이 연구는 JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, 이다 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 파일럿 PJ, 그리고는 로버트와 제 니스 맥 네 어 재단에 의해 투자 되었다.
우리는 산드라 페 냐와 Andrene 맥도날드 환자 모집, 새뮤얼 블 럼 박사 조지 Makedonas 항 체 및 제어 PCR 최적화에 사용 하는 DNA의 선물에 대 한 기술 지원에 대 한 감사.

1. 관심의 T 세포 인구를 식별.
 참고: 항 원 자극에 대 한 응답에서 그들의 확산을 기반으로 항 원 (Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르, CFSE) 처럼 세포 분열 염료와 함께에서 특정 확산 T 세포를 분리 사용할 수 있습니다. PBMCs에서 시작 하는 경우 7 일에서 체 외에 확장은 항 원 특정 CFSE 낮은 인구 12를 식별 하기 위해 충분 해야 한다.
<ol><li>믹스 PBMCs 일치 하는 MHC 피더 세포와 라벨 5 µ M CFSE 세포 분열 염료와 1:1.</li>
	<li>접시 2-2.5 x 10 5 셀 잘 당 96 잘 라운드-하단에 문화 접시 200 µ L 10 %FCS 완전 한 RPMI 미디어에. 
	참고: 완전 한 RPMI 포함 2 m m l-글루타민, 나트륨 pyruvate 1 m m, 100 µ M MEM 불필요 한 아미노산, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 2-mercaptoethanol의 단위, 100ml U &#8722; 1 페니실린과 100 µ g mL &#8722; 1 스.</li>
	<li>25 µ M 펩 티 드 항 원 가진 세포를 자극.</li>
	<li>문화의 4 번째 날에 신중 하 게 제거 하 고 대체 미디어의 100 µ L. 
	참고: T 세포 항 원 특정 식별에 대 한 더 최적의 접근 펩 티 드-HLA tetramers 13의 사용 이다. HLA-제한 뿐 아니라 항 원 특이성의 동시 평가 허용 tetramer 얼룩.</li>
</ol> 2. 단일 셀 정렬 설정.
<ol><li>수행 후드 또는 지정 된 영역에서 모든 절차는 증폭 된 서식 파일의 무료. Aliquot을 피하기 위해 오염, 시 약 모든 작업 표면 청소 및, 경우, 10%와 장비 PCR 설치 전에 표 백제. 사용 하 여 필터 팁, RNAse와 DNAse 무료 시 약 및 모든 PCR 및 벡터 클로닝 단계에서 플라스틱. 주요 시 약 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다. 
	참고: 다중 PCR 반응이 매우 민감한 및 오염 물질의 낮은 수준이 증폭된 제품에서 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>생성 10 RT 반응 배를 결합 하 여 반전 녹음 방송 마스터 믹스 버퍼, 25 X DNTPs, 9 U RT 효소, 0.01 %0.7 U RNAse 억제제, 트리톤 X 383 및 살 균 pipetting 저수지에서 (표 1에 나열 된) 각 RT TCR 뇌관의 nM. 각 96 잘 접시 메이크업 10 추가 반응 (전체 106)에 대 한 충분 한 마스터 믹스 pipetting 동안 액체의 손실에 대 한 보상. 반응의 구성 요소와 잘 당 금액 표 2를 참조 하십시오.</li>
	<li>준비 96 잘 PCR 컬렉션 플레이트 멀티 채널 피 펫 잘 당 반전 녹음 방송 마스터 믹스의 pipetting 6 µ L에 의해 정렬 셀. 얼음 이나 차가운 블록 플레이트를 유지.</li>
	<li>세포 표면 마커 (등 CD4, CD3, 또는 CD8 CD3, 각각 2 µ g/mL, 세포 분열 염료 또는 tetramer 얼룩이 함께)에 항 체와 함께 셀 라벨.</li>
	<li>정렬 T 세포에서 셀 음, 부정적인 컨트롤 될 것입니다 12 행을 건너뛰는 당. 
	참고: 정렬의 효율성 뿐만 아니라 셀과 cDNA 반응 전에 낮은 온도에 번호판 플레이트 홀더 내의 정확한 컬렉션 판 정렬에 따라 달라 집니다. 컬렉션 접시 보관 한다 얼음에 항상 제외 하 고 정렬 때 냉각 플레이트 내에서 해결 하는 동안. 모든 종류로 온도 조절된 플레이트 홀더; 장착 그러나, 하나의 사용이 좋습니다. 종류는 일반적으로 접시 당 약 10-15 분 소요, 이후 있다 RNA 저하에 대 한 증가 잠재력 접시 낮은 온도에서 유지 되지 않습니다.</li>
	<li>긍정적인 컨트롤로 추가 (100 셀)의 많은 수 수동으로 피 펫과 우물 중 하나를이 단계에서. 또는, 이전 절연 풀링된 세포에서 RNA에서 사용하실 수 있는 긍정적인 제어로 10 ng 잘 당. 
	참고: 정화 제어 RNA 정밀 플라스틱 및 다른 우물과 거짓 긍정적인 결과의 상호 오염을 피하기 위하여 신경.</li>
	<li>접착제 필름, 격판덮개 및 4에서 5 분 동안 1000 x g에서 스핀 다운 ° c.</li>
	<li>즉시 녹음 RNA cDNA를 10 분, 45 분 동안 37 ° C에서 25 ° C에서 접시를 배양 하 여 10 분에 85 ° c 
	참고: 효율적인 PCR 반응 되도록 첫 번째 PCR 반응 같은 날 수행 될 것이 좋습니다. 또는, 베낀된 접시 보관 하실 수 있습니다-80 ° C에서 최대 2 개월.</li>
</ol> 3. 멀티플렉스 중첩 PCR 수행 참고: 오염을 피하기 위하여 템플릿-무료 깨끗 한 지역에서 모든 마스터 믹스 준비.
<ol>각 reconstitute <li>가변 지역 뇌관 DNAse과 RNAse 무료 H 2 o. 100 µ M 다음, 20 µ L V-알파 뇌관 풀 생성 하 44 뇌관의 각각의 결합. V-베타 생성 뇌관 풀 20 µ L 40 V-베타 뇌관의 각각 플러스 DNAse과 RNAse 무료 H 2 o. 뇌관 순서는 표 1에 나와 있습니다 80 µ L의 결합. 풀링, 일단 믹스에 각 뇌관의 농도 2.3 µ M.</li>
	<li>DNAse 100 µ M 재고 솔루션을 일정 지역 뇌관 reconstitute 자유롭고 RNAse H 2 o. Dilute 10 µ M 작업 솔루션을 사용 하기 위해 약 수 상수 지역 뇌관.</li>
	<li>는 TCR 알파와 베타 TCR 확대를 위한 두 개의 별도 마스터 믹스를 준비합니다. 5 X를 결합 하 여 믹스 마스터를 생성, 80 µ M dNTPs, 3 %DMSO, 2 µ M 뇌관 수영장 버퍼 (46의 최종 농도 각 뇌관에 대 한 nM), 200 nM TCR 상수 지역 역 뇌관, 1 U DNA 중 합 효소, 그리고 DNAse과 RNAse 무료 H 2 O (표 2 < / >). Pipetting 동안 액체의 손실을 보상 하기 위해 10 추가 반응 (전체 106)에 대 한 충분 한 마스터 믹스 메이크업 각 96 잘 접시. 
	참고: 계산 기반 22.5 µ L 마스터 PCR 혼합 2.5 µ L cDNA 서식 파일을 함께 잘 당 25 µ L의 최종 PCR 볼륨.</li>
	<li>얼음 또는 차가운 블록에서 cDNA와 플레이트를 유지합니다. 멀티 채널을 사용 하 여 새로운 96-잘 PCR 격판덮개로 TCR 베타 반응의 22.5 µ L 플라스틱. 다음 PCR 접시에 cDNA의 2.5 µ L를 전송 하는 멀티 채널을 사용 하 여.</li>
	<li>는 멀티 채널을 사용 하 여 포함 하는 cDNA의 나머지 접시에 직접 TCR 알파 반응의 22.5 µ L 플라스틱.</li>
	<li>4 1000 x g 5 분에서 내려와 접착제, 부드럽게 소용돌이, 스핀 번호판 봉인 ° c.</li>
	<li>멀티플렉스 PCR 반응 다음 사이클 실행: 95 ° C에서 5 분 뒤에 20의 34 주기 s 95 ° C, 30에서 54 ° c, s 및 72 ° C에서 1 분 72에 7 분 뒤 ° c.</li>
	멀티플렉스 PCR 혼합물의 2.5 µ L를 사용 하 여 템플릿으로 <li>수행 25의 마지막 볼륨에 중첩 된 PCR 반응 밖으로 µ L
	<ol><li>100 µ m와 DNAse과 RNAse 무료 H 2 o. 확인 10 µ M aliquots 작업 사진에 대 한 내부와 어댑터 뇌관 reconstitute.</li>
		<li>는 TCR 알파와 베타 TCR ampl에 대 한 두 개의 별도 마스터 믹스를 준비ification입니다. 믹스 5 버퍼 25 X DNTP, 3 %DMSO, 200 nM 앞으로 어댑터 뇌관, 200 nM 역 중첩 된 뇌관, 1 U DNA 중 합 효소와 DNA 중 합 효소, nuclease 무료 H X 22.5 µ L (표 2)의 최종 볼륨에 대 한 2 O. 에 대 한 각 96 잘 접시 메이크업 10 추가 반응 (전체 106)에 대 한 충분 한 마스터 믹스 pipetting 동안 액체의 손실에 대 한 보상. 
		참고: 두 번째 PCR 반응 사용에서 5 X PCR 버퍼 agarose 젤 로드를 촉진 하기 위하여 포함 된 로드 염료.</li>
		<li>는 멀티 채널을 사용 하 여 두 개의 새로운 96-잘 PCR 접시에 잘 당 22.5 µ L에서 TCR 알파와 TCR 베타 반응에 대 한 마스터 믹스 플라스틱.</li>
		<li>잘 당 2.5 µ L에서 다중 PCR 반응 템플릿 추가. 
		참고: 나머지 첫 번째 PCR 반응 해야 봉인, 하 고 필요한 경우 추가 서식 파일의 원본으로-20 ° C에 저장 (4.3 참고 단계 참조).</li>
		<li>인감 플레이트, 부드럽게 소용돌이, 그리고 스핀 다운 1000 x g 5 분에서 4 ° c.</li>
		<li>중첩된 PCR 반응 다음 사이클 실행: 95 ° C에서 5 분 뒤에 20의 34 주기 95 ° C, 30에서 s s 56 ° C에서 72 ° C에서 1 분에 72 7 분 다음 ° c.</li>
		<li>1 %agarose 밖으로 최종 반응의 실행 5 µ L 젤 포함 ethidium 평범한 사람 (를 포함 하 여 부정과 긍정적인 제어 우물). 
		참고: 예상된 밴드는 약 500 bp 크기에서 실행 해야 합니다. 예제 반응을 그림 2에 표시 됩니다.</li>
		<li>96 잘 형식 PCR 정화 키트를 사용 하 여 두 번째 반응 (20 µ L)의 나머지를 정화 하 고 70 ° C H 2 O 잘, 당 15 µ L 함께 elute 하 고, 수행 생어 시퀀싱. 적절 한 TCR 알파 또는 베타 TCR 어댑터 앞으로 뇌관을 사용 하 여 시퀀싱 (표 1). 
		참고: 시퀀스는 온라인 사용 가능한 immunogenetics 소프트웨어와 함께 분석할 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 4. 알파와 베타 PCR 체인 하위 복제.
 참고: 첫 번째 반응에서 앞으로 프라이 머 및 두 번째 PCR 반응에서 역방향 뇌관의 풀 제한 사이트를 통합 하는 데 사용 됩니다. 따라서, 얻은 알파와 베타 체인 PCR 제품은 순차적으로 하위 템플릿 retroviral 벡터 ( 그림 1)에 복제 될 준비가.
베타에서 <ol><li>다이제스트 순화 PCR 제품 중첩 반응 BstbI와 MfeI (표 3). 
	참고: 5 µ g 삽입을 초과 하지 마십시오.</li>
	<li>병렬로 소화 BstbI와 MfeI (표 3) 서식 파일 벡터. TCR 당 서식 파일 벡터의 1-2 µ g를 사용 합니다. Agarose 젤에 소화 벡터를 실행 하 고 큰 밴드 (~ 7500 bp)를 분리 합니다. DNA 정제 키트 젤 벡터 정화. 
	참고: 제한 효소 다이제스트 동안 템플릿 murine TCR 베타 변수 지역의 제거 되 인간의 TCR 베타 변수 영역의 추가 대 한 허용.</li>
	<li>PCR 정화 키트를 사용 하 여 소화 PCR 제품을 정화. 
	참고: 확인; 키트에 포함 된 열의 DNA 정화 능력 여러 열을 사용 하 여 필요한 경우. 순화 삽입 성공적인 결 찰 반응에 필요한 최소 금액은 50 ng 10 ng / µ L의 최소 농도에. 순화 삽입 금액 성공적인 결 찰에 대 한 충분 하지 않은 경우 두 번째 PCR 반응을 반복 될 수 있다.</li>
	<li>열 비활성화 75에서 10 분 뒤 각자 결 찰을 방지 하기 위해 37 ° C에서 10 U CIP 효소 1 h에 대 한 서식 파일 벡터 치료 ° C. Purify DNA PCR 정화 키트 (표 3).</li>
	<li>Ligate TCR-베타 삽입 하 고 실 온에서 30 분 동안 삽입의 6 어 금 니 과잉에서 20 µ L 총 볼륨에 DNA 리가 사용 하 여 벡터. 
	참고: 총, 결 찰 반응 해야 포함 약 150 ng의 DNA (표 3).</li>
	<li>변환, 화학적으로 유능한 대장균 DH5α 세포 (자료 테이블)의 80 µ L로 결 찰 반응의 8 µ L를 혼합 하 고 30 분 45 미 추가 500 µ L 42 ° C에서 열 충격에 대 한 얼음에 품 어 슈퍼 Catabolite 억제 (S.O.C.) 매체와 쉐이크 1.5 h 37에 대 한 최적의 국물 ° c.</li>
	<li>판 250 개 µ L 세균성 문화 Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지를 포함 하는 암 피 실린에의. 하룻밤 플레이트 (~ 16 h) 37 품 어 ° c.</li>
	<li>다음날 세균성 식민지를 선택 하 고 3 mL 파운드 매체 암 피 실린을 포함 하는 것은 하룻밤 사이에 그들을 자라. DNA 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 플라스 미드 DNA 분리.</li>
	<li>는 BstbI 및 MfeI 금지 효소로 소규모 테스트 다이제스트 베타 체인의 성공적인 삽입을 확인합니다. 12 µ L 총 반응 볼륨에 결합 200-500 µ g 플라스 미드 DNA, 각 효소의 0.25 µ L 10 X 효소 버퍼 (표 3). Ethidium 평범한 사람 삽입 밴드의 크기를 확인 하려면 포함 하는 1 %agarose 젤에 반응 밖으로 실행 (~ 500 bp).</li>
	<li>IRES 역방향 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 벡터의 TCR 베타 섹션 순서는 삽입의 존재를 확인 한 후.</li>
	<li>알파 변수 영역의 삽입에 대 한 비슷한 프로세스를 수행 하는 TCR-베타 삽입의 시퀀스 확인. 알파 중첩 된 반응, 그리고 벡터, SnaBI와 SacII를 포함 하는 새로 생성 된 TCR 베타 삽입에서 순화 된 PCR 제품을 소화. 
	참고: 제한 효소 다이제스트 동안 템플릿 murine TCR 알파 변수 지역의 제거 인간의 TCR 알파 변수 영역의 추가 대 한 허용.</li>
	<li>Ligate 알파 실 온에서 30 분 동안 삽입의 6 어 금 니 과잉에서 20 µ L 총 볼륨에 DNA 리가 사용 하 여 해당 베타 가변 영역을 인코딩 하는 TCR 벡터에 삽입. 
	참고: 총, 결 찰 반응 해야 포함 약 150 ng의 DNA (표 3).</li>
	<li>변환, 화학적으로 유능한 대장균 DH5α 세포 (자료 테이블)의 80 µ L로 결 찰 반응의 8 µ L를 혼합 하 고 30 분 45 미 추가 500 µ L S.O.C. 42 ° C에서 열 충격에 대 한 얼음에 품 어 매체와 쉐이크 1.5 h 37에 대 한 ° C.</li>
	<li>판 250 개 µ L 세균성 문화 Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지를 포함 하는 암 피 실린에의. 하룻밤 플레이트 (~ 16 h) 37 품 어 ° c.</li>
	<li>다음날 세균성 식민지를 선택 하 고 3 mL 파운드 매체 암 피 실린을 포함 하는 것은 하룻밤 사이에 그들을 자라. DNA 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 플라스 미드 DNA 분리.</li>
	<li>소규모 테스트-다이제스트 제한 효소 SnaBI 및 SacII 알파 체인의 성공적인 삽입을 확인합니다. 12 µ L 총 반응 볼륨에 결합 200-500 µ g 플라스 미드 DNA, 각 효소의 0.25 µ L 10 x 효소 버퍼 (표 3). Ethidium 평범한 사람 삽입 밴드의 크기를 확인 하려면 포함 하는 1 %agarose 젤에 반응 밖으로 실행 (~ 500 bp).</li>
	<li>삽입의 존재를 확인 한 후 MSCV2 앞으로 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 벡터의 TCR 알파 섹션 순서.</li>
	<li>알파 체인 시퀀스의 유효성을 검사 하는 일단 TCR-베타-리버스 및 IRES 반전 뇌관 (표 1) 연속 완전 한 TCR 삽입 확인 합니다.</li>
</ol> 5. TCR 세포 표면 표현 및 특이성을 확인 합니다.
 참고: HEK293T 셀 성공적인 TCR 체인 커플을 테스트 하는 데 사용 됩니다ng와 세포 표면 식 ( 그림 3A) 8. 펩 티 드 MHC tetramer 얼룩도 수행할 수 있습니다 transfected HEK293T 세포 항 원 특이성 게시물 TCR 유전자 분리 ( 그림 3B)의 보존에 대 한 테스트.
각 새로운 TCR에 대 한 별도 우물을 지정 충분 한 세포 <ol><li>접시 당 1 mL 전체 DMEM 미디어 포함 5 %FCS, 잘 1 x 10 5 셀에서 12 음 조직 문화 접시와 문화 37에서 하룻밤에 HEK293T 세포 ° C. 접시 컨트롤 템플릿 TCR 벡터, CD3 벡터만, TCR 벡터, 그리고 비 페를 잘 제어. 
	참고: 템플릿 사용 하 여 완전히 마우스 TCR Transfection mCD3εγδζ pMIG 벡터, 혼자, mTCR pMIA 벡터와 결합에서 (mTCR-pMIA) 벡터와 mCD3εγδζ pMIG 벡터 혼자 긍정적이 고 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 
	참고: 완전 한 DMEM 포함 2 m L-글루타민, 1mm 나트륨 Pyruvate, 100 µ M m 비 필수 아미노산, 5 mM HEPES 버퍼, 10 -5 단위 2-mercaptoethanol, 100 U/ml 페니실린/스 x 5.5.</li>
	<li>다음 날 transfect 1 µ g 공상 h/mTCR-pMIA 벡터, 1 µ g 마우스 CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) 벡터와 liposome에 기초를 둔 transfection 시 약 제조업체 지침에 따라 셀.</li>
	<li>각 TCR 100 µ L 실내 온도, 혈 청 무료 DMEM 6 µ L transfection 시 약 추가. 짧게 소용돌이, 15 분에 대 한 실 온에서 품 어와</li>
	<li>별도 1.5 ml에서 튜브 결합 TCR pMIA 벡터의 1 µ g 1 µ g 마우스 CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) 벡터, 또는 컨트롤에 대 한 별도 각 벡터의 1 µ g.</li>
	<li>Dropwise, 벡터 DNA를 포함 하는 튜브를 transfection 시 약/DMEM 솔루션을 추가 합니다. 15 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>Dropwise, HEK293T 세포 transfection 시 약/DMEM/DNA 솔루션을 추가 합니다. 부드럽게 섞어 접시를 누릅니다. 24 h. 위해 37 ° C에서 품 어</li>
	<li>후 24 h는 미디어를 대체 하 고 셀 추가 24 헤에 대 한 문화를 유지</li>
	<li>활기찬 pipetting으로 접시에서 셀을 제거 하 고 얼룩 방지 마우스 CD3 항 체 (2.5 µ g/mL) 공상 TCR의 표면 표현 cytometry에 의해 확인 된 셀.</li>
	<li>CD3 식 비슷한 수준, transfected 있던 세포 사이 비교 하기 위해 게이트 형광 기자 분자 (GFP, 복잡 한 c d 3에 대 한 그리고 TCR 식 벡터에 대 한 애)의 비슷한 높은 수준을 표현 하는 셀에 대 한 분석. GFP + 애 + 10 셀에 분석 해야 문이 하는 최적, 10 5 형광 강도 ( 그림 3A) 4. 
	참고: 공상 구조와 페 셀에서 CD3 식의 수준 컨트롤 마우스 (원래 템플릿) 벡터 ( 그림 3A)를 비교 해야 합니다. 생성 된 TCR retroviral 벡터는 앞에서 설명한 4 식 시스템 vivo에서 호환.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision.">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li><li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+fate+and+intense+debate:+myths,+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice.">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li><li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+naive+CD4++T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection.">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li><li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice.">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li><li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated,+cell-autonomous+event.">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li><li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice.">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li><li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days.">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+'self-cleaving'+2A+peptide-based+retroviral+vector.">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+retrogenic+mice:+a+rapid,+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice.">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li><li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice.">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li><li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity.">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li><li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice.">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice:+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer.">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li></ol>

저자는 공개 없다.

현재 프로토콜에서 우리가 단일 셀 TCR 증폭 및 후속 하위 복제 쌍된 TCR 알파와 베타 체인의 템플릿 retroviral 식 벡터에 대 한 효율적인 방법을 설명 합니다. 비록, 여러 단 세포 PCR 프로토콜을 개발 하 고, 아무도 지금까지 있다 식 벡터에 즉시 하위 복제와 호환. 대부분의 경우, 높은 변수 CDR3 영역을 포괄 하는 부분 시퀀스는 증폭, 변수 영역을 추정 하는 것 충분 한 순서. 이 작은 PCR 제품 크기 높은 P...

T 세포 수용 체 (TCR) T 세포 운명 결정 개발, 안정 상태/항상성, 그리고 주변1,2,3항 원 자극 동안 지시. 깊은 기술을 시퀀싱의 최근 확장 이전 받는 TCR 다양성 내의 항 원 특정 한 T 세포 응답을 발견 했다. TCR 다양성 기능적으로 광범위 한 T 세포 응답에 대 한 잠재력을 제안합니다. TCR 시퀀스 레 퍼 토리 분석 TCR 기능적인 분석 실험, 통합 하려면 시퀀싱 방법 실험 시스템과 vivo 모델 선택의 후속 기능 분석에 대 한 활용에 호환 되도록 설계 되어야 한다 TCRs입니다. 우리 인간의 TCR 시퀀스 격리에 대 한 효율적인 접근 방식을 개발 하 고 하위 TCR 식 HLA humanized 쥐4와 호환 공상 인간/마우스 TCR 서식 파일 벡터에 클로닝 간소화. Heterodimeric TCRs의 해당 알파와 베타 체인의 절연 단일 셀에서 두 체인의 PCR 증폭을 해야합니다. 비록, 여러 단일 셀 TCR 복제 프로토콜 개발 되 고 활용, 아무도 지금까지 있다 높은 처리량 유선형 직접 복제의 알 수 없는 Vα/Vβ TCRs retroviral 벡터 재 식 vivo에서 필요한에 쉽게 호환 4,5,,67. 이전 연구 두 가지 주요 방법, 선택적으로 시퀀스를 추정 하거나 전체 TCR 시퀀스4,,56 증폭 충분 한 TCR의 일정된 부분을 증폭에 활용 , 7. 첫 번째 접근 방식을 통해 얻은 TCR 시퀀스의 하류 기능 분석 필요 비용 실리콘에 어셈블리와 드 노 보 의 건설에 TCR의. 두 번째 방법은 제공 하지만 완전 한 TCR 순서, 인간의 지속적인 지역 마우스 모델에서 복제 TCRs의 비보에 식이 호환 되지 않습니다. 우리의 접근 방식은 특히 vivo에서 기능 분석 TCRs의 마우스 모델에서 호환 되도록 설계 되었습니다. 우리는 효율적이 고 간소화 된 단일 셀 직접 서브 클로닝 PCR 파편의 템플릿 식 벡터에 대 한 수 PCR 프로토콜을 개발.
우리의 접근 방식을 매우 민감한 멀티 플렉스 중첩 PCR 반응이 두 단계에서 수행 되는 사용 합니다. 첫 번째 다중 반응에서 40 뇌관 모든 V 베타 체인에 대 한 특정의 수영장과 44 뇌관 V-알파 사슬 TCR 알파 또는 베타 TCR 시퀀스 (표 1)의 사전 지식 없이 증폭 하는 데 사용 됩니다 모든 특정의 수영장 단계. 앞으로 뇌관에는 5' PCR 제품의 통합 어댑터 시퀀스를 있다. 반전 뇌관 TCR의 일정 영역을 기반으로 합니다. 우리가 확인 독특한 제한 사이트 인간의 변수 또는 접합 TCR 지역에서 결 석 하 고 새로 디자인 된 TCRα 및 TCRβ 뇌관 (그림 1)에이 통합. 두 번째 중첩 된 반응에서 어댑터 시퀀스에 대 한 특정 뇌관 및 일정 지역 내에서 중첩 된 역방향 뇌관 TCR 체인으로 증가 (표 1, 그림 1) 증폭에 사용 됩니다. 단일 셀 격리 후 PCR의 라운드 2 (첫 번째 반응 Vα와 Vβ 뇌관의 풀과 함께 두 번째 어댑터 뇌관) 수 직접 하위 복제 될 템플릿 retroviral 벡터에 PCR 제품에서 결과. 단 하나 열려있는 독서 프레임 (ORF), 마우스 일정 지역 '자체 cleaving' 단백질 순서에 의해 연결 된와 함께 인간의 변수 영역에에서 최종 TCR 구문 인코딩할 것 이다 P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A 시퀀스 여러 시스템에서 사용 되 고 특히 TCRs8,9,,1011의 표현에 대 한 광범위 하 게 테스트 되었습니다. 비록, P2A 시퀀스 남아의 대부분에 연결 후 번역의 알파 사슬의 베타 체인 신호 순서는 추가 프롤린,이 수정 유연한 링커로 연결 C terminus는 TCR 기능에 해로운 영향을 주지 않습니다. 마우스 일정 지역 하류 신호 구성 요소와 잠재적인 변경된 상호 작용을 피하기 위해 인간 대신 구문에 사용 됩니다 때 다시 마우스 세포에 표현. 단일 ORF 알파와 베타 체인9,11의 화학 량 론 별도 식에서 발생 합니다. 현재 프로토콜 시 약 및 널리 사용할 수 있는, 접근에 근거 하 고 간소 하 고 효율적인 방식으로 수행 하도록 설계 되었습니다. 비록 우리가 구체적으로 TCRs self-reactive T 세포 자가 면역 당뇨병에 연루에서 분석 결과를이 기술을 사용, 우리는이 프로토콜 식별 및 인간의 TCRs 대 한 특정의 기능 평가 대 한 광범위 하 게 적용 될 수 있습니다 예상 면역 epitopes, 암 epitopes, 또는 병원 균 및 백신에 대 한 응답.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">CFSE&#160;</td>
			<td style="width:148px;">eBioscience&#160;</td>
			<td style="width:116px;">65-0850-84</td>
			<td style="width:223px;">5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human CD4 (OKT4) BV421</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>317433</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>317336</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse CD3 AF647</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>100322</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-158</td>
			<td>0.7 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&#160;</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>4368814</td>
			<td>9 U (RT enzyme)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gotaq DNA polymerase 2500U</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PAM3008</td>
			<td>1 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well Half Skirt PCR Plate</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPX-96M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Clear Adhesive Film&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SnaBI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0130</td>
			<td>15 U (insert) 30 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacII</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0157</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MfeI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R3589S</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BstBI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0519</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Plus minipreps DNA purification systems&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>A1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Plus midipreps DNA purification systems&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>A7640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA clean &#38; concentrator-25 kit</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>11-304C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZR-96 DNA clean &#38; concentrator-5 kit</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>11-306A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)</td>
			<td>Mirus&#160;</td>
			<td>MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACS Aria II (sorter)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Fortessa (flow cytometer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs

단 T 세포에서 쌍체 T 세포 수용 체 (TCR) 알파와 베타 체인의 시퀀싱에 대 한 여러 가지 방법을 개발 되었습니다, 하지만 아무도 지금까지 왔다 TCR heterodimers의 기능 분석에 다운스트림 도움이 vivo에서 . 우리 인간의 TCR 알파와 베타 체인의 전체 변수 영역에 걸쳐 PCR 제품 귀착되는 2 단계 멀티 플렉스 중첩 PCR에 기반으로 하는 향상 된 프로토콜을 개발 했습니다. 식별 하는 고유한 제한 사이트 PCR 뇌관으로 그들을 통합 함으로써, 우리는 만들어 PCR 제품 템플릿 retroviral 벡터에 직접 하위 복제와 호환. 결과 retroviral 구조 공상 인간/마우스 TCR 마우스 셀에서 또는 vivo에서 마우스 모델에서 작동 되는 마우스 세포내 도메인으로 인코딩합니다. 전반적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 인간 단일 셀 쌍 TCR 알파와 베타 체인 식별 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 표현 위한 retroviral 벡터 쉽게 적응의 유선형된 세대와 결합 합니다. 중요 한 단계는 뒤 및 잠재적인 함정을 피할 수 있도록 비디오와 함께 제공 된 자료 PCR, 단일 셀의 매우 상세한 설명을 제공 하도록 설계 됩니다. 또한, 우리는 복제 식 벡터를 생성 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 일단 마스터, TCR 식 정렬 단일 셀에서 모든 절차는 짧은 2 주 기간에 수행 수 있습니다.

멀티플렉스 중첩 PCR 반응의 효율성 단계 3.2.7 (그림 2)는 agarose 젤에 두 번째 반응의 5µL에 밖으로 실행 하 여 확인 됩니다. 평균 TCR 베타 증폭의 효율 TCR 알파 반응의 효율은 일반적으로 낮은, 약 50%에서 80%, 약 될 것으로 예상 된다4. 만 쌍된 TCR 알파와 베타 TCR 사슬 TCR 식; 사용할 수 있습니다. 그러나, 모든 PCR 제품 TCR 시퀀스 및 레 퍼 ...

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Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

9.3K 조회수.  Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital. 단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.

비디오: Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

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마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서