Name: retroviral transduction of bone marrow progenitor cells to generate t-cell receptor retrogenic mice
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice at JoVE.com

Bu çalışma MLB, BCM&#39;deki Diyabet Araştırma Merkezi (P30-DK079638) Pilot / Fizibilite Programı, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA NIH (5K22A1119151-01 ve 1R56DK104903-01) hibe ile desteklenmiştir 1-15-JF-07, İmmünoloji MB Bursu ve Robert ve Janice McNair Vakfı&#39;nda AAI Kariyer.

Etik Beyanı: Her türlü çabayı ışınlama ve kuyruk ven enjeksiyonlar sırasında minimuma hayvan rahatsızlık veya stres tutmak için yapılır. Fareler Bu deneylerde hücre kaynağı olarak kullanılmaktadır; gibi herhangi bir usul veya manipülasyonlar ötanazi dışında bulunmaktadır. Fareler ölümü onaylamak için servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 inhalasyon yoluyla ötenazi yapılacaktır. Bu prosedür Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötanazi Paneli önerileri ile tutarlıdır. 1. retroviral Construct hazırlayın <ol><li> Alt klon T-hücre reseptör (TCR) alfa ve beta zincirleri, bir MSCV bazlı retroviral 11 vektörü (örneğin, pMIAII ya pMIGII) 11 içine, bir 2A bağlayıcı ile birbirlerinden ayrılmışlardır. Not: Şekil 2A bağlayıcı tek bir açık okuma çerçevesinden alfa ve beta TCR zincirlerinin stoikiometrik ve uygun ekspresyon için izin verir. Vektör için kullanılan bir IRES flöresanlı protein kaseti (Ametrine veya GFP) içerirtransduced hücreleri ve transdüksiyon etkinliğini izlemek. Ayrıntılı bir protokol için Holst ve ark bakın. 11 </li><li> ticari olarak elde plazma hazırlık kiti veya benzer bir ürün kullanarak plazmid DNA izole. 1. Bir çalışma konsantrasyonunu kullanarak - 2 ug ul 1. </li></ol> Retroviral Yapımcı Hücre Hatları 2. Nesil <ol><li> retroviral üretici hücre çizgileri oluşturmak için iki aşamalı bir işlem kullanmaktadır. NOT:. Detaylı bir protokolü için, Holst ve ark 11 görüntülemek için lütfen. <ol><li> Plasmidlerden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) ve ilgili 11 vektörü) ile 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon ile retrovirüs üretmek ve GP + E86 ekotropik retroviral üretici hücre çizgisi uyum sağlamak 293T hücrelerinden retroviral süpernatan alır. </li><li> FACS floresan ifade GP + E86 üretici hücrelerin üst% 40 izole edin ve virüs kaynağı olarak transdcuced-GP + E86 üretici hücreleri yaymak. NOT: nesilyüksek titre üretici kemik iliği hücrelerinin etkili transdüksiyonuyla için kritik öneme sahiptir. Tam bir protokol için Holst ve ark görüntülemek için lütfen. 11 </li></ol></li></ol> 3. Retrovirüs aracılı Kök Hücre Gen Transferi (Gün -5) <ol><li> % 10 (hacim / hacim) FBS, bu protokolün Gün 0, iki birleşik 150 mm tabak için yeterli bir büyüme sağlamak için dışarı çözülme ve bitmiş DMEM her da GP + E86 üretici hücre hattı kültürü 0.5 -1.0 x 10 6. Not: Çözülme 0.5 - da GP + E86 genişletmek için kültür 5 gün sağlayan bu 5. günde% 50 konfluansa - 10 cm plaka, her da GP + E86 üretici hücre hattı 1.0 x 10 6 30 sağlayacaktır Gün 0 iki konfluent 150 mm plakalara üretici hücre hatları. <ol><li> % 5 beyaz dana serumu ve mikoplazma kontaminasyonu önlemek için siprofloksasin (10 ug / ml) ihtiva eden, tam doku kültürü ortamında kültür retroviral üretici hücre hattı. NOT: generatin zaman siprofloksasin kullanımı durdurung, kemik iliği nakli için viral süpernatan. Bu olumsuz kemik iliği transdüksiyon etkinliğini etkileyecek şekilde, üretici hücre hattının aşırı büyüme kaçının. </li></ol></li></ol> 5-florourasil (5-FU) (gün-3) 4. enjekte donör farelerden <ol><li> Gerekli 5-FU miktarını belirlemek için - (12 haftalık 5) donör fareler tartılır. Düşük kemik iliği verim yaş sonuçlarının 5 hafta daha genç fareler kullanma. Tek TCR&#39;nin ekspresyonunu sağlamak için, örneğin, SCID, bez ya da TCR alfa kemik iliği vericisi olarak eksikliği olan farelerde bir T hücresi eksik fare suşu kullanın. </li><li> Doku kültürü kaputu çalışan 10 mg ml yeterli miktarda -1 vücut ağırlığının her bir gramı başına 0.15 mg 5-FU sunmak için 5-FU çalışma çözeltisi yapmak için steril PBS ile 5-FU stok seyreltin. </li><li> 37 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak, intraperitonal, verici bir fare başına vücut ağırlığının gramı başına 0.15 mg 5-FU enjekte edilir. NOT: Bir alıcı başına kullanın 1 donör fare başlatmak ve ayarlamak içinhücre verimi uygun donör fare sayısı. Kemik iliği progenitörlerin zenginleştirme ve izolasyonu için 5-FU tedavisi için alternatif bir yöntem, Viret ve diğerleri de tarif edildiği gibi soy pozitif hücrelerinin negatif seçim. </li></ol> 5. Kemik İliği Ekstraksiyon Prosedürü (Gün 0) <ol><li> Kemik izolasyonu için diseksiyon makas ve forseps edinin. 50 ml konik bir tüp içinde kemiklerin toplamak için ortamı (HBSS,% 5 FCS (hacim / hacim ile desteklenmiş)) hazırlayın. Buz üzerinde medya içeren 50 ml konik tutun. CO ölümü teyit etmek için servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon fareler Euthanize. Hiçbir refleksleri algılanmasını sağlamak üzere pençe sıkıştırın. </li><li> Cerrahi site ve etanol veya metanol ile cerrahi aletler sterilize. İlk keserek ve pelvis altında dikkatlice femur, tibia, humerus ve pelvik kuşak çıkarın. geri aşağı tibia femur boyunca kesin. temiz kemikleri elde etmek için makas ve forseps kullanarak tüm çevreleyen doku çıkarın. tutmakHBSS +% 5 (hacim / hacim) FBS içinde hidre kemikleri. </li><li> her ikisi de kemik uçları kesmeye emin, eklemlerde keserek kemikleri ayırın. HBSS +% 5 (hacim / hacim) ihtiva eden bir 10-ml şırınga FBS bağlanmış bir 25 gauge iğne takın. basınç uygulayın ve 50 ml&#39;lik bir konik bir 70 mikron süzgeç istirahat aracılığıyla tüm kemik iliği yıkayın. </li><li> Düzenli olarak, bir 1 ml veya 3 ml şırınga pistonu kullanarak 70 mikron filtre ile kemik iliği itin. HBSS +% 5 (hacim / hacim) FBS ile süzgeç durulayın. Bu kemik parçaları ve doku serbest olan tek bir hücre süspansiyonu sağlayacaktır. steril bir kaput prosedürü uygulayarak steril hücreleri tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin kemik iliği hücreleri. </li></ol> 6. Kemik İliği Kültürü (Gün 0) <ol><li> Durusu veya aspirat medya ve 50 ml konik tüp başına 1 ml amonyum klorür bazlı kırmızı kan lizis tamponu (veya RBC parçalama tamponu eşdeğeri) tekrar süspansiyon hücre pelet. oda sıcaklığında 1 dakika inkübasyondan sonra,Sıcaklık, bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 10 ml ilave edilerek kırmızı hücre lisis tampon söndürme. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. </li><li> Boşaltacaktır ya da 5 ml bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS aspire supernatant ve tekrar süspansiyon kemik iliği. Bir Neubauer sayım odası ile hücreleri saymak. Not: Genel verim olmalıdır yaklaşık 5 - fare başına x 10 6 hücre 10; Bununla birlikte, verim farelerin farklı türleri arasında değişebilir. </li><li> IL-3 ile desteklenmiş tam DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 30 ml, 150 mm plaka başına 4 x 10 7 hücre yoğunluğunda Plaka kemik iliği hücreleri (20 g mi-1), IL-6 (50 g mi -1) ve SCF (50 g mi -1). NOT: taze çözülmüş-aliquoted sitokinler kullanın. 2 haftadan daha uzun süreyle 4 ° C&#39;de donduruldu ve daha sonra daha fazla çözülmüş veya tutulmuştur sitokinleri kullanmayın. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece boyunca, kemik iliği (yaklaşık 24 saat) inkübe edin. </li></ol><ol><li> Levha 18 ml bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS 150 mm plaka başına 3 x 10 6 retroviral üretici hücreleri. </li><li> gece boyunca 37 ° C &#39;de retroviral üretici hücreleri inkübe edin. (- 3 donör fareler yaklaşık 2) 15 milyon kemik iliği hücreleri için bir 150 mm&#39;lik plaka tahmin ediyoruz. </li></ol> 8. retroviral süpernatan (Gün 1) <ol><li> Ertesi gün (yaklaşık 24 saat sonra), 10 ml&#39;lik şırınga ve filtre 0.45 kullanarak 150 mm plaka kapalı doğrudan retroviral süpernatant kadar çizerek (7. adımda kurmak) Üretici plakalarından retroviral süpernatant hasat -μm şırınga filtresi. </li><li> Itinalı bir şekilde tatlı bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 18 ml ile temizlenebilir retroviral süpernatan değiştirin. </li><li> (G mi -1 20), IL-6 (50 g mi-1), mSCF (50 g mi-1) ve heksadimetrin bromit (Polybrene) (6 ve IL-3 ile süzüldü retroviral süpernatan Ek# 956; g mi -1). Not: heksadimetrin bromit Retroviral transdüksiyonun etkinliğinin bir düşüş önlemek için her 2 ayda taze yapılmalıdır. </li></ol> 9. Kemik İliği Hasat (Gün 1) <ol><li> adım 8.3 tamamlandıktan sonra, Aşama 6.4 kemik iliği hücreleri hasat ve steril 50 ml tüp içine yapışmayan hücreleri ihtiva eden ortam aktarın. </li><li> 10 ml PBS ile kuvvetlice plakaları yıkayın ve adım 9.1 50 ml konik toplamak. Gerekirse, yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri, süpernatant süzün, küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri (1-3 mi) tam bir DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS ve sayısı. Sitokinler ve heksadimetrin bromit ihtiva eden retroviral süpernatan 1 ml başına 1 x 10 6 hücre 0. günde yeniden süspanse kemik iliğinden% 75 iyileşme - 50 önceden tahmin. </li></ol> 10. Kemik İliği İletimi (Gün 1) <ol><li> retroviral süpernatan / kemik ma Platealtı oyuklu doku kültür plakasına oyuk başına 3 ml&#39;lik bir hacimde rrow karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Adım 10.2 santrifüj sırasında gaz alışverişini en aza indirmek için plastik wrap plakaları sarın. </li><li> 60 dakika 37 ° C sıcaklıkta 1000 x g&#39;de sarılmış altı oyuklu plakalar dönerler. </li><li> Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, plastik parçası çıkarın ve 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe plakaları yerleştirin. </li></ol> 11. retroviral süpernatan ve transdüksiyon (Gün 2) <ol><li> 24 saat sonra, virüs üretici hücre hattı taze viral supernatant toplamak. 10 ml&#39;lik bir şırınga ve 0.45 um&#39;lik bir şırınga filtresi kullanılarak retroviral süpernatan filtre. IL-3 ile süzüldü retroviral süpernatan (20 g mi-1), IL-6 (50 g mi-1) ve SCF Ek (50 g mi-1) ve heksadimetrin bromit (6 g mi-1). </li><li> Daha sonra, dikkatli bir şekilde bir pipet ile kaldırmak veya kemik iliği hücreleri ihtiva eden altı oyuklu plakanın her bir ortamın ilk 2 ml aspire. NOT: İş dikkatle genellikle iyi ortasında yoğunlaşmıştır kemik iliğini, aspire değil. Seçenek olarak ise, üst tarafta yüzer kısım herhangi bir kayıp kemik iliği hücrelerinin geri aşağı eğrilebilir. </li><li> de kemik iliği 6-çukurlu plaka içindeki her bir taze viral süpernatan ihtiva eden sitokinler ve heksadimetrin bromit 3 ilave edin. plastik tabak sarın ve 60 dakika 37 ° C 1000 xg&#39;de Spin transdüksiyon tekrarlayın. Plakalar paketini, ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2, gece boyunca (yaklaşık 24 saat) inkübe hücreleri. </li></ol> Taze DMEM 12. eklenmesi (Gün 3) <ol><li> 24 saat sonra, aşama 11.2&#39;deki gibi kemik iliği hücreleri, ihtiva eden altı oyuklu plakanın her bir ortamın ilk 2 ml çıkarın. (G mi -1 50), IL-3 nihai konsantrasyonları ile desteklenmiş taze DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS (20 g mi-1) çıkarılır değiştirin, IL-6 (50 g mi-1) ve SCF . </li><li> Kemik iliği inkübebir 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe plakalara. </li></ol> 13. Hasat kalıt aktarımlı Kemik İliği (Gün 4) <ol><li> 24 saat sonra altı oyuklu plakalar kemik iliği hücreleri toplamak. Tüm yapışmayan hücreleri çıkarmak için PBS ile kuvvetli bir şekilde plakalar, yıkama. <ol><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve süpernatantı süzün. </li><li> PBS +% 0.5 (hacim / hacim) arasında küçük bir hacme (1 mi), kemik iliği, ısı ile inaktive edilmiş FBS süspanse edin. hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> Her kemik iliği durumun 10 ul örnek almak ve bir Neubauer sayım odasını kullanarak hücreleri sayın. 1 varsayarsak - alıcı başına 2 donör, verim alıcı fare başına en az 4 x 10 6 hücre aktarmak yeterli olacaktır. fare başına 300 ul - 200 enjekte PBS +% 0.5 (hacim / hacim) ısı ile inaktive edilmiş FBS yeterli hacimde kemik iliği süspanse edin. <ol><li> Bir transdüksiyon verimliliği en az 2 x 10 6 hücre enjekte% 25 intravenöz fare başına (8 x10 6 hücre kadar enjekte edebilir). NOT: Biz rutin kemik iliği hücrelerinin iki adet 6-kuyucuğu başına beş alıcı fareler enjekte edilir. Verim önemli ölçüde daha düşük olması durumunda, yeterli kemik iliği sayısı elde edilene kadar, daha fazla verici farenin kullanılmalıdır. Uygun sulandırma elde etmek için, en az 5 x 10 5 kalıt (pozitif flüoresan), her bir alıcı enjekte edilmelidir. </li></ol></li><li> Bir mikro pipet ile, her kemik iliği durumun 10 ul örnek almak ve flüoresan işaretleyici (Şekil 1A) 11 sentezlenmesi göre akış sitometrisi ile transdüksiyon verimliliği analiz eder. Not: Genellikle, floresan pozitif hücrelerin yüzdesi yapısı ve retroviral titresi bağlı olarak,% 25 ve% 70 arasındadır. Gerekli transduse kemik iliği hücre sayısı bir alt ölümcül ışın fare transdüksiyon verimliliği bağlı olarak değişebilir tekrar oluşturmak için. tran düşüksduction verim, daha fazla kemik iliği hücreleri gerekli tersine, kemik iliği transdüksiyon etkinliği daha yüksek hücre daha az sayıda sulandırma için gereklidir. % 25 altında İletimi verimliliği optimal ve yetersiz sulandırma ve hayatta kalma neden olabilir. Optimal kemik iliği kurtarma ve transdüksiyon verimliliği sağlamak üzere, taze hazırlanmış doku kültür ortamı ve sitokinlerin kullanılması. Retrogenic sistemini kullanan yeni bir TCR ifade ederken, in vivo olarak bu TCR seçimi bilinmemektedir. Her TCR afinite bağlı olarak, timus ve periferal T hücre ifadesi TCR seçimi 17 değişecektir. </li></ol> 14. Fare Işınlama, Kemik İliği Enjeksiyon ve Bakım <ol><li> farelere kemik iliği enjeksiyonu gün önce (Adım 13 ile aynı gün) ışın tedavisi. Aşağıdaki dozların kullanılması: C57BL / 6 fareleri (ve diğer yabani tip suşlar), 900 rad; Rag1 - / - fareleri, 500 rad, SCID fareleri, 300 rad). <ol><li> Amoksisilin üzerinde yer alan fareler (50 mg / kg / gün) veya ışınlama önce başka antibiyotik su arıtma, ve kemik iliği enjeksiyonu sonrası ilk iki hafta boyunca antibiyotik üzerinde tutmak. NOT: Optimal ışınlama dozu ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için, enjeksiyondan hemen önce, sonra, enjeksiyon için 27-gauge iğne değiştirmek hava embolisi önlemek için herhangi bir havayı dışarı atmak künt iğne kullanılarak 1 ml şırınganın içine Adım 13.1 hücreleri yükleyin. bir ısıtma lambası altında ısı fareler ve intravenöz fare başına kemik iliğinin 0.2 ml enjekte edilir. NOT: Hücreler uzun süre veya yerleşmek hücrelerin şırınga oturup izin vermeyin. </li><li> sağlıklı kalmasını sağlamak için haftalık fareler izleyin. </li><li> 5 sonra - 6 hafta, GFP + / Ametrine + ve TCR birlikte ifadesi, (Şekil 1B) 11 dayanarak sulandırılacak kontrol fareleri boşaltma. </li></ol>

<ol>
	<li>Qi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+clonal+selection+in+the+human+T-cell+repertoire.">Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).</li><li>Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+diversity,+completeness,+and+cross-reactivity+of+the+T+cell+repertoire.">Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire.</a> Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).</li><li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4+8++thymocytes.">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li><li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection.">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li><li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice.">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).</li><li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis.">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li><li>Pauza, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+transgenic+response+to+an+endogenous+polymorphic+autoantigen+determines+susceptibility+to+diabetes.">T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes.</a> Diabetes. 53, 978-988 (2004).</li><li>Jasinski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+insulin+(B:9-23)+T-cell+receptor+mice+develop+autoimmune+diabetes+dependent+upon+RAG+genotype,+H-2g7+homozygosity,+and+insulin+2+gene+knockout.">Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout.</a> Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).</li><li>Kersh, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+transgenic+mice+in+which+usage+of+transgenic+alpha-+and+beta-chains+is+highly+dependent+on+the+level+of+selecting+ligand.">TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand.</a> Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+retrogenic+mice:+A+rapid,+flexible+alternative+to+TCR+transgenic+mice.">TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).</li><li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice.">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3, 191-197 (2006).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice:+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer.">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).</li><li>Donnelly, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+aphthovirus+2A/2B+polyprotein+'cleavage'+mechanism+indicates+not+a+proteolytic+reaction,+but+a+novel+translational+effect:+a+putative+ribosomal+'skip'.">Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'.</a> J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).</li><li>Atkins, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+"StopGo":+reprogramming+translation+to+augment+codon+meaning+of+GGN+by+promoting+unconventional+termination+(Stop)+after+addition+of+glycine+and+then+allowing+continued+translation+(Go).">A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go).</a> RNA. 13, 803-810 (2007).</li><li>Doronina, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+release+of+nascent+chains+from+ribosomes+at+a+sense+codon.">Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon.</a> Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).</li><li>Bettini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+affinity+and+tolerance+mechanisms+converge+to+shape+T+cell+diabetogenic+potential.">TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential.</a> Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).</li><li>Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+improved+humanized+mouse+models+for+human+infectious+diseases.">Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases.</a> J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).</li><li>Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mouse+models+to+study+human+diseases.">Humanized mouse models to study human diseases.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).</li><li>Chaplin, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+interleukin-12+as+a+self-processing+2A+polypeptide.">Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide.</a> J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).</li><li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function.">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity.">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice.">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Protokolde, optimal kemik iliği sağlık, transdüksiyon verimliliği ve sulandırma sağlamak için detay birkaç kritik adımlar biz. İlk kritik bir adım üretimi ve GP + E86 viral üretici hücrelerin uygun bakım olduğunu. erken geçiş üretici hücre çizgileri kullanın% 80 birleşme ya da daha düşük, kullanımdan önce en korumak. 48 saat - taze GP + E86 viral üretici hücreleri yaparken, 293T hücreleri erken geçiş ve 24 için kültüründe büyüyen sağlamak. transdüksiyon aşaması esnasında çok...

İnsanlarda ve farelerde T hücresi reseptörü (TCR) repertuarı 1 x 10 8 ve 2 x 10 6 benzersiz TCRler, sırasıyla 1,2 olarak tahmin edilmiştir. Bu büyük çeşitlilik T hücreleri kendi peptidlerinin yanı sıra antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) üzerindeki majör histokompatibilite kompleksiyle (MHC) tarafından sunulan patojenlerden türetilmiş antijen epitop geniş bir dizi tanımasını sağlar. Benzersiz peptid-MHC komplekslerine sahip TCRlerin etkileşimleri ince farklar T hücre apoptosis, anerji, aktivasyon, farklılaşma, sitokin üretiminin veya sitotoksisite tabi olup olmadığını belirler. Bununla birlikte, büyük bir TCR repertuarına, belirli bir TCR belirli bir antijene yanıt nasıl analizi, tek TCR sistemlerinin kullanılmasını gerektirir. Çeşitli TCR transjenik farenin bir in vivo modeli 3-9 tek TCR&#39;nin fonksiyonu çalışma amacıyla oluşturulmuştur. Bununla birlikte, aşağıdakileri içeren transgenik fareler TCR&#39;ye uyarılar vardırmaliyet, tek bir transgenik fare ve germ DNA 10 rastgele transgen yerleştirme sözde kurucu efekti oluşturmak için zamanın uzunluğu. Bu nedenle, çok az sayıda TCR transjenik farenin herhangi bir antijen için oluşturulan ve aynı epitop için yüksek ve düşük TCR afinite fonksiyonel etkileri nadir ele alınmaktadır. Ekrana hızlı bir yaklaşım gereksinimi işaret etmektedir ve tek tek ya da kombinasyon halinde birden fazla TCRlerin incelemek için, (retrovirüs ile ilgili &quot;geriye&quot; ve transjenik &#39;gen&#39;) retrogenic farenin transgenik fareler 11-13 TCR&#39;ye bir alternatif olarak kullanılmaktadır. Birkaç virüs içinde bulunan 2A peptid ortak motif parçalanma 2A glisin ve 2B, prolin ile meydana geldiği, bir 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gli-2B-Pro oluşmaktadır cis -Oyunculuk hidrolaz aktivitesi ile ilgili, çeviri 10,14-16 boyunca ribozomal atlama sonuçlanır. c gösteren detaylı bir diyagram içinBu şekilde, tek bir vektörde stoikiometrik tercüme sonucu bağlanabilir 2 cistrons (TCR alfa ve TCR beta) 12. - çeşitli 2A peptidler (F2A, E2A, T2a, P2A) arasında leavage referans 10 bakınız. Bu anlayışla, biz ifade ve doğrudan in vivo çoklu antijen spesifik TCRler karşılaştırmak mümkün.

<table><tbody><tr><td>DMEM, high glucose + glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Dulbecco&#039;s Modification of Eagle&#039;s Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &amp;amp; sodium pyruvate</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;#181;m syringe filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>Sterile Filtered in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracil (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM nonessential Amino Acids</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm tissue culture dishes</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Tisue culture-treated 6-well flat plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;#181;m nylon cell strainers</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;PHC0063</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stem Cell Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

retroviral transduction of bone marrow progenitor cells to generate t-cell receptor retrogenic mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

Kemik iliği Örnek kemik iliği transdüksiyon şekil (Şekil 1A) içinde kuyruk damarı içinden iv enjekte edilmeden önce, kemik iliği transdüksiyon verimliliği edilen kemik iliği, yaklaşık 10 ul 100 ul ilave edildi, protokol aşama 13.3 kontrol edilir PBS ve Ametrine ifadesi için analiz edilmiştir. Genel olarak, floresan pozitif hücrelerin yüzdesi yapısı ve retroviral titresi bağlı olarak,% 25 ve% 70 arasındadır. 6 hafta kemik iliği enjeksiyondan so...

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice at JoVE.com

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Video: Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Kanser Araştırmaları

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biyoloji

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide further insight on cell function. B-1a cells are a unique B cell subset in mice that produce protective natural IgM antibodies against oxidation-specific epitopes that arise during health and disease. B-1a cell IgM production differs depending on B-1a cell location, and therefore it becomes useful from a therapeutic standpoint to target B-1a localization to niches supportive of high antibody production. Here we describe a method to target B-1a cell migration to the bone marrow by retroviral-mediated overexpression of the C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4). Gene induction in primary murine B cells can be challenging and typically yields low transfection efficiencies of 10-20% depending on technique. Here we demonstrate that retroviral transduction of primary murine B-1a cells results in 30-40% transduction efficiency. This method utilizes adoptive cell transfer of transduced B-1a cells into B cell-deficient recipient mice so that donor B-1a cell migration and localization can be visualized. This protocol can be modified for other retroviral constructs and can be used in diverse functional assays post-adoptive transfer, including analysis of donor cell or host cell phenotype and function, or analysis of soluble factors secreted post B-1a cell transfer. The use of distinct donor and recipient mice differentiated by CD45.1 and CD45.2 allotype and the presence of a GFP reporter within the retroviral plasmid could also enable detection of donor cells in other, immune-sufficient mouse models containing endogenous B cell populations.

Here we describe a method for retroviral overexpression and adoptive transfer of murine B-1a cells to examine in vivo B-1a cell migration and localization. This protocol can be extended for diverse downstream functional assays including quantification of donor B-1a cell localization or analysis of donor cell-derived secreted factors post-adoptive transfer.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...