Gli autori desiderano ringraziare Michelle Deochand per perfezionare questa tecnica di ablazione dell&#39;occhio, Taylor Birkholz per l&#39;assistenza con il saggio funzionale, Michael Levin per l&#39;anticorpo anti-arrestina, e Junji Morokuma per informazioni sulle piastre Peltier. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione SFSA da Western Michigan University per WSB.

1. Cultura e trattamento degli animali NOTA: Questo protocollo utilizza mediterranea Schmidtea, una specie planaria diploide con un genoma sequenziato 16, 17 che viene comunemente utilizzato per la ricerca di rigenerazione. Tuttavia, l&#39;analisi è altrettanto successo con altre specie, quali Girardia tigrina e Girardia dorotocephala (che sono disponibili in commercio). <ol><li> Mantenere vermi &quot;acqua verme&quot; fatta da 0,5 g sali / L di mare in ultrapura (o filtrata deionizzata) acqua. Utilizzare sterili contenitori in polipropilene o vetro per tenere l&#39;acqua verme. Vedere <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">file supplementare 1</a> per i dettagli sulla produzione di acqua verme. NOTA: Non usare mai sapone per pulire i contenitori (o di altri fornitori) come il sapone è tossico per i vermi; invece strofinata con 70% etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria. &lt;ol&gt; <li> Indossare guanti durante il lavoro con planaria per proteggerli dalla contaminazione. NOTA: I vermi sono molto sensibili alle tossine e sostanze chimiche ambientali, tra cui il sapone, candeggina, shampoo, balsamo e crema per le mani. </li></ol></li><li> colonie case in contenitori per alimenti polipropilene, con il coperchio parzialmente aperto lasciati per lo scambio aria a ~ 20 ° C (temperatura ambiente). Negozio vermi sperimentali in entrambe le capsule di Petri (20 vermi per piastra 100 mm) o lastre non trattate tessuto-coltura (1 verme per pozzetto, per piastre da 12 pozzetti). Per ridurre lo stress, tenere entrambe le colonie e gli esperimenti nel buio. NOTA: Le colonie devono avere non più di 500-1000 vermi per litro d&#39;acqua a vite senza fine. Per gli esperimenti, lasciare coperchi pienamente in atto, dal momento che il flusso d&#39;aria è stato progettato in questi piatti. </li><li> Nutrire i vermi non sperimentali volta alla settimana con purea carne biologica o fegato di pollo facendo cadere purea da una pipetta di trasferimento, mettendo gocce di cibo in tutto il contenitore. Lasciare Worms 2 h di consumare cibo inbuio prima di pulire il contenitore (vedi passo 1.4). Prima dell&#39;uso, purea di conservare a -20 ° C per brevi periodi (settimane) o -80 ° C per il lungo termine (mesi); non ricongelare purea per il riutilizzo (come batteri possono fiorire e danneggiare i vermi). NOTA: fegato non deve contenere ormoni o antibiotici e preferibilmente non essere congelati in precedenza. Centrifugare purea prima del congelamento (o prima dell&#39;alimentazione) per rimuovere l&#39;aria e impediscono cibo da galleggiante. Il cibo dovrebbe depositarsi sul fondo del contenitore. 1 ml di purea è sufficiente per 500-1.000 vermi. </li><li> acqua di cambio una volta alla settimana con acqua fresca senza fine per entrambe le colonie e gli esperimenti. contenitori colonia dovrebbero essere puliti con un tovagliolo di carta greggi (per rimuovere i residui di muco che i rifiuti trappola) una volta alla settimana per fame vermi, o due volte alla settimana per vermi alimentazione (2 h dopo l&#39;alimentazione e ancora 2 giorni più tardi). Al fine di mantenere il biofilm, non pulire più dell&#39;80% del contenitore. </li><li> Spostare vermi tra i contenitori (o setu chirurgiap) utilizzando una pipetta di trasferimento. Per vermi liberi aderito superfici del contenitore, spruzzare acqua sopra / dietro il verme per sganciarlo dalla superficie. Poi aspirare il verme nella pipetta, cercando di mantenere il worm all&#39;interno della porzione di fondo pollici (più sottile) della pipetta. <ol><li> pipette rinviare la con una piccola quantità di acqua verme prima di succhiare. </li><li> Provare a spostare l&#39;acqua intorno alla vite senza fine, piuttosto che il worm stesso, per aiutare a prevenire strappi vermi dal corpo molle toccandoli con la pipetta. </li><li> Mantenere piatti sperimentali coperte salvo trasferimento vermi o sostituzione dell&#39;acqua. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione <ol><li> Smettere di alimentare i vermi almeno una settimana prima di esperimenti. <ol><li> Selezionare worm che non sono stati ricevuto per almeno ≥1 settimana e sono almeno 5-7 mm di lunghezza. Trasferire i vermi ad una piastra di Petri 2/3 con acqua verme, e confermare la lunghezza verme facendo scorrere un righello sotto il piatto. Misura wORM mentre completamente estese e in movimento. NOTA: Anche se più piccolo (5-7 mm) vermi funzionano meglio durante l&#39;esecuzione successiva immunofluorescenza e analisi situ, vermi più grandi (8-10 mm) sono più facili da lavorare - soprattutto quando si impara per l&#39;ablazione. </li><li> Assicurarsi che i vermi sono tutto, non danneggiato, e non recentemente rigenerante. NOTA: Rigenerazione vermi avranno molto più leggero (o no) pigmento nella testa e / o della regione di coda rispetto ai vermi normali. </li><li> Se l&#39;esecuzione di RNAi o trattamenti farmacologici di vermi, farlo a questo punto. Se i vermi sono stati alimentati come parte del trattamento (come per RNAi), attendere almeno 7 giorni dopo l&#39;ultima alimentazione prima di passare al punto 2.2. </li></ol></li><li> Pulire il microscopio base spaziale lavoro e dissezione con il 70% di etanolo e lasciare asciugare completamente. Posizionare il piatto di vermi selezionati a sinistra del campo di applicazione. A destra del campo di applicazione, inserire un paio di # 5 forcipe, un 31 G 5/16-inch ago da insulina con un 1mL siringa, e un trasferimento pipetta pulita. <ol><li> Assicurarsi che gli strumenti sono mantenuti tocchi il banco (che potrebbe introdurre contaminanti). Utilizzare un elemento rigido (ad esempio un resto della bacchette) per mantenere la pinza, l&#39;ago, e pipetta pulita. In alternativa, posizionare gli strumenti sulla parte superiore di un marrone (greggio) tovagliolo di carta fresca. NOTA: Queste e le successive istruzioni sono scritte in cui riguardano gli individui destri. individui mancini dovrebbero invertire la destra / sinistra le direzioni. </li></ol></li><li> Accanto alla spazio di lavoro, mettere una casella di salviette panno liscio, una fonte di acqua fresca a vite senza fine, e alcune pipette di trasferimento extra (protetti dal banco). Posto acqua verme in una bottiglia di lavaggio in plastica per facilità di erogazione. Anche inserire un piatto marcato 12 pozzetti (o 100 a Petri) a destra del campo di applicazione raccoglie gli animali ablazione. </li><li> Se si utilizza una piastra Peltier su misura per immobilizzare i vermi, posizionare la piastra Peltier nella depressione in tha basamento del microscopio da dissezione e regolare l&#39;uscita del generatore di tensione CC finché la superficie di lavoro della piastra Peltier è sufficientemente fredda (tipicamente ~ 5 V) .Alternatively, fare una piastra fredda riempiendo una capsula Petri mm 100 metà con acqua e congelare per almeno 24 h. Scartare il coperchio e posizionare il fondo del piatto 100 mm base della portata dissezione, quindi posizionare il coperchio di un piatto 60 mm Petri capovolta direttamente sulla superficie del ghiaccio (Figura 1A). <ol><li> Dopo che l&#39;acqua è congelato nel piatto 100 mm, un &quot;vulcano&quot; di ghiaccio può apparire nel centro della piastra. Se questo accade, usare una lama di rasoio per raschiare il piatto ghiaccio, per eliminare irregolarità dalla superficie. NOTA: durante interventi chirurgici il ghiaccio si scioglierà, rendendo ablazioni molto più difficile. Preparare diversi piatti di ghiaccio in anticipo, e sostituire quelli congelati per la fusione quelli durante il dosaggio non appena il coperchio del piatto 60 millimetri inizia flottante. </li></ol></li><li> preparare lasuperficie chirurgia. Tagliare un pezzo 5 cm x 10 cm di parafilm plastica (4 cm 2 se si utilizza la scatola di Petri piastra fredda) e posizionarlo sul centro del dispositivo di immobilizzazione. Piegare un panno liscio pulire in un quadrato circa 2 cm 2 e posizionarlo sopra del film. Tagliare un pezzo di filtro di carta bianca 1,5-2 cm 2 e posizionarlo sulla parte superiore del wipe. Vedere Figura 1B-1E. <ol><li> Tenere il piegata pulire in posizione con un dito guantato, e utilizzare l&#39;acqua senza fine per inumidire leggermente la salvietta per garantire che rimanga piegato. Usare il lato di una pipetta di trasferimento a rotolare la salvietta piatta. NOTA: la temperatura fredda aiuta a mantenere i vermi di muoversi. Lavorare &quot;a secco&quot; aiuta anche nella immobilizzazione. Il tessuto wipe agisce per favorire l&#39;acqua attraverso la carta da filtro, mantenendo il verme umido durante l&#39;intervento chirurgico senza consentire vermi asciugare completamente (che è letale). </li></ol></li></ol> 3. ablazione chirurgica <ol><li> Utilizzare una pipetta di trasferimento di immettere sullato e verme dorsale fino sulla carta da filtro. Accendere la sorgente luminosa e dirigere le goosenecks in modo che la luce si concentra sul verme. Regolare la messa a fuoco dissezione portata e ingrandimento in modo che gli occhi sono chiaramente visibili (l&#39;intero verme non ha bisogno di essere in vista); Ingrandimento 5X è un buon punto di partenza. Orientare il verme ruotando il parafilm modo che la testa sia puntato verso il ricercatore (verso la parte anteriore del microscopio), angolati 30-40 gradi verso destra. <ol><li> Evitare l&#39;uso di luce intensa per impedire il movimento verme in eccesso. Planarians mostrano fototassi negative e tenterà di eludere luce. </li><li> Se la vite è posizionato lato ventrale rivolto verso l&#39;alto (con apertura visibile faringeo), usare il lato opaco della pinza per riposizionare delicatamente il lato dorsale verme alto (con gli occhi visibili). Evitare di avvicinarsi l&#39;animale con la punta affilata della pinza per ridurre al minimo la possibilità di strappare attraverso i tessuti molli quando riposizionamento l&#39;animale. </li><li&gt; Regolare il fuoco microscopio in modo che gli occhi sono chiaramente a fuoco. Assicurarsi inoltre che entrambi gli occhi e tessuti testa circostanti sono in vista. </li></ol></li><li> Tenere un fresco ago / siringa nella mano destra come se fosse una penna (tra il pollice e l&#39;indice). Brace il pollice sinistra contro la piastra Peltier (o scatole Petri piastra fredda), e utilizzare il pollice sinistro come fulcro su cui poggerà la porzione di fondo della siringa (Figura 2A). Guardare attraverso il microscopio, e assicurarsi che la smussatura dell&#39;ago è visibile. NOTA: Gli aghi sono molto taglienti. Siate cauti quando loro manipolazione. Indossare guanti di lattice o di nitrile in grado di offrire una certa protezione. <ol><li> Utilizzare il pollice sinistro per contribuire a tenere l&#39;ago / siringa costante durante tutta la procedura ed evitare di stringere la mano. </li><li> Formare un angolo di circa 40 ° con il pollice sinistro e l&#39;indice di sinistra (con il dito indice sulla superficie chirurgia) per contribuire a tenere la superficie stabile chirurgia. </li></ol></li><li> Conla smussatura dell&#39;ago rivolta verso l&#39;alto (come un cucchiaio), posizionare l&#39;ago perpendicolarmente alla dell&#39;occhio (Figura 2B). Utilizzare la punta dell&#39;ago per penetrare delicatamente lo strato sottile di tessuto sovrastante la tazza ottico (bianco, regione non pigmentato) dell&#39;occhio, raccogliendo da destra a sinistra. Molto rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto pigmentato situato all&#39;interno della coppa ottica, facendo attenzione a non forare il fondo o distruggere i confini della coppa ottica. <ol><li> Se il verme è stato sulla carta da filtro per&gt; 1-2 min in qualsiasi momento durante la procedura, aggiungere una goccia di acqua verme per reidratare il verme. NOTA: La disidratazione aumenta la suscettibilità del verme a lesioni ripping. </li></ol></li><li> Ripetere passaggio 3.3 finché tutti i tessuti pigmentati neri (cellule pigmento), così come tutti i tessuti bianchi della coppa ottica (dendriti dei fotorecettori), vengono rimossi. Rimuovere tessuti asportati bloccato fino alla fine dell&#39;ago con attenzione strofinando con un tessuto wipe. Se doppio Abla occhiozione è desiderato, ablazione del secondo occhio a questo punto. NOTA: Per evitare lesioni, aghi può essere pulito afferrando l&#39;ago con un panno pulito wipe tenuto con il pollice e l&#39;indice, poi con l&#39;altra mano per tirare l&#39;ago attraverso la spazzare via dal pollice e l&#39;indice. In alternativa, l&#39;ago può essere pulito sulla superficie di un tessuto wipe ed esaminato per la pulizia. </li><li> Al termine, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare il verme ad un piatto etichetta contenente acqua verme fresca. Se l&#39;analisi dei dati gruppo mettere fino a 20 vermi in un singolo 100 millimetri piastra Petri. Se il monitoraggio rigenerazione negli stessi individui nel corso del tempo, mettere 1 verme in ciascun pozzetto di una 12-pozzetti. Una volta che tutti i vermi sono trasferiti, risciacquare vermi rimuovendo tutta l&#39;acqua verme dalle stoviglie / pozzetti e sostituendo con più acqua verme fresca. <ol><li> Per rimuovere i vermi dal filtro, ritardare l&#39;pipetta con una piccola quantità di acqua vite senza fine e rilasciare l&#39;acqua sulla vite senza fine. Questo dovrebbe alzare tegli verme fuori la carta da filtro, da subito risucchiato nella pipetta per il trasferimento. </li></ol></li><li> Incubare esperimenti a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) al riparo dalla luce e seguire il processo rigenerativo. NOTA: Worms possono essere memorizzati in un incubatore a temperatura controllata per mantenere una temperatura costante, ma ciò non è strettamente necessario. La maggior parte delle temperatura ambiente variano solo da + 5 ° C, che non alteri la capacità del verme di rigenerare. </li><li> Se lo si desidera, fissare vermi per immunoistochimica (vedi figure 3-4) e / o ibridizzazione in situ analisi dell&#39;espressione genica. Esistono diversi metodi di fissazione per immunoistochimica planarian 18, 19, 20 e ibridazione in situ 21, 22, 23 protocolli. </li><li> Quando gli esperimenti sono concluse, sacrifice vivere vermi mediante eliminazione di acqua verme dal piatto e sostituzione con etanolo al 70%. Incubare vermi per 3-5 minuti, controllando per i vermi per lisare e girare grigiastra. </li><li> Posizionare i vermi non trattati nel flusso dei rifiuti normali una volta sacrificato. Evitare di introdurre vermi vivi nell&#39;ambiente, in particolare le specie non indigene. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa tecnica di ablazione dell&#39;occhio migliora la metodologia correnti (come fori) escludendo tessuti cerebrali e limitando escissione principalmente ai tessuti oculari. Con la pratica, questa tecnica può essere eseguita dalla maggior parte degli individui, da tecnici esperti in microchirurgia per studenti universitari inesperti ma di coscienza. Si raccomanda che questa tecnica essere praticato molte volte prima di utilizzare ablazioni in esperimenti, inclusi (quando possibile) conferma della rimozione completa d...

Planarie sono un potente organismo modello per studiare la rigenerazione cellulare mediata staminali adulte. Questi platelminti acqua dolce non parassitarie possiedono la capacità di rigenerare qualsiasi e tutti i tessuti mancanti, tra loro sistema nervoso centrale e del cervello 1. Studiata fin 1700 2, progressi tecnologici nel campo planarian corso degli ultimi 10-15 anni (quali un genoma sequenziato, ibridazione in situ, immunoistochimica, interferenza RNA (RNAi), e trascrittomica) hanno aggiornato questo organismo modello storico . In particolare, planarie hanno recentemente guadagnato la popolarità come un modello emergente per la ricerca degli occhi 3. Planarians hanno occhi prototipici con solo due tipi di tessuto, i neuroni fotorecettori e cellule pigmentate; ciò ha permesso la caratterizzazione della sua popolazione dell&#39;occhio cellule staminali e dimostrato che molti degli stessi geni che regolano vertebrato occhio deluppo sono conservati in planarians 4, 5. Le coppe ottiche si trovano dorsalmente e comprende il bianco, dendriti dei neuroni non pigmentate fotorecettori e le cellule del pigmento nero semi-lunari, e gli occhi innervano il cervello attraverso un chiasma ottico. Oltre ad essere un modello per chiarire processi rigenerativi 6, l&#39;occhio planarian è adatto per studiare l&#39;evoluzione dei meccanismi visivi 7, risposte comportamentali alla luce (planarians visualizzare fototassi negativo) 8, e la base neurologiche del comportamento 9. Rigenerazione oculare planarians è stato ampiamente studiato in due contesti principali: come parte della rigenerazione testa dopo decapitazione 4, 10, e dopo l&#39;asportazione di soli tessuti oculari 11, 12 </sup&gt;. La maggior parte degli studi sulla rigenerazione planaria occhi hanno usato il metodo di decapitazione, in quanto è semplice e lineare. Il metodo escissione occhio planarian più comune è stato finora tramite perforazione con un tubo capillare vetro sottile 13, 14, anche se alcuni studi hanno anche eseguito amputazioni appena dietro gli occhi (decapitazione parziale) 15. Tuttavia, tutti questi metodi comportano la perdita di molti tessuti diversi solo l&#39;occhio (come il cervello, intestino, e nefridi), potenzialmente complicando l&#39;interpretazione dei risultati. Il protocollo ablazione occhio qui presentata limita escissione ai tessuti dell&#39;occhio (escludendo in particolare del cervello), con conseguente dati che sono più specifici per l&#39;occhio. Inoltre, a differenza di vermi decapitati che prendono 7-14 giorni per iniziare l&#39;alimentazione, occhio ablato vermi alimentare entro 24 h di ablazione 12, consentendo esperimenti RNAi (dove RNAi viene fornita mediante il cibo) da esibiràd contemporaneamente. Anche se l&#39;ablazione occhio è tecnicamente più difficile da eseguire con successo di decapitazione, gli studi in corso sulla escissione occhio non hanno incluso le istruzioni dettagliate sulle loro procedure. L&#39;obiettivo di questo articolo il video è quello di consentire ai ricercatori di rimuovere costantemente la coppa ottica planaria senza disturbare i tessuti cerebrali sottostanti e la rimozione come pochi altri tessuti come possibile. Questo metodo può essere utilizzato sia per singolo e doppio ablazione dell&#39;occhio ed è applicabile ad una vasta gamma di indagini. Come la maggior parte dosaggi di rigenerazione, l&#39;ablazione occhio è adatto per la combinazione con entrambi (RNAi) schermi farmacologiche e genetiche, così come studi comportamentali. Qui si descrivono i metodi per la gestione di vermi, il mantenimento di una colonia planaria, e la tecnica di ablazione occhio stesso.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean sea salts</td><td>Spectrum Brands&amp;nbsp;</td><td>SS15-10</td><td>&quot;10 Gallon&quot; box&amp;nbsp; (net weight 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4.5 x 8.5 in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 filter paper</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Circles, 125 mm diameter, white</td></tr><tr><td>Easy Touch Insulin syringe (with needle)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&amp;nbsp;U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&amp;nbsp; forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, straight tip , 11 cm</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&amp;nbsp;</td><td>Samco Scientific&amp;nbsp;</td><td>225</td><td>Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile</td></tr><tr><td>Parafilm M paraffin film</td><td>Brand&amp;nbsp;</td><td>701606</td><td>&amp;nbsp;4 in x 125 ft roll</td></tr><tr><td>12-well untreated tissue culture plate</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand</td></tr><tr><td>Plastic food containers (for colony)&amp;nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Large rectangle</td><td>2.25 qt (2.12 L), 10&quot; x 6 -3/4 &quot; x 3 -3/16&quot;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Girardia tigrina&lt;/em&gt;)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Sold as &quot;Brown&quot; Planaria; most often they are &lt;em&gt;G. tigrina&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia tigrina&lt;/em&gt;), but sometimes are &lt;em&gt;G. dorotocephala&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia dorotocephala&lt;/em&gt;); either will work.</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Schmidtea mediterranea&lt;/em&gt;)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>&lt;em&gt;S. mediterranea&lt;/em&gt; are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.</td></tr><tr><td>Brown paper towels&amp;nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8&quot; 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td></tr><tr><td>Wash bottle (for worm water), optional</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL</td></tr><tr><td>Anti-synapsin antibody, optional</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>Anti-arrestin antibody, optional</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&amp;nbsp; polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Custom Peltier plate, optional</td><td>Williams Machine, Foxboro, MA&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:&amp;nbsp; Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;).&amp;nbsp; The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is&amp;nbsp; &quot;anchored&quot; to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a &quot;foot&quot; that fits into the opening of your microscope&#039;s base plate.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DC power source (for Peltier plate), optional</td><td>B &amp;amp; K Precision</td><td>1665</td><td>Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.</td></tr><tr><td>Other common supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blade&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope with gooseneck lighting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chopstick rests, optional</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians

Nello studio di cellule staminali adulte e meccanismi rigenerativi, platelminti planarian sono una graffetta nel sistema modello in vivo. Ciò è dovuto in gran parte alla loro abbondante popolazione di cellule staminali pluripotenti e la capacità di rigenerare tutti i tipi di cellule e tessuti dopo lesioni che sarebbe catastrofico per la maggior parte degli animali. Recentemente, planarie hanno guadagnato popolarità come modello per la rigenerazione degli occhi. La loro capacità di rigenerare l&#39;intero occhio (composto da due tipi di tessuto: cellule pigmento e fotorecettori) consente la dissezione dei meccanismi che regolano la rigenerazione del sistema visivo. ablazione occhio ha diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche (come decapitazione o fori) per l&#39;esame percorsi e meccanismi specifici occhio, il più importante dei quali è che la rigenerazione è in gran parte limitato ai soli tessuti dell&#39;occhio. Lo scopo di questo articolo il video è quello di dimostrare come rimuovere in modo affidabile la coppa ottica planarian senza disturbare il cervello o tessuti circostanti.Movimentazione di vermi e manutenzione di una colonia stabilita viene anche descritto. Questa tecnica utilizza un 31 G, ago da insulina da 5/16 pollici per raccogliere chirurgicamente la coppa ottica di planarians immobilizzati su un piatto freddo. Questo metodo comprende sia singola e doppia ablazione dell&#39;occhio, con gli occhi rigeneranti entro 1-2 settimane, consentendo una vasta gamma di applicazioni. In particolare, questa tecnica di ablazione può essere facilmente combinato con (RNA interference) schermi farmacologici e genetici per una migliore comprensione dei meccanismi rigenerativi e loro evoluzione, cellule staminali occhio e la loro manutenzione e risposte comportamentali phototaxic e la loro base neurologica.

Per la prima post chirurgia 1-2 h, animali possono esibire movimento è diminuito rispetto ai vermi intatti (tuttavia essi sposteranno comunque). Se lo si desidera, vermi mangiare entro 24 ore di chirurgia (per esempio, per l&#39;alimentazione RNAi). Quando si segue la rigenerazione degli occhi negli stessi individui nel corso del tempo, assicuratevi di prendere una fotografia di ciascuna vite senza fine sia prima dell&#39;intervento chirurgico (intatto) e al 1 ore dopo l&#39;ablazione (...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians at JoVE.com

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Questo protocollo mostra come ad accisa in modo coerente gli occhi planaria (tazze ottica) senza disturbare i tessuti circostanti. L&#39;utilizzo di un ago da insulina e la siringa, uno o entrambi gli occhi possono essere ablato per facilitare le indagini i meccanismi che regolano la rigenerazione degli occhi, l&#39;evoluzione della rigenerazione visiva, e le basi neurali del comportamento indotto dalla luce.

Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

surgical-ablation-assay-for-studying-eye-regeneration-in-planarians

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K Views.  Western Michigan University.  Questo protocollo mostra come ad accisa in modo coerente gli occhi planaria (tazze ottica) senza disturbare i tessuti circostanti. L'utilizzo di un ago da insulina e la siringa, uno o entrambi gli occhi possono essere ablato per facilitare le indagini i meccanismi che regolano la rigenerazione degli occhi, l'evoluzione della rigenerazione visiva, e le basi neurali del comportamento indotto dalla luce. 

Video: Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Un'analisi planaria di Motility per misurare le proprietà biomodulanti dei prodotti naturali

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biochimica

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Biologia

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Neuroscienze

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...