Name: isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization at JoVE.com

Bu çalışma Araştırma Vakfı-Flanders (FWO G.0856.13N) ve KU Leuven Araştırma Kurumu (OT / 13/113) hibe tarafından desteklenmiştir. KDC FWO Belçika tarafından finanse edilmektedir. AH OT / 13/113 tarafından finanse edilmektedir. Biz konfokal mikroskop kullanımı için KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) Hücre Görüntüleme Çekirdek tesis teşekkür etmek istiyorum.

AlexaFluor Bu çalışma için tüm hayvan deneyleri KU Leuven (Belçika) (/ 2013 Proje P174) etik inceleme komitesi tarafından kabul edildi. Fareler gıda pelet ad libitum erişimine sahip, standart koşullar altında muhafaza ve musluk suyu ve kontrollü koşullar (23 ± 1.5 ° C, bağıl nem% 40 - 60, 12/12 aydınlık / karanlık döngüsü) altında tutuldu. 1. Fare <ol><li> Piyasada mevcut fare suşu (- 12 haftalık, yani C57BL / 6 kadın 8) kullanın. Tipik haliyle, 4-5 farenin başka deneyler için hücreler uygun miktarda ürün elde edilir. </li><li> için 17β-estradiyol, 100 uL (E2) çözeltisi (100 ng / 100 ul) ile deri altından sağlam fareler enjekte 3 ardışık D hayvanların estrojen döngüsü faz standartlaştırmak ve endometriyal proliferasyonu oluşumunu sağlamak üzere izolasyon öncesinde hücreler. protokolü başlamadan önce farelerin döngüsü aşamasını kontrol etmek için ihtiyaç önlenebilir be olduğunu3 d &#39;östradiol tedavisinin neden olur. </li></ol> 2. hazırlıklar <ol><li> 100 ng / yerfıstığı yağı içinde 100 uL, E2&#39;nin bir solüsyonun hazırlanması. Beş fareye (1.2 de tarif edildiği gibi) ve enjeksiyonlar için 1.5 ml bir miktarda gereklidir. <ol><li> 1 mg / mL&#39;lik bir stok çözeltisi için 1 ml etanol içinde 1 mg E2 eritin. </li><li> Bu stok solüsyonu 1 seyreltilir: 1.000 yerfıstığı yağı. </li></ol></li><li> 500 ml 1 x 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile tamamlanmış Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) (daha fazla HBSS + olarak anılacaktır) sağlayın. </li><li> Kültür Mesc filtre Fare Endometriyal stromal hücre 500 ml yapmak (MESC) ortamı: fenol kırmızısı, L-glutamin ve 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik Dulbecco&#39;nun Modifiye edilmiş Eagle ortamı / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) asit, N - (2-Hidroksietil) piperazin-N &#39;- (2-etansülfonik asit) (HEPES),% 10 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B, 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden (further) MESC ortam olarak adlandırılır. </li><li> desidualizasyon süresince kültür Mesc filtre% 2 MESC ortamının 500 ml yapmak: fenol kırmızısı, L-glutamin ve% 2 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B ihtiva eden HEPES, 100 ug / ml gentamisin ile DMEM / F12. </li><li> süzüldü Fare Endometriyal Epitel Hücre 500 mL hazırlama (MEEC) ortamı:% 10 FBS, 0.5 ug / ml amfoterisin B, 100 ug / ml gentamisin, 25% MCDB-105 aracı ve 5 mg / ml insülin içeren DMEM (daha fazla ifade ) MEEC ortamı olarak. </li><li> MESC kültürü için Poli-L-lisin (PLL) kaplanmış lamelleri hazırlayın. <ol><li> damıtılmış su, 250 mL PLL 25 mg eritin. 0.22 mikron filtre kullanılarak çözüm Filtre. </li><li> 12-çukurlu bir tabla içindeki steri lamelleri ekleyin. lamelleri üzerinde çözünmüş PLL 300 uL ekleyin. </li><li> inkübasyon 30 dakika sonra çözelti çıkarın. (- 2 ay kadar 1) Plakalar, 4 ° C&#39;de bir sonraki kullanıma kadar muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> 10 mg / ml stok çözeltisi o hazırlanmasıF kollajenaz tip -20 ° C&#39;de 300 uL IA ve mağaza alikotları. Kullanmadan önce Filtre. </li></ol> 24 saat İzolasyon önce Gerekli 3. Hazırlıklar <ol><li> MEEC kültürü için kollajen kaplı lamelleri hazırlayın. <ol><li> damıtılmış su içinde bir 0.02 M asetik asit solüsyonu (lamel başına 1 ml) hazırlayın. </li><li> 50 ug / mL bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere 0.02 M asetik asit 12 mL kollajen 150 uL ekleyin. </li><li> 12-çukurlu bir tabla içindeki steri lamelleri ekleyin. </li><li> kolajen çözeltisi 1 mL (3.1.2) ekleyin. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta O / N (en az 12 saat) inkübe edin. Izolasyon sırasında: </li><li> emme lamelleri kapalı kollajen çözüm çıkarın ve (laminer akış kabini içinde) steril bir ortamda o hava kurumaya bırakın. </li><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez lamelleri yıkayın. </li></ol></li><li> 10 ml içeren 15 ml standart bir tüp içinde 0.25 g pankreatin ekleyerek% 2.5 pankreatin çözeltisi hazırlayınHBSS +. çözünürlüğünü arttırmak için, 1 saat boyunca (200 rpm) 37 ° C&#39;da, çözelti çalkalayın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 4. İzolasyon ve Fare endometrial epitel hücreleri Kültür (MEEC) ve Fare Endometrial Stromal hücreler (MESC) <ol><li> (Daha MESC sindirim karışımı olarak adlandırılır)% 0.25 tripsin içeren nihai çözelti ile sonuna kadar% 2.5 pankreatin çözeltisi (3.2) ihtiva eden 15 ml bir tüp içinde tripsin 25 mg ekleyin. </li><li> Uteri izolasyonu <ol><li> vajinal smear incelemesinin hayvanların döngüsü aşamasını kontrol edin. <ol><li> hayvan dizginlemek ve 50 ul PBS 3 nazikçe vajina yıkayın - 5 kez. </li><li> Bir bardak slayt son floş toplayın. </li><li> 10X veya 20X objektif kullanarak parlak alan mikroskobu altında malzemeyi inceleyin. </li><li> Sadece kızışma aşamasında olan fareler kullanın. Bu aşama, vajinal lavajda bulunan kornifıye epitel hücrelerinin varlığı (Şekil 1 ile karakterize edilir </strong&gt;). </li></ol></li><li> Böyle servikal dislokasyon veya CO 2 indüklenen narkoz gibi uygun bir yöntem kullanılarak hayvanları euthanize. </li><li> steril bir ortam oluşturmak için% 70 etanol ile karkas püskürtün. </li><li> Steril cerrahi aletler kullanarak, karın açın ve her iki rahim boynuzları görselleştirmek için bir kenara bağırsak itin. </li><li> fallop tüpü altında en uzak ucunda uterin horn tut. Fallop tüpünden rahim boynuzları incelemek ve yağ ve bağ dokusu çıkarın. rahim vücudun üstünde uzak ucunda korna kesip HBSS + 3 mL ile 35 mm Petri kabı yerleştirin. <ol><li> tüm rahim boynuzları toplanana kadar diğer boynuz ve diğer hayvanlar için bu adımı yineleyin. </li></ol></li><li> ayrıca bir Stereoskop altında (HBSS + içinde) uterin boynuz temizleyin ve kalan tüm adipoz veya bağ dokusu kaldırmak. </li><li> rahim lümen maruz ve inci yerine uzunlamasına açık rahim boynuzları CutTaze HBSS + ile yeni bir Petri kabındaki e boynuz. </li><li> pankreatini ve tripsin içeren 15 ml tüp tüm rahim boynuzları aktarın. </li><li> orbital çalkalayıcı (50 rpm) ile, 4 ° C&#39;de 60 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin. </li><li> çalkalamadan, 23 ° C (RT) 45 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin. </li><li> çalkalamadan, 37 ° C (su banyosu) 15 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin. </li><li> Öte yandan,% 0.05 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 2.7 mL, 1 mg / ml kollajenaz stokunun 300 uL çözülmesiyle MESC sindirim karışımı tercih. Not: Bundan sonra, daha fazla yalıtım adımları bir laminar akış kabini altında steril bir ortamda gerçekleştirilir. </li></ol></li><li> Fare Endometrial Epitel Hücre (MEEC) Kültür <ol><li> 2 saat kuluçkalamadan sonra, dikkatli bir şekilde yüzer solüsyonundan dökün. </li><li> Tripsin inaktive etmek için soğuk MEEC ortam içeren bir Petri kutusu içine uteri aktarın ve 5 dakika boyunca inkübeaktivite. </li><li> soğuk HBSS + 3 mL içeren 15 ml tüp uteri aktarın. </li><li> 10 sn için vorteks epitel kağıtları açmak için. </li><li> 3 ml HBSS + ile temiz bir Petri kabındaki uterus durulayın. </li><li> Adımı tekrarlayın 4.3.2 - 4.3.4 epitel tablolarını içeren üç süspansiyonlar toplam elde etmek. </li><li> MESC sindirim karışımı uteri aktarın ve (200 rpm) çalkalayarak 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika inkübe edilir (Mesc daha izolasyonu için 4.4 adıma git). </li><li> Doku enkaz kaldırmak için 100 mikron naylon örgü hafifçe üç hücre süspansiyonları pipetleme epitel yaprak kurtarın. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de toplanan hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> MEEC ortamı 12 mL pelet yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın. </li><li> gravite sedimantasyon kullanılarak geri kalan Mesc ayırmak için 5 dakika boyunca çözeltiden yerleşirler. </li><li> 5 ml pipet kullanarak dikkatlice üst 2 mL çıkarın. </li><li> Hücre suspensio santrifüjn, 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de. </li><li> Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme MEEC ortamda süspanse. </li><li> Diğer deneylerde (Şekil 2a) için istenen yoğunluğa kollajen kaplı lamelleri, hücreler plaka. </li><li> 12 saat en az% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. Not: RNA veya protein izolasyon arzu edildiğinde, bir 6-yuvalı plaka tohumlama tavsiye edilirken immün veya floresan kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel deneylerde, bu lamelleri, hücreleri doğrudan doğruya levha için tavsiye edilir. Fare endometriyal stromal hücrelerin izolasyonu yetersiz tek bir sindirimden sonra hücre saflığı iki tur ayrılmıştır. rahimler optimal hücre iyileşme ve saflık için iki kez sindirilir. Her iki turda da teknik müdahaleler aynıdır. araştırmacı tarafından istenen her iki turda toplanan hücreler, daha fazla deneyler için muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Fare Endometrial Stromal Hücre (MESC) Kültür: 1. Yuvarlak <ol><li> İlk sindirim ayağı başlamadan önce, 2.7 mi,% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi içinde 1 mg / ml kollajenaz stokunun 300 uL eritilerek ikinci bir sindirim karışımı hazırlayın. Bu karışım aşama 4.4.8 gereklidir. </li><li> soğuk (4 ° C) HBSS + ve MESC ortamının 3 mL, 3 x 15 ml tüpler (tüp, X1, X2 ve X3) ile üç kültür kaplarına hazırlayın. </li><li> inkübasyon 30 dakika sonra, 10 saniye için hafifçe rahim içeren tripsin solüsyonu sallayın. MESC hücreleri rahim dokusu ayırmak ve tripsin çözeltisi içinde kalır. </li><li> soğuk (4 ° C) HBSS + 3 mL içeren ilk Petri kabı uterus aktarın ve iyice durulayın. </li><li> tripsin aktivitesi inhibe başlangıçta (adım 4.4.3 tüp) rahim boynuzları içeren tüp MESC orta 3 mL ekleyin. </li><li> HBSS + MESC ortamının 3 mL içeren tüp X1 soğuk (4 ° C) Petri kabı rahimleri aktarın ve 10 sn için hafifçe çalkalanır. </li&gt; <li> Tekrarlayın 4.4.4 (soğuk (4 ° C ile Petri kabı transfer) HBSS +) ve iki kez 4.4.6 (tüp X2 ve X3 transfer) yineleyin. Not: Son olarak, bu protokol, 4 hücre süspansiyonları neden olur: bir boru tripsin solüsyonu ve Mesc içeren MESC ortam ile 3 tüp (tüpler, X1, X2 ve X3) ihtiva etmektedir. </li><li> Aşama 4.4.1 de tarif edildiği gibi, yeni MESC sindirime uteri aktarın ve dikey olarak, 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 40 mikron naylon örgü ile dört hücre süspansiyonları geçerek stromal hücreler toplayın. Mesc ek 5 ml ile örgü durulayın. </li><li> 7 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> istenen yoğunluğa sahip başka deneyler için PLL kaplı lamelleri Mesc ve plakadaki pelletini. </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 6 saat ve O / N 4 - en az inkübe edin. </li></ol></li><li> Fare Endometrial Stromal Cell (MESC) Kültür: 2. Yuvarlak &lt;ol&gt; <li> soğuk (4 ° C) HBSS + ve MESC ortamının 3 mL, 3 x 15 ml tüpler (Borular, Y1, Y2 ve Y3) ile üç kültür kaplarına hazırlayın. </li><li> 4.4.7 - Tekrar 4.4.3 adımları. </li><li> 40 mikron naylon örgü uteri ile birlikte son hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> naylon gözlü bir tüp Y1, Y2 ve Y3 içeriğini geçirilerek stromal hücreler toplanır. Mesc ek 5 ml ile örgü durulayın. </li><li> 7 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Diğer deneylerde (Şekil 2b) için PLL kaplı lamelleri MESC orta ve plaka pelletini. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 6 saat 4 - en az inkübe edin. Not: RNA veya protein izolasyon arzu edildiğinde önerilir 6 oyuklu bir plaka içerisinde tohum ise immün veya floresan kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel deneylerde, bu lamelleri hücreleri plaka tavsiye edilir. </li></ol></li></ol> 5. Vimentin/ Saf MEEC ve MESC Kültürlerin Doğrulama için Sitokeratin Çift Boyama <ol><li> lamelleri hücreleri Tohum. </li><li> PBS orbital çalkalayıcı (50 rpm) üzerine, kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Olmayan bir karıştırıcı üzerinde 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) (Dikkat gösterilmelidir!) Hücreleri saptamak. </li><li> çalkalayıcı (50 rpm) üzerine kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile 3 kez yıkanır. </li><li> bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 10 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği. </li><li> bir çalkalayıcı üzerinde PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca PBS içerisinde% 5 keçi serumu (GS) ile blok (50 rpm) </li><li> bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 4 ° C&#39;de (: 1: 500) ve monoklonal fare anti-insan pansitokeratin (1.000 1) tek klonlu tavşan anti-insan vimentin hücreleri inkübe edin. Antikorlar% 0.5 GS PBS içinde seyreltilir. </li><li> bir çalkalama (50 rpm) ile, PBS ile yıkayın 3x. </li><li> sekonder antikor ile inkübe hücreleri (1: 1,000% 0.5 GS) Alexa Fluor 488-bağlı anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 488-konjugatbir çalkalayıcı üzerinde bir kapı anti-fare IgG. </li><li> bir çalkalayıcı üzerinde PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Dağı DAPI ve kuru O / N ihtiva eden sulu montaj orta ile slaytlar. </li><li> Oje ile slaytlar Seal ve daha sonra kullanmak üzere 4 ° C üzerinde tutmak (Şekil 2a, b). </li></ol> Bir Coculture Sistemde Vitro desidualizasyonda 6. Not: Dört ila beş hayvandan, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bir Coculture sistemi kurmak için gereklidir. tercihen bir laminer akış kabini altında steril bir ortamda aşağıdaki protokol ile devam edin. <ol><li> bir 24-çukurlu plaka epitel hücre izolasyonu (4.3 de tarif edildiği gibi), santrifüj ve / veya İnkübasyon sırasında hücre kültürü ekler hazırlayın. <ol><li> 24 oyuklu bir plaka içerisinde kuyu istenen miktarda içine MESC ortamı 400 uL - 200. </li><li> Steril forseps kullanarak önceden doldurulmuş 24-kuyularda ekler yerleştirin. </li></ol></li><li> MEEC peletekler üzerinde MEEC orta ve bölmek (aşama 4.3.14) (çalışma hacmi: 150 - uç başına 300 uL). Kültür, bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücreler. </li><li> stromal hücre izolasyonu ikinci tur (aşama 4.5.6) sonra, (hücre kültürü ekler ile uyumlu) bir 24-çukurlu plaka içinde stromal hücreler tohumu. oyuk başına 400 uL hücre süspansiyonu bir çalışma hacmi kullanın. </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 6 saat - stromal hücreler en az 4 eklemesini sağlar. </li><li> stromal hücreler tarafından kapanan ikinci 24 oyuklu plaka ilk 24 oyuklu plaka epitel hücreleri ile kaplı hücre kültürü ekler aktarın. sterilize forseps kullanın ya da sadece kendi asılı dibinde ekler dokunun. </li><li> Kültür 3 bir süre için% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücreler -% 90 oranında konfluent - epitel hücreleri kadar 5 gün, bir tek-tabakalı ve stromal hücreler 80 elde oluşturur. Ayrıca, kullanımı Transepitelyal Elektrik Direnci (TEER)Grant ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bir ohm / epitel metre kullanımı ile epitel tek tabaka izlemek için. 7. 800-1000 civarında / kuyu değerleri epitel tek tabakalı konfluent dikkate yeterli. </li><li> cam pipetler veya ince pipet ipuçlarını kullanarak 3 d - Gerekirse, orta her 2 değiştirin. ekler de orta değiştirmeden önce, (altta seribaşı) stromal hücrelerin orta değiştirme ile başlayın. 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir hücre kültür ortamını kullanmak tavsiye edilir. </li><li> Deney başlamadan önce in vitro desidualizasyonda ikna etmek için desidualizasyon ortamı hazırlayın. stromal hücrelerin oyuk başına 400 uL bir çalışma hacmi kullanın. <ol><li> -20 ° C&#39;de aşağıdaki stok çözümleri ve mağaza alikotları hazırlayın. <ol><li> etanol 250 uM medroksiprogesteron 17-asetat (MPA) hazırlayın. </li><li> 100 mM stok çözeltisi, 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-ultra saf su içinde cAMP&#39;yi hazırlayın. </li></ol></li><li> 1 uM MPA ve% 2 FBS içeren MESC ortamı içinde 0.5 mM cAMP ihtiva eden desidual tanesidir. </li></ol></li><li> Yavaşça kuyulardan orta kaldırmak ve stromal hücreleri üzerine desidual orta ekleyin. bir kontrol durumu gerekli ise,% 2 FBS içeren MESC ortamını kullanmak. </li><li> hücre kültürü ekler orta çıkarın ve hücreler üzerine MEEC orta 300 mcL ekleyin. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde 5 gün boyunca hücrelerin inkübe edin. </li><li> Beşinci gün sonra, RT-qPCR stromal hücrelerde desidualizasyon ölçüde değerlendirmek (aşağıya bakınız). </li><li> Resazurin tabanlı canlılığı bir reaktif kullanılarak epitel hücrelerin canlılığını doğrula. <ol><li> MEEC ortamda yaşama güçlerine reajanı 1:10 çözeltisi hazırlayın. </li><li> Yeni 24-yuvalı plaka içine hücre kültür ekleri aktarın. </li><li> hücreleri üzerine MEEC solüsyon - canlılığı reaktifi 300 uL - 150 ekleyin. </li><li> De% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edinEn az 4-5 saat veya gece boyunca ve (mor / pembe mavi) bir renk değişimine gözlemleyerek hücre canlılığını değerlendirmek. NOT: araştırmacı tarafından tercih edildiği gibi sidualizasyonu ayrıca, bir fare prolaktin spesifik ELISA yöntemi ile değerlendirilebilir. </li></ol></li></ol> Mah-PCR ile sidualizasyonu ve 7.Validation Not: QRT-PCR ile desidualizasyon geçerli olabilmesi için, bu RNA analizi için bir hücre yeterli miktarda almak için iki kez tüm test koşulları gerçekleştirmek tavsiye edilir. De Clercq ve arkadaşları, daha önce tarif edildiği gibi kantitatif RT-PCR gerçekleştirilir. 8. Kısaca: <ol><li> ticari RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole. <ol><li> sırasıyla, üreticinin protokolüne göre, ticari yöntemlerle RNA miktarını ve kalitesini değerlendirmek. </li></ol></li><li> toplam RNA&#39;nın 1 | ig itibaren üreticinin protokolüne uygun olarak, cDNA sentez. </li><li> QRT-PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için, üreticinin protokolüne uygun olarak, ticari bir kit kullanın. <ol><li> üç nüsha tüm örnekleri çalıştırın. </li><li> reaksiyonu yürütmek için istenen temizlik genler ve prolaktin (prl8a2) ticari TaqMan Master Mix ve spesifik TaqMan probları yararlanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation:+a+model+for+the+action+of+progesterone.">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+menstruation.">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li><li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signals+direct+the+formation+of+tight+junctional+permeability+barrier+in+the+decidualizing+stroma+during+embryo+implantation.">Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).</li><li>Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+vasculogenesis+in+pregnancy.">Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).</li><li>Power, M. L., Schulkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The evolution of the human placenta. , (2012).</li><li>Finn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+of+the+decidual+cell+reaction+in+the+uterus+of+the+aged+mouse.">The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse.</a> J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).</li><li>Grant, K. S., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mouse+uterine+stromal+cells+on+epithelial+cell+transepithelial+resistance+(TER)+and+TNFalpha+and+TGFbeta+release+in+culture.">Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture.</a> Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).</li><li>De Clercq, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+transient+receptor+potential+channels+in+human+endometrial+stromal+cells+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).</li><li>Pieper, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells.">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li><li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium.">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li><li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium.">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li><li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells.">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li><li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production.">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+stromal+cells+regulate+epithelial+cell+growth+in+vitro:+a+new+co-culture+model.">Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model.</a> Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).</li><li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-defined+in+vitro+three-dimensional+culture+of+human+endometrium+and+its+applicability+to+endometrial+cancer+invasion.">A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion.</a> Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Sidualizasyonu yuvarlak salgılayan desidua hücrelere endometriyal stromal hücrelerin progesteron bağımlı farklılaşma olduğunu. İnsanlarda, bu işlem, adet döngüsünün luteal faz sırasında kendiliğinden oluşur ve predecidua oluşturmak üzere vasküler hücreleri çevreleyen stromal hücrelerde başlatılır. Ancak, kemirgenlerde, bir blastosist varlığı desidualizasyon ikna etmek zorunludur. desidualizasyon endometrial epitel hücreleri ile temas ettikten sonra meydana olması önemli faktörler altta yatan stromada desidualizasyonu indükleme epitelyal hücreleri tarafından salgılanan ifade eder. desidualizasyon sürecinin başlamasında bu fark kabul edilmelidir rağmen, insan sidualizasyonu, embriyo implantasyonu üzerine daha sağlam hale gerçeği benzer mekanizmaların rol düşündürmektedir. İn vitro hücre kültürleri, genellikle desidualizasyon sürecinde özel moleküllerin etkilerini incelemek için kullanılır.Bununla birlikte, toplanabilir kullanılabilirliği ve insan dokusunun miktarı genellikle sınırlı ve örneğin varyasyonları, döngüsü evresi, gebelik sayısı ve endometriozis veya Adenomiyozis gibi jinekolojik hastalıkların varlığı ile eşlik ediyor. Bu sorunların çoğu kolay erişilebilir ve döngüsü faz bağımsız murin dokusunun kullanılması ile önlenebilir. fare doku kullanmanın bir diğer güçlü bir avantaj genetiği değiştirilmiş kemirgenler kullanmak için fırsat ve deneyler çok sayıda kurulum imkanı vardır. Şu anda, bir çok farklı yalıtım protokolleri, yüksek hayvanların yaş değişkenliği ve kullanım anında östrus fazda süresi ile, literatürde tarif edilmiştir. Bu çalışma, bir avantaj izole önce östrojenin günlük enjeksiyonu ile standart östrus döngüsü çekildiği stromal ve epitelyal hücrelerin birincil endometrial ko-kültürler için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bundan başka, estrojen known ayrıca izolasyon başına verimi artırır epitel ve stromal hücrelerde çoğalmasını teşvik etmek. Bu yazıda anlatılan izolasyon protokolü Grant ve ark dayanmaktadır. 7, bununla birlikte, daha fazla optimizasyon adımları farklı hücre kültürlerinin verimini, saflık ve canlılığını geliştirmek için dahil edilmiştir. İlk olarak, HBSS her zaman birincil kültür kirlenmesini önlemek için antibiyotikler ile takviye edilmiştir. MEEC izolasyonu sırasında sıcaklık adaptasyonu birinci sindirim sırasında epitel hücrelerinin hasat geliştirmek için (37 ° C&#39;de 15 dakika) yapıldı. Daha sonra, ek bir adım aktivitesini inhibe etmek için FBS içeren ortam eklenerek tripsin sindirimden sonra enzimatik aktivitesi temper dahil edilmiştir. Ayrıca, MEECs örgü genel olarak genellikle küme ve hücre tabakaları gelir (100 um) tarif edilene göre daha büyük olduğu bir filtre içinden geçirildi. Ayrıca, stromal hücreler tarafından kirlenme bir eklenti gerçekleştirerek indirgenerekMEECs ve MESCs yerçekimi sedimantasyon dayalı ayrıştırılır edildiği itional adım. kaplanmamış veya PLL kaplı cam lamelleri bağlılık yetersiz olduğu netleşti Son olarak, MEECs, cam lamelleri hücrelerin eki artırmak için kollajen kaplı lamelleri numaralı seribaşı bulundu. MESCs izolasyonu sırasında kolajenaz (1 mg / ml) sindirim geliştirmek için ilave edildi. Bundan başka, bu sindirme basamak kalan MEECs kirlenmesini önlemek için iki kopya halinde yapıldı. Bütün bu ilave basamaklar homojen hücre popülasyonlarının saf ve canlı kültürler ile sonuçlanmıştır. hücrelerinin saflığı immün ve QRT-PCR epitelyal marker olarak stromal işareti ve sitokeratin olarak vimentin kullanılarak değerlendirildi. Açıktır ki, vimentin ve sitokeratin bir karşı ifade modeli MEEC ve Mesc gözlenmiştir. Bununla birlikte, vimentin ve sitokeratin nispi mRNA ifadesi MEEC kültürler içindeki olduğu fark edilebilir. similar sonuçları, diğer araştırma grupları tarafından yayımlanan kültür acquire vimentin ifade 9 hangi epitel hücreler. Daha da önemlisi vimentin ve farklı hücre popülasyonlarının immünohistolojik boyamalar gözlendi sitokeratin arasındaki protein ekspresyonu farkıdır. Çift immün EECS sitokeratin ile pozitif idi ve ESC vimentin pozitif olduğunu göstermiştir. Immün bu belirteçlerin kullanımı kabul görmüş bir yöntemdir ve standart olarak hücre tipleri 10 belirtmek için kullanılır. bir çok araştırma Mesc desidualizasyon gerçekleştirilen edilmiş olmasına rağmen, bu modelde epitel hücrelerinin varlığı desidualizasyon sonuçlarını değiştirebilir mümkün kalır. İlk olarak, MEEC MESC durumunu ortamın mevcudiyetinde ya da bir ko-kültür ortamında bir tek tabaka büyümeye halinde, tek tabaka geliştirilmiş bir epitel hücre transepitelyal elektrik direnci (olduğu gösterilmiştirTEER), Mesc 7 tarafından salgılanan faktörlerden kaynaklanan. Ayrıca, Pierro ve diğ. 11 17β-estradiyol etkilenmiş epitel proliferasyonu, stromal hücrelerinden salgılanan faktörlerle aracılık ettiğini kanıtlar sağlamıştır, ve alternatif olarak, epitel hücreleri, stromal desidualizasyon 12, 13 modüle faktörleri serbest kalabilir. Genel olarak, epitel-stromal ko-kültür ortamı parakrin etkileşim ve iletişim sağlayan bir daha fizyolojik bir durum sağladığı açıktır. Bir ekleme ko-kültür sistemi kullanılarak, iki farklı hücre tipleri kültürlenmesi gibi bir yöntem 14, 15 daha önce tarif edilmiş ve murin primer hücre kullanım için adapte edilmiştir. desidualizasyon bir okuma olarak prolaktin mRNA seviyelerinin tespiti ile, tarif edilen teknik mevcuttur ve izin desidualizasyon için çok tekrarlanabilir okunmasını sahipböylece desidualizasyon sırasında epitel-stromal ilişkinin çalışma s. MEEC mediated parakrin sinyaller stromal hücrelerde desidualizasyon ölçüde değiştirebilir. Ayrıca, model, doğrudan stromal hücreleri etkilemeden epitel yan spesifik modülasyon sağlar. Bu nedenle, MEEC ve Mesc bu ko-kültür stromal desidualizasyonda üzerinde bir okuma-out ile epitel hücreleri vb hormonlar, sitokinler, etkisini değerlendirmek için mükemmel bir araç sunar. Bu ko-kültür sisteminin diğer bir avantajı, araştırmacılar transjenik hayvanlardan izole edilen hücreler kullanılarak epitelyal veya stromal bölmesinde ya desidualizasyonu işlem, belirli bir proteinin tutulumu olup olmadığını araştırmak için izin vermektedir. Ayrıca, bu teknik bir blastokist varlığında epitel hücreleri tarafından salgılanan parakrin faktörler altta yatan stromal desidualizasyon ikna etmek için yeterli olup olmadığını değerlendirmek için blastosist yapışmasını araştırmak için çok yararlı olacaktırHücreler. trofoblast invazyonu önemli bir adım proteolitik enzimlerin faaliyetine aracılık hücre dışı matris degradasyonu ile korelasyon gösterdi. Önerilen teknik blastosist, epitel hücreleri ve destekleyici stromada arasındaki çapraz konuşma araştırmak için, bir in vitro modeli olarak uygulanabilir. Ancak şu anda çok az glandüler yanı sıra luminal olabilir epitel hücrelerinin kökeni hakkında bilinmektedir. Bu nedenle, epitel hücrelerinin, genetik ve moleküler profili daha da karakterize gereklidir. Buna ek olarak, tarif edilen yöntem, epitel hücreleri polarizasyon ile ilgili mevcut bilgiler sınırlıdır. Şu anda, epitel hücreleri polarizasyonu dikkate alınmamıştır. Bununla birlikte, membran protein ifadesindeki farklar apikal ve bazal membranların anlatılmıştır. epitel tabakası olmayan polarizasyon epitheli arasında parakrin etkileşim üzerinde bir etkiye sahip olabiliral ve stromal hücreler. Ancak bu yöntemler de tarif edilmiştir polarize epitel hücreleri elde etmek için ve tarif edilen tekniğin 15, 16 dahil edilebilir. Özet olarak, açıklanan protokol başarıyla fare endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin birincil hücre kültürleri oluşturulması için bir yöntem önermektedir. QRT-PCR ile teyit vimentin ve sitokeratin immün Bu teknik olarak saf hücre kültürlerinde sonuçlanır. Sonuçta, bir epitel ve stromal ko-kültür desidualizasyon sürecinde MEEC ve / veya Mesc ya aracılık ettiği parakrin sinyallerin soruşturma için izin verdiğini tanıtıldı.

İnsan endometrium rahim iç astar ve olası gebelik için hazırlık olarak arıza ve onarım aylık döngülerini uğrar. Uterus lümeni ve yumurtalık hormonları östrojen ve progesteron dalgalanmalara bağlı olarak yoğunluğu değişir yatan stroma epitelyal hücrelerin tek bir katmandan oluşur. Luteal faz sırasında, postovulatuvar progesteron dalgalanma büyük, yuvarlak desidual hücrelere endometriyal stromal hücrelerin farklılaşması, sidualizasyonu 1, 2 olarak adlandırılan bir süreç neden olacaktır. İnsanlarda, bu olgu predecidua oluşturulması için kendiliğinden ortaya çıkar, fakat embriyo implantasyonu sırasında daha belirgin hale gelir. desidualizasyon bir fonksiyonel sonucu uterus geçici embriyo implantasyonu için alıcı hale gelmesidir. Bu aralık &#39;implantasyon penceresi&#39; olarak etiketlenmiş. Embriyo implantasyonu erken dönemde, decidualized e sırasındaimplante embriyoyu çevreleyen ndometrial stromal hücreler embriyo 3 zararlı maddelerin geçişini önlemek için bir bariyer sağlar. Hamilelik sırasında, bu desidua plasenta yerini almıştır önce gelişmekte olan fetus için besin sağlayacak ve daha sonra plasenta 4 maternal bölümünü oluşturacaktır. Etik ve pratik düşünceler desidualizasyonda sürecini araştırmak için insan çalışmaların tasarımı sınırlamak ve hayvan modellerinde kullanımını teşvik etmiştir. Hemochorial plasentasyon grubunun bir üyesi olmak, kemirgenler endometriyum da plasenta 5 önceki sidualizasyonu uğrayacaktır. Kemirgenlerde, ancak, desidualizasyon sürecinin başlatılması ilave uyaran desidual yanıt 6 tetiklemek için gerekli olduğunu gösteren, rahim lümeninde blastosist varlığına bağlıdır. Bu tarihleri ​​arasında karmaşık bir iletişim imae blastosist ile doğrudan temas endometrial epitel hücreleri ve altta yatan stromal hücreler. Bununla birlikte, desidualizasyon yapay mekanik çizilme veya hormonal hazırlanmamış bir uterusa yağ damlatma gibi bir uyarıcıya kullanılarak indüklenebilir. Yapay sidualizasyonu modelleri kullanarak in vivo çalışmalar, örneğin desidualizasyon karmaşık sinyal sürecinde, mekanik derinlemesine çalışmalar, bizim bakış açısı geliştirmek için bize izin olmasına rağmen, epitelyal ve stromal hücreleri arasındaki vazgeçilmez iletişim soruşturma sınırlıdır. Bu nedenle, in vitro sidualizasyonu çalışmaları önemli yollar işlemek ve temel süreçleri incelemek için kullanılabilir. Bu amaçla, endometrium stromal hücre kültürleri, insan ya da kemirgen endometrium kadar ayarlanabilir. kemirgenler istihdam desidualizasyon sürecinde ilgi belirli bir proteinin rolünü araştırmak için genetik olarak değiştirilmiş hayvanların kullanımını rıza. Bununla birlikte, olgunlaşmamış prepuberty farenin genellikle diğer durumlarda rahimler kültürlerinde bir heterojen sonuçlanan östrus döngüsü, tüm aşamaları da toplama, östrus döngüsü komplikasyonları önlemek için kullanılır. Ayrıca, desidualizasyon bir işlem kültür ortamına (I) &#39;e ilave hormon (östrojen, progesteron ya da siklik adenosin monofosfat (cAMP)) farklı protokoller, örneğin, çalışılmıştır veya edilmiş farelerden desidual hücreler, (ii) izole en göre fiş denetimi ve Vasektomi erkeklerde ek ihtiyaç duyarlar (sözde) gebelik, gün 4.5. Bu sınırlamalar in vitro desidualizasyonda incelemek için standart bir yöntemin gerekliliğini göstermektedir. Bu çalışmada, fizyolojik bir model yetişkin başlayarak, in vitro sidualizasyonu incelemek olmayan (sözde) hamile fareler sunulacak. Bu yöntemde, 17β-estradiol (E2) günlük enjeksiyonu homojen ve p artmış bir verimle elde endometriyal hücrelerin proliferasyonunu neden olacaktırure hücre popülasyonları. Ayrıca, bir coculturing sisteminin kullanımı epitel-stromal karışma ve farklı düzeylerde desidualizasyon sürecini manipüle etme yeteneği çalışma sağlar.

<table><tbody><tr><td>ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 &amp;micro;m pore size; transparant</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662610</td><td>Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore.&lt;br/&gt; https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/&lt;br/&gt;0110_0110_0090_0030/13408/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Cell culture treated 24 well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475</td></tr><tr><td>8-Bromoadenosine 3&amp;prime;,5&amp;prime;-cyclic monophosphate sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7880</td><td>Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&amp;amp;region=BE&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1629</td><td>Prepare a stock solution of 250 &amp;micro;M in ethanol. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&amp;amp;region=BE&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Arachis oil</td><td>Supermarket</td><td></td><td>Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used</td></tr><tr><td>PrestoBlue cell viability reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1</td></tr><tr><td>HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>14175-046</td><td>Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol.&lt;br/&gt; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>17-&amp;beta; Estradiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875</td><td>Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000).&lt;br/&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>Cell medium filter Stericup, 0.22 &amp;micro;m, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063</td></tr><tr><td>DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td><td>Gibco</td><td>10500-056</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018</td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037</td></tr><tr><td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5921</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>MCDB-105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td>Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark.&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&amp;amp;region=BE&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Insulin from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1882</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>Coverslips, glass, 18 mm &amp;Oslash;</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td><td>1001/18</td><td>http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&amp;amp;tx_rmproducts_pi1[g]=937&lt;br/&gt;&amp;amp;tx_rmproducts_pi1[p]=3504&lt;br/&gt;&amp;amp;tx_rmproducts_pi1[v]=20088&lt;br/&gt;&amp;amp;cHash=abd12065683fe74b00eaa&lt;br/&gt;5e562824d06</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>Collagenase type IA from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2674</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094</td></tr><tr><td>Trypsin from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7409</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Warm to room temperature before use.&lt;br/&gt; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m mesh, disposable</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Cell strainer, 100 &amp;micro;m mesh, disposable</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m, polyethersulfone, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1</td></tr><tr><td>Acetic acid (glacial) 100%</td><td>Merck Millipore</td><td>1.00063</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063</td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>354236</td><td>From rat tail.&lt;br/&gt; https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&amp;amp;&lt;br/&gt;productid=354236%28&lt;br/&gt;Lifesciences%29#&amp;nbsp;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Pancreatin from porcine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3292</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630</td></tr><tr><td>Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821296</td><td>https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP</td></tr><tr><td>monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Tech</td><td>#5741</td><td>Use 1/500.&lt;br/&gt; http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2562</td><td>Use 1/1,000.&lt;br/&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&amp;amp;region=BE&amp;amp;gclid=&lt;br/&gt;Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw&lt;br/&gt;BEiQAI8rq&lt;br/&gt;879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f&lt;br/&gt;8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k&lt;br/&gt;8P8HAQ</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&amp;amp;region=BE</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11034</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&amp;amp;&lt;br/&gt;resultPage=1&amp;amp;&lt;br/&gt;resultsPerPage=15&amp;amp;&lt;br/&gt;autocomplete=&amp;amp;&lt;br/&gt;searchMode=keyword&amp;amp;&lt;br/&gt;productTypeSelect=antibody&amp;amp;&lt;br/&gt;targetTypeSelect&lt;br/&gt;=antibody_secondary&amp;amp;&lt;br/&gt;species=ltechall&amp;amp;keyword=&lt;br/&gt;488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor&amp;amp;reg;%20488\%22$;;</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11032</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&amp;amp;&lt;br/&gt;resultPage=1&amp;amp;&lt;br/&gt;resultsPerPage=15&amp;amp;&lt;br/&gt;autocomplete=&amp;amp;&lt;br/&gt;priorSearchTerms=&amp;amp;&lt;br/&gt;searchMode=keyword&amp;amp;&lt;br/&gt;productTypeSelect=antibody&amp;amp;&lt;br/&gt;targetTypeSelect=&lt;br/&gt;antibody_secondary&amp;amp;&lt;br/&gt;species=ltechall&amp;amp;&lt;br/&gt;keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html</td></tr><tr><td>DPBS, with calcium and magnesium</td><td>Gibco</td><td>14040174</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133</td></tr></tbody></table>

isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization

Sidualizasyonu endometrial stromal hücrelerin bir progesteron bağımlı farklılaşma süreci ve başarılı embriyo implantasyonu için bir ön koşuldur. pek çok çaba desidualizasyon mekanizmasının ortaya çıkarmak için yapılmış olsa da, embriyo ve altta yatan stromal hücreler ile temas halinde olan epitel hücreleri arasındaki kesin sinyal henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, desidualizasyon moleküler ayrıntıları hakkında bilgilerimizi getirebileceği dikkate epitelyal ve stromal hücreler hem götüren bir şekilde sidualizasyonu okuyan. Bu amaç için, suni desidualizasyon in vivo modellerde fizyolojik en alakalı; Bununla birlikte, hücreler arası iletişim manipülasyonu ile sınırlıdır. Şu anda, endometriyal stromal hücrelerin in vitro kültürler birçok sinyal molekülleri tarafından desidualizasyon modülasyonunu araştırmak için kullanılmaktadır. Geleneksel olarak, insan ya da fare endometriyal stromal hücreleriKullanılmış. Bununla birlikte, insan rezervden sıklıkla sınırlıdır. Bundan başka, fare dokularının kullanımı kültür yönteminde çeşitli eşlik etmektedir. Bu çalışma, saf Endometrial Epitel Hücre (AET) ve üç gün boyunca östrojen uygulanan erişkin sağlam fareler kullanılarak Stromal Cell (ESC) kültürleri elde etmek için valide ve standart bir yöntem sunar. protokol hücrelerinin verimi, canlılığı ve saflık geliştirmek için optimize edilmiştir ve daha AET ve ESC bir kokültürü içinde sidualizasyonu incelemek amacıyla genişletilmiştir. Bu model, desidualizasyon her iki hücre tipinde önemini yararlanma ve hücreler arası iletişim sırasında EEC veya ESC tarafından salgılanan önemli bir sinyal molekülleri katkısını değerlendirmek için uygun olabilir.

Protokolün Genel Bakış Şekil 1A protokolünün genel bir bakış göstermektedir. arka arkaya üç gün boyunca E2 (100 ng) bir günlük enjeksiyonu hayvanları senkronize etmek ve östrus döngüsü faz standardize etmek için kullanıldı. estrojen döngüsü vajinal lavaj ile değerlendirilebilir ve Proestrus, östrus, diöstrusun ve ostrus faz ayrılmıştır. döngüsü faz hormonal değişikliklere maruz lavaj dökülmüş hücrelerin oranına göre ifade edilebilir. östrojen düzeyleri artan hayvanlar kızışma faza gelişmeye yapacaktır. Bu aşama, kolayca özel olarak açığa çıkan epitel hücrelerinin varlığı ve lökositlerin yokluğunda (Şekil 1B) ile tespit edilebilir. 4. günde, östrus fazda hayvanların rahim toplanır ve MEEC ve MESC (Şekil 1C) izole edilir. desidualizasyon cBir 5 gün bir inkübasyon süresi boyunca 0.5 mM cAMP ve% 2 FBS ortamına 1 uM MPA eklenerek uyarılabilmektedir. MEEC ve MESC Kültürlerinin Kalite Kontrol Birincil hücre kültürlerinin saflığı vimentin ve sitokeratin ifade farkı ile değerlendirilebilir. Vimentin dolayısıyla endometriyal stromal hücrelerde, mezenşim hücrelerinde eksprese edilen bir ara madde filamenttir. Sitokeratin epitel doku hücre iskeleti içinde bulunan bir ara filamenttir. Şekil 2A MEEC ve Mesc vimentin ve sitokeratin mRNA ekspresyon seviyesi QRT-PCR kullanılarak değerlendirildi gösterir. Vimentin seviyeleri MEEC içinde Mesc yüksek ve düşük (yüksek 2.2X, p &lt;0.001), sitokeratin düzeyleri Mesc içinde MEEC yüksek ve düşük iken (36x yüksek, p &lt;0.001). Bir vimentin / sitokeratin çift boyama yapılmıştır ve stromal hücreler epit oysa vimentin ifade belirtilmiştirHelial hücreleri (Şekil 2B, C), sitokeratin ifade eder. Primer antikorun yokluğunda immün (Şekil 2D, E) için negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Bu immünohistolojik renklendirmeler hem endometriyal hücre kültürleri (MEEC ve MESC)% 90 kadar bir saflığa sahip olduğunu göstermektedir. MEEC / MESC cocultures sidualizasyonu İzolasyondan sonra, fare endometriyal stromal hücreleri endometriyal ortamı taklit etmek için bir ko-kültür sisteminde tohumlandı. Ve stromal hücreler bir alt konfluent devlet ulaştı - epitel hücreleri (/ kuyu 1.000 800 TEER değerlerini) hücre kültür insert içinde bir tek tabaka oluşuncaya kadar hücreler kültüre edildi. Sidualizasyonu 0.5 mM cAMP uygulama ve 1 uM MPA ile stromal hücrelerinde olduğu görüldü. İnkübasyondan beş gün sonra, prolaktin mRNA düzeyleri yaprak döken bir gösterge olarak QRT-PCR ile stromal hücrelerde değerlendirildiualization (Şekil 3A). Prolaktin seviyeleri yüksek hücre kontrol ortamı (p &lt;0.01) ile inkübe edilen hücrelerde hormon tabi tutulur ve tespit edilemeyen olarak ifade edildi. Epitel hücreleri, hücre kültürü ekler içinde görselleştirmek için sabit olduğu için, bir canlılığı deneyi beş günlük kuluçka süresi (Şekil 3B) hemen sonra uygulandı. normal büyüme ortamı ve bir canlılık reaktif bir karışımı oyuklarına ilave edildi ve en az 8 bir süre için kuluçkalanmıştır - 12 saat. parlak pembe mavi renk kayması epitel hücrelerinin mevcudiyetine işaret etmiştir. canlı hücreler mevcut olduğunda renk kayması yalnızca ortaya çıkar unutmayın. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> Şekil 1: Protokol Genel Bakış. (A), yalıtım protokol Şema üç ile başlayanÖstrojen enjeksiyonları ardışık gün. 3. günde, gerekli hazırlıklar hazırlanmalıdır. 4. günde, kızgınlık faz vajinal lavaj yapılarak (yıldız ile gösterilir) değerlendirilir. MESC ve MEEC farklı sindirim adımları kullanarak izole edilmiştir. Hücreler birleştiklerinde, ne 6. günde veya desidualizasyon orta ve beş günlük bir kuluçka dönemi (11 - Gün 6) için cAMP ve MPA eklenerek eş-kültür sistemine indüklenebilir. (B) vajinal lavajda bulunan kornifıye epitel hücrelerinin varlığı ile karakterize östrus fazın Örnek resmi (büyütme 10X). (C) Mesc ve MEEC Temsilcisi resmi (büyütme 20X, ölçek çubuğu: 100 mikron). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <strong&gt; Şekil 2: immünolekeleme MEEC ve Mesc vimentin ve sitokeratin nicel RT-PCR. (A) vimentin ve sitokeratin ifade haberci RNA düzeylerinin kültürlerin saflığını gösterir. RNA seviyeleri göreceli olarak temizlik genleri ACTB ve TBP geometrik ortalama ile ölçüldü. Veri ortalama ± SEM olarak gösterildi. MESC kültürleri (B) ve MEEC kültürleri (C) vimentin / sitokeratin çift boyama. Sol takın 63X büyütme görünümünü göstermektedir. Mesc (D) MEEC (E) için hariç primer antikor ile negatif kontrol (ölçek çizgisi: 50 um). ***: P &lt;çoklu test için Bonferroni düzeltmesi ile iki yönlü ANOVA ile 0.001. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3: RT-PCR aracılığıyla sidualizasyonu Doğrulama. Stromal hücrelerde prolaktin ekspresyon (A) mRNA seviyeleri desidualizasyon değerlendirmek. RNA seviyeleri göreceli olarak temizlik genleri PGK1 ve TBP geometrik ortalama ile ölçüldü. kontrol veya desidual ortam içinde kültürlenen hücrelerde kat değişimi ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. (B) (üst) ve sonra (alt) desidualizasyon uyaran önce stromal hücrelerin Örnek resimler. sağındaki Ek bir decidualized stromal hücre bir büyütme göstermektedir. Desidualizasyon siyah oklarla gösterilen çok çekirdekli hücrelerin varlığı ile karakterize edilir. (C), tahlil sonra ekleme epitel hücre canlılığının değerlendirilmesi Örnek ve görüntüler. Resimler canlılığı reaktifi idaresi (Prestoblue) (0 saat) ve f hemen sonra alındıollowing sabah (ON). **: P &lt;Mann-Whitney U testi ile 0.01. AÇIK: gecede. Ölçek çubuğu: 100 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization at JoVE.com

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Bu çalışma, in vitro desidualizasyon çalışma için Coculture sisteminde kullanılabilen birincil fare, endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu ve kültürü, bir standart ve geçerli bir yöntem sunulur.

Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için<em&gt; İn Vitro</em&gt; sidualizasyonu

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

isolation-mouse-endometrial-epithelial-stromal-cells-for-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

23.9K Görüntüleme.  Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven).  Bu çalışma, in vitro desidualizasyon çalışma için Coculture sisteminde kullanılabilen birincil fare, endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu ve kültürü, bir standart ve geçerli bir yöntem sunulur. 

Video: Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Gelişim Biyolojisi

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Tıp

Generation of a Mouse Artificial Decidualization Model with Ovariectomy for Endometrial Decidualization Research

Endometrial decidualization is a unique differentiation process of the endometrium, closely related to menstruation and pregnancy. Impairment of decidualization leads to various endometrial disorders, such as infertility, recurrent miscarriage, and preterm birth. The development and use of the endometrial decidualization model in reproductive studies have been a highlight for reproductive researchers for a long time. The mouse has been extensively used in studying reproduction and decidualization. There are three well-established mouse models regarding decidualization, namely natural pregnancy decidualization (NPD), artificial decidualization (AD), and in vitro decidualization (IVD). Among them, AD is considered a reliable model for mouse decidualization, which is easy to implement and close to NPD. This paper focuses on a modified method of the generation and application process of the mouse artificial decidualization model with ovariectomy to avoid ovarian effects, which can obtain highly reproducible results with small within group variances. This method provides a good and reliable animal model for the study of endometrial decidualization.

Here, we describe the method of generating an artificial decidualization model using the ovariectomized mouse, a classic endometrial decidualization experiment in the research field of endometrial decidualization.

Endometrial Desidualizasyon Araştırması için Ovariektomi ile Fare Yapay Desidualizasyon Modelinin Oluşturulması

Endometrial decidualization is a unique differentiation process of the endometrium, closely related to menstruation and pregnancy. Impairment of ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

A Syngeneic Murine Model of Endometriosis using Naturally Cycling Mice

Endometriosis is a leading cause of pelvic pain and infertility. It is defined by the presence of endometrial tissue in extrauterine locations. The development of novel therapies and diagnostic tools for endometriosis has been limited due in part to challenges in studying the disease. Outside of primates, few mammals menstruate, and none develop spontaneous endometriosis. Rodent models are popular but require artificial induction of endometriosis, with many utilizing either immunocompromised mice or surgically induced disease. Recently, more attention has been given to models involving intraperitoneal injection. We present a murine model of endometriosis that integrates several features of existing endometriosis models into a novel, simplified system that relies on microscopic quantification in lieu of subjective grading. In this model, we perform hormonal stimulation of donor mice, intraperitoneal injection, systematic abdominal survey and tissue harvest, and histologic quantification that can be performed and verified at any time after necropsy. This model requires minimal resources and training; does not require expertise by lab technicians in murine survival surgery or in the identification of gross endometriotic lesions; can be used in immunocompromised, immunocompetent, and/or mutant mice; and reliably creates endometriotic lesions that are histologically consistent with human endometriotic disease.

Many rodent models of endometriosis are limited by technical complexity, reproducibility, and/or need for immunocompromised animals or special reporter mice. We present a simplified system of lesion induction using any experimental mouse with an independently verifiable, objective scoring system and with no requirement for ovariectomy or survival surgery.

Doğal Bisiklet Fareleri Kullanarak Endometriozis Bir Syngeneic Murine Modeli

Endometriosis is a leading cause of pelvic pain and infertility. It is defined by the presence of endometrial tissue in extrauterine locations. The ...

Development of a Novel Endometrioma-Simulating Mouse Model

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

Endometrioma (OMA), a subtype of endometriosis characterized by the formation of endometriotic cysts in the ovaries, affects 17-44% of individuals diagnosed with endometriosis. Women with OMA often experience compromised fertility, yet the exact mechanisms underlying OMA-associated infertility remain unclear. Notably, existing animal models simulate superficial peritoneal endometriosis (SUP) and deep infiltrating endometriosis (DIE), leaving a notable gap in research focused on OMA. In response to the gap of knowledge, this paper introduces a pioneering OMA-simulating mouse model and provides a comprehensive description of the techniques and procedures employed in the model. With a high success rate of 83% and ovarian lesion specificity, this model holds significant promise for advancing our understanding of OMA, particularly in the context of infertility. It offers a valuable platform for conducting targeted research into OMA-associated fertility challenges, potentially paving the way for improved diagnostic and therapeutic strategies in the field of reproductive medicine.

This study introduces a novel mouse model specifically designed to simulate endometrioma, a clinically significant subtype of endometriosis. By utilizing C57BL/6J mice, the model aims to elucidate the pathophysiological mechanisms underlying endometrioma-related infertility, offering a refined tool to bridge the current knowledge gap in reproductive medicine.

Endometrioma (OMA), a subtype of endometriosis characterized by the formation of endometriotic cysts in the ovaries, affects 17-44% of individuals ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of luminal and glandular epithelium, a stromal compartment, a vascular network, and a complex immune cell population. Mouse models have been a powerful tool to study the endometrium, revealing critical mechanisms that control implantation, placentation, and cancer. The recent development of 3D endometrial organoid cultures presents a state-of-the-art model to dissect the signaling pathways that underlie endometrial biology. Establishing endometrial organoids from genetically engineered mouse models, analyzing their transcriptomes, and visualizing their morphology at a single-cell resolution are crucial tools for the study of endometrial diseases. This paper outlines methods to establish 3D cultures of endometrial epithelium from mice and describes techniques to quantify gene expression and analyze the histology of the organoids. The goal is to provide a resource that can be used to establish, culture, and study the gene expression and morphological characteristics of endometrial epithelial organoids.

This protocol describes methodologies to establish mouse endometrial epithelial organoids for gene expression and histological analyses.

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Biyoloji

Ishikawa Hücreleri ile İn Vitro Ko-Kültür Modelinde Embriyo Adezyonun Değerlendirilmesi

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic biological research, drug development, and screening. This paper presents a simple, rapid, and highly efficient in vitro model for embryo implantation. In this protocol, we first introduce mouse blastocyst acquisition and human endometrial adenocarcinoma cells (Ishikawa)&#160;preparation for implantation, followed by the co-culture method for mouse embryos and Ishikawa cells. Finally, we conducted a study to assess the impact of varying concentrations of 17-&#946;-estradiol (E2) and progesterone (P4) on embryo adhesion rates based on this model. Our findings revealed that high concentrations of E2 significantly reduced embryo adhesion, whereas the addition of progesterone could restore the adhesion rate. This model offers a simple and fast platform for evaluating and screening molecules involved in the adhesion process, such as cytokines, drugs, and transcription factors controlling implantation and endometrial receptivity.

Yazar Spotlight: Embriyo-Endometriyum Etkileşimlerini Analiz Ederek Gebelik Oranlarını İyileştirmek için Terapötik Stratejilerin Geliştirilmesi

This protocol describes methodologies to establish simple and efficient embryo implantation in vitro model for evaluating the relevant molecules affecting the embryo implantation process.

İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...

Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem

Endometrial Desidualizasyon Araştırması için Ovariektomi ile Fare Yapay Desidualizasyon Modelinin Oluşturulması

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Doğal Bisiklet Fareleri Kullanarak Endometriozis Bir Syngeneic Murine Modeli

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması

İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması

İn Vitro Embriyo İmplantasyon Modelinin Kurulması