıcaklıkları yeniden oluşturmak için solucan yeteneğini etkilemez 5 ° C, sadece değişir. </li><li> Arzu edildiği takdirde, imünohistokimya için solucan (Şekil 3-4) ve / ya da in situ hibridizasyon gen ekspresyonunun analiz düzeltmek. Farklı tespit yöntemleri planarian immünohistokimya 18, 19, 20 ve in situ melezleme 21, 22, 23 protokolleri bulunmaktadır. </li><li> Deneyler sonuçlandığı, sacrifice çanak sonsuz suyun çıkarılması ve% 70 etanol ile değiştirerek solucanlar canlı. parçalanması ve grimsi açmak için solucanlar için kontrol 3-5 dakika solucanlar inkübe edin. </li><li> bir kez kurban Normal atık olmayan tedavi solucanlar yerleştirin. çevre, özellikle yerli olmayan türlerin içine canlı solucanlar tanıtan kaçının. </li></ol>

<ol><li>Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+planarian+flatworm%3A+an+in+vivo+model+for+stem+cell+biology+and+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration.</a> Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).</li>
<li>Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+enduring+contributions+of+planarians+to+the+study+of+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).</li>
<li>Emili Saló, R. B. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmili+Sal%C3%B3%2C+RB+%22Animal+Models+in+Eye+Research%22">Animal Models in Eye Research</a>. Tsonis, P. A. , Academic Press. 15-26 (2008).</li>
<li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dlx+and+sp6-9+Control+optic+cup+regeneration+in+a+prototypic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye.</a> PLoS Genet. 7 (8), e1002226(2011).</li>
<li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+planarian+eye+identifies+ovo+as+a+specific+regulator+of+eye+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration.</a> Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+recovery+of+the+planarian+photosensing+system+during+head+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration.</a> Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).</li>
<li>Pineda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+network+of+prototypic+planarian+eye+regeneration+is+Pax6+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent.</a> Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).</li>
<li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9 (12), e114708(2014).</li>
<li>Raffa, R. B., Martley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+increase+in+planarian+locomotor+activity+and+block+by+UV+light%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light.</a> Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).</li>
<li>Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-regeneration+transcriptome+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Genome Biol. 12 (8), R76(2011).</li>
<li>Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NuRD+complex+component+p66+suppresses+photoreceptor+neuron+regeneration+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians.</a> Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).</li>
<li>Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+planarian+eye+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of planarian eye regeneration.</a> Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).</li>
<li>Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regeneration+ability+of+spontaneous+supernumerary+eyes+in+planarians+-eye+regeneration+field+and+pathway+selection+by+optic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves.</a> Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).</li>
<li>Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-like+proteins+in+planarian+eye+and+auricle%3A+detection+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis.</a> J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).</li>
<li>Cross, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Maintenance+and+Regeneration+of+Planarian+Eyes+by+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).</li>
<li>Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD+2.0%3A+The+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database.</a> Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).</li>
<li>Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD%3A+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).</li>
<li>Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+planar+cell+polarity+extends+neural+growth+during+regeneration%2C+homeostasis%2C+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development.</a> Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).</li>
<li>Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cell+type-specific+monoclonal+antibodies+for+the+planarian+and+optimization+of+sample+processing+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling.</a> BMC Dev Biol. 14, 45(2014).</li>
<li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+monoclonal+antibodies+to+study+tissue+regeneration+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians.</a> BMC Dev Biol. 15, 2(2015).</li>
<li>Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+situ+hybridization+protocol+for+planarian+embryos%3A+monitoring+myosin+heavy+chain+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression.</a> Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).</li>
<li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev Biol. 13, 8(2013).</li>
<li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu göz ablasyon tekniği beyin dokusu hariç ve göz dokuları için esas eksizyon kısıtlayarak (örneğin, delikli zımba gibi) mevcut yöntemlerle daha da iyileştirir. teknisyenler deneyimsiz ama vicdani lisans öğrencilerine microsurgeries yaşanan den uygulama ile, bu teknik, çoğu kişiler tarafından yapılabilir. Tekniğin önceki immünohistokimya ile ya da göz işaretçi (ler) 4, 5, 13 için in situ mel...

Planaryalar yetişkin kök hücre aracılı yenilenmeyi incelerken için güçlü bir model organizma bulunmaktadır. Bu parazitik olmayan tatlı su yassı kurtların, merkezi sinir sistemi ve beyin 1 de dahil olmak üzere her türlü kayıp dokuları, yeniden yeteneği gösterirler. (In situ hibridizasyon, immünohistokimya, RNA interferans (RNAi), ve transkriptomik içinde, örneğin, bir sıralı genom olarak) kadar geri son 10-15 yılda planarian alanında 1700 2, teknolojik gelişmeler olarak ele bu tarihi organizma olduğu güncellenmiş . Özellikle, planarya geçenlerde göz araştırma 3 yükselen bir model olarak popülerlik kazanmıştır. Planaryalar iki doku tipleri, fotoreseptör nöronlar ve pigment hücreleri ile prototipik gözleri; Bu onun göz kök hücre popülasyonunun karakterizasyonu etkin ve aynı genlerin birçoğu omurgalı gözü DE düzenleyen olduğunu göstermiştirvelopment Planaryalar 4, 5 muhafaza edilir. Optik bardak dorsal olarak bulunur ve fotoreseptör nöronların beyaz, pigmentsiz dendrit ve yarım ay siyah pigment yapan hücrelerden, ve bunun üzerine kiyazmanın ile beyin innerve edilir. Yeniden yaratıcı süreçler, 6 açıklık için bir model olmasının yanı sıra, planarian göz görme mekanizmaları 7 evrim eğitimi için uygundur, davranışsal tepkileri ışığa 8 ve davranış 9 nörolojik temeli (planarya negatif phototaxis ekran). Planaryalar Göz rejenerasyon büyük ölçüde iki ana bağlamlarda incelenmiştir: Baş yenilenme parçası başının kesilmesini 4, 10 takip ve sadece göz dokularının 11 eksizyonu aşağıdaki gibi 12 </&gt; Sup. Basit ve anlaşılır olarak göz yenilenmesine En planarian çalışmalar decapitation yöntemini kullanmışlardır. Bazı çalışmalar, sadece göz (kısmi dekapitasyon) 15 arkasında amputasyon gerçekleştirilir rağmen bugüne kadar en yaygın planarian göz eksizyon yöntem olup, ince bir cam kılcal boru 13, 14 ile delik açma ile olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin tüm potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike (örneğin, beyin, bağırsak, ve nephridia gibi) sadece göz dışındaki birçok doku kaybını içermektedir. Burada sunulan göz ablasyon protokolü göze daha özeldir verilerin ortaya çıkmasına neden (özellikle beyinde hariç) göz dokularına, eksizyonu kısıtlar. Ayrıca, beslenme başlamak için 7-14 gün sürebilir kafası kesilmiş solucanlar aksine, göz kesilip solucanlar performe edilmesi (RNAi gıda ile teslim edilir) RNAi deneyleri izin ablasyon 12 24 saat içinde besleyecekeş zamanlı d. Göz ablasyon başarılı dekapitasyon daha gerçekleştirmek için teknik olarak zor olsa da, göz eksizyonu içeren güncel çalışmalar onların prosedürlerine ilişkin ayrıntılı talimatlar yer verilmemiştir. Bu video makalede amacı sürekli altta yatan beyin dokuları rahatsız ve mümkün olduğunca az diğer dokulara çıkarmadan planarian optik fincan kaldırmak için araştırmacılar sağlamaktır. Bu yöntem hem tek ve çift göz yakmakta ve araştırmaların geniş bir yelpazede uygulanabilir edilebilir. En yenilenmesi deneylerinde olduğu gibi, göz ablasyon farmakolojik ve genetik (RNAi) ekranlar, hem de davranışsal çalışmalar her iki kombinasyon için uygundur. Burada, solucan işlenmesi için yöntemler tarif bir planarian koloni bakımı ve göz ablasyon tekniği kendisi.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean sea salts</td><td>Spectrum Brands&amp;nbsp;</td><td>SS15-10</td><td>&quot;10 Gallon&quot; box&amp;nbsp; (net weight 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4.5 x 8.5 in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 filter paper</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Circles, 125 mm diameter, white</td></tr><tr><td>Easy Touch Insulin syringe (with needle)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&amp;nbsp;U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&amp;nbsp; forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, straight tip , 11 cm</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&amp;nbsp;</td><td>Samco Scientific&amp;nbsp;</td><td>225</td><td>Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile</td></tr><tr><td>Parafilm M paraffin film</td><td>Brand&amp;nbsp;</td><td>701606</td><td>&amp;nbsp;4 in x 125 ft roll</td></tr><tr><td>12-well untreated tissue culture plate</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand</td></tr><tr><td>Plastic food containers (for colony)&amp;nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Large rectangle</td><td>2.25 qt (2.12 L), 10&quot; x 6 -3/4 &quot; x 3 -3/16&quot;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Girardia tigrina&lt;/em&gt;)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Sold as &quot;Brown&quot; Planaria; most often they are &lt;em&gt;G. tigrina&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia tigrina&lt;/em&gt;), but sometimes are &lt;em&gt;G. dorotocephala&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia dorotocephala&lt;/em&gt;); either will work.</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Schmidtea mediterranea&lt;/em&gt;)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>&lt;em&gt;S. mediterranea&lt;/em&gt; are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.</td></tr><tr><td>Brown paper towels&amp;nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8&quot; 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td></tr><tr><td>Wash bottle (for worm water), optional</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL</td></tr><tr><td>Anti-synapsin antibody, optional</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>Anti-arrestin antibody, optional</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&amp;nbsp; polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Custom Peltier plate, optional</td><td>Williams Machine, Foxboro, MA&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:&amp;nbsp; Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;).&amp;nbsp; The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is&amp;nbsp; &quot;anchored&quot; to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a &quot;foot&quot; that fits into the opening of your microscope&#039;s base plate.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DC power source (for Peltier plate), optional</td><td>B &amp;amp; K Precision</td><td>1665</td><td>Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.</td></tr><tr><td>Other common supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blade&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope with gooseneck lighting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chopstick rests, optional</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians

Yetişkin kök hücreleri ve rejeneratif mekanizmaların çalışmada planarya yassı kurtların vivo model sisteminde bir elyaf. Bu onların bol pluripotent kök hücre nüfus ve çoğu hayvanlar için felaket olacaktır yaralanmalar sonrasında tüm hücre ve doku tiplerini rejenere etme kabiliyetine büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, planarya göz rejenerasyon için bir model olarak popülerlik kazanmıştır. (Iki doku tiplerinin gibidir: pigment hücreleri ve fotoreseptör) tüm göz yeniden kabiliyetleri görme sistemi rejenerasyonunu düzenleyen mekanizmaların diseksiyon sağlar. Göz ablasyon rejenerasyon büyük ölçüde tek başına göz doku ile sınırlı olduğunu En önemli olan göz spesifik yolları ve mekanizmaları incelemek için (örneğin, başı kesilerek ya da delik açma gibi) diğer tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Bu Video makalenin amacı güvenilir beyni rahatsız veya dokuları çevreleyen olmadan planarian optik fincan nasıl kaldırılacağını göstermektir.solucan ve kurulu bir koloninin bakım kullanımı da tarif edilmektedir. Bu teknik, cerrahi soğuk plaka üzerinde immobilize Planaryalar optik fincan oymak için bir 31 G, 5/16 inç insülin iğne kullanır. Bu yöntem geniş bir uygulama yelpazesi için izin 1-2 hafta içinde rejenere gözlü, tek ve çift göz ablasyon kapsar. Özel olarak, bu ablasyon tekniği kolayca rejeneratif mekanizmaları ve evrim, göz kök hücreleri ve bakım ve phototaxic davranışsal tepkileri ve nörolojik olarak daha iyi anlaşılması için farmakolojik ve genetik (RNA interferansı) ekranları ile birleştirilebilir.

ilk 1-2 saat sonra cerrahi, hayvanlar sağlam solucanlar (ancak yine de hareket edecek) ile karşılaştırıldığında hareket azalma gösterebilir. Arzu edildiği takdirde, solucanlar (RNAi beslenmesi için, örneğin) ameliyattan sonraki 24 saat içinde yiyeceklerdir. zamanla aynı bireylerde göz rejenerasyonu aşağıdaki, her iki ameliyat öncesi (bozulmamış) ve 1 saat sonrası ablasyon (HPA) her solucanın fotoğrafını çekmek için emin olun. 4 gün sonra ablasyonu (DPA) tar...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians at JoVE.com

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

surgical-ablation-assay-for-studying-eye-regeneration-in-planarians

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K Görüntüleme.  Western Michigan University.  Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir. 

Video: Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Gelişim Biyolojisi

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biyokimya

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Biyoloji

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Nörobilim

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...