Name: rearing and double-stranded rna-mediated gene knockdown in the hide beetle, dermestes maculatus
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus at JoVE.com

We thank Drs. Alison Heffer and Yong Lu for setting up the microinjection apparatus and sharing their invaluable knowledge and experience with insect RNAi. This work was supported by the National Institutes of Health (R01GM113230 to L.P.).

D. maculatus 1. Yetiştirme NOT: D. maculatus bir üreme kolonisi yetişkinler kullanan yazarların laboratuarında kurmak ve larva ticari satın alındı. Türler kimlik DNA barkodu 53 kullanılarak doğrulanmıştır. <ol><li> Laboratuvarda yeni bir kafes kurmak için, bir orta boy böcek kafes (30.5 x 19 x 20.3 cm 3) içine talaş ince bir tabaka yayıldı. Pupa devresi için larva gizlemek izin kafes içinde strafor bir ~ 10 x 6 x 3 cm 3 yığın yerleştirin. 50 böcekleri (yetişkin veya geç dönem larva ya) - 20 ekleyin. Böcekleri talaş içinde gizler. </li><li> Petri kabı veya bir tartı tekne ıslak kedi maması ekleyin. örgü bezle kafes örtün ve bir kuluçka kafesine yerleştirin. </li><li> Laboratuvarda bir üreme kolonisi korumak için, 25 ve 30 ° C arasında sıcaklığını ayarlamak. D. maculatus hızlı yüksek sıcaklıklarda büyür, ama bu da mantar ve parazitlerinin büyümesini destekler. Bir iyileşmek sağlamak içinhızla koloni genişletilmesi için düzenli stok bakım ve 30 ° C 28 ° C - senin koloni, 25 kullanın. Yaşam döngüsü çevresel faktörlerin 50 (Şekil 2) bağlı dört ay yaklaşık üç hafta sürer. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig2.jpg" /> Şekil 2: D. maculatus Lab Colony. Tipik bir D. maculatus böcek kafes Fotoğraf gösterilir. Ahşap talaşı böcekleri gizlemek izin yayılır. Kedi maması küçük bir Petri çanağı veya tartım kabı ilave edilir. Strafor pupa son evre larvaları için bir sığınak olarak kafes yerleştirilir. Burada gösterilen kafes 30.5 x 19 x 20,3 cm 3 ve birkaç yüz larva, pupa ve yetişkin ev sahipliği yapmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> otlakolgun kafeste yumurta ettik. , Koloni genişletmek yukarıdaki gibi, larva veya yetişkin (Bölüm 2 açıklandığı gibi toplanan) yumurta ile yeni kafeslerin kurmak. D. maculatus özellikle gıda kaynağına yakın, kafes boyunca yumurtalarını. </li><li> haftada iki kez hakkında ıslak kedi maması değiştirin. NOT: Islak kedi maması nahoş koku, alternatif gıda kaynakları da test edildi dolayı (Tartışma). </li></ol> 2. Embriyo Koleksiyon <ol><li> Bir koleksiyon kurmak için, en az 50 erkek ve koloniden 50 kadın ayırın. Genç yetişkinler en iyisidir. Talaş olmadan küçük boyutlu kafes (17.8 x 10.2 x 12.7 cm 3) yerleştirin yetişkinler. Bir tartı tekne kedi maması ekleyin. </li><li> toplama başlamadan önce, mevcut herhangi bir embriyolar için dikkatli kafes kontrol edin ve bunları kaldırın. kafesin içine bir gergin pamuk koyun ve 30 ° C inkübatör kafesi bırakın. Uygun zaman penceresi sonra, pamuk embriyo toplama için hazır olacak. </li><li> Katyarısında siyah inşaat kağıt (A4 boyutunda) bir parça bir kırışık oluşturabilir ve sonra açılmak. </li><li> kafes uzanan pamuk çıkarın. pamuk gelen yetişkin çıkarın ve kafes içine geri koyun. </li><li> çok yavaşça gergin pamuk sıkarken, yumurta, siyah kağıda düşürdüm ince pamuklu iplikler halinde ayrı yavaşça gözyaşı. NOT: D. maculatus embriyolar pamuk görmek kırılgan ve sert. Çok sıkı bir pamuk topu tutan eğer kolayca ezilebilir. </li></ol> 3. dsRNA Hazırlık <ol><li> DsRNA Sentezi için DNA şablonu hazırlama <ol><li> 4 başlat - her ikisi de 5 de T7 hızlandırıcı sekanslar ihtiva eden primerler kullanılarak 6 50 ul PCR reaksiyonları &#39;üreticinin protokolüne uygun olarak, DNA şablonu amplifiye edilmesi için sona erer. </li><li> imalatçının talimatları izlenerek bir ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. DNA örneğinin ideal nihai konsantrasyonu ≥ olduğunu100 ng / ml. </li></ol></li><li> Enjeksiyon Tampon hazırlanması <ol><li> Enjeksiyon tamponu 100 ml hazırlama (0.1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM KCI). 5 M NaOH ile 6.8&#39;e pH ayarlayın. </li><li> -20 ° C&#39;de saklayın alikotları. </li></ol></li><li> dsRNA sentezi <ol><li> ~ Reaksiyon başına 500 ng şablon kullanılarak, buz üzerinde 0.2 mi PCR tüpü içinde reaksiyonu başlatacak ve imalatçının talimatları izlenerek, T7 polimeraz, bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu yürütmek. </li><li> gece boyunca 37 ° C&#39;de tüp inkübe edin. </li><li> üreticinin talimatlarına aşağıdaki DNaz DNA şablonu, sindirmek. </li><li> 94 ° C&#39;ye kadar tüp ısı ve 3 dakika boyunca 94 ° C&#39;de tutun. </li><li> Bu 1 saat sonra 45 ° C&#39;ye ulaşana kadar dsRNA tavlanması için yavaşça 1 ° C / dk, boruyu soğutulur. NOT: 3.3.5 ile 3.3.2 PCR yapılabilir adımlar. </li><li> dsRNA çökelti etanol, 280 ulReaksiyonun RNaz içermeyen su için 20 ul 300 ul bir son hacme kadar ayarlayın. 3 M NaOAc (pH 5.2) ve etanol içinde 650 | il 30 ul ekle. bir gecede -20 ° C derin dondurucuda tüp yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 15.682 x g&#39;de santrifüj işleminden geçirilmesinden sonra,% 70 etanol ile dsRNA pelet yıkayın. Kuru pelet ve enjeksiyon tampon ul 20 içinde çözülür. </li><li> 260 bir spektrofotometre kullanılarak dsRNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. 5 ug / ul - İdeal konsantrasyon 3&#39;tür. 30 dakika süre ile 90 V bir% 1 agaroz jeli üzerinde dsRNA 1:25 seyreltme 5 ul çalıştırarak kalitesini kontrol edin. beklenen boyutta tek bir bant kolaylıkla görülebilir. </li><li> -20 ° C veya altında dsRNA saklayın. NOT: Her RNAi demonte deney için, çalışılan süreci etkilemesi beklenmektedir olmaz bir denetim dsRNA içerir. GFP dsRNA çoğu deneyler için mükemmel bir kontroldür. Hazırlayın ve experime kontrol dsRNA yan yana enjektental dsRNA&#39;nın. </li></ol></li></ol> Mikropüskürtücü ve Mikromanipülatör 4. Montaj NOT: Şekil 3 bakınız. <ol><li> pnömatik pompa aracının basınç girişine azot veya diğer hava kaynağını bağlayın. pnömatik pompa mevcut değilse, ince boru bağlı bir 50 ml şırınga ile basınç uygulanır. </li><li> çıkarma basınç akışını kontrol etmek için pompanın uzaktan konnektörüne bir ayak anahtarı bağlayın. </li><li> tüp ile pompanın çıkarma basınç portuna bir cam kılcal tutucu takın. </li><li> Bir mikroskop yakın bir mikromanipülatör kılcal tutucu sabitleyin. </li></ol> 5. Embriyonik RNAi Not: Şekil 4, D. maculatus embriyonik RNAi bir akış şemasını göstermektedir. <ol><li> eRNAi hazırlanması <ol><li> Petri kabı kapağı (90 mm çapında) toplama bir embriyo hazırlayın. c siyah filtre bir parça kağıt yerleştirinKapağın iç bitti. siyah kağıt üzerinde standart bir mikroskop lamı koyun. </li><li> Enjeksiyon tamponu ile uygun bir konsantrasyona kadar dsRNA seyreltilir. İlk deneyler için 3 ug / ul - 2 kullanın. Her zaman enjeksiyondan önce buz üzerinde dsRNA tutun. </li><li> iyice karıştırın dsRNA ve pipet yavaşça birkaç kez 01:40 seyreltme gıda boyası ekleyin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için toplanıyor Embriyolar NOT: 25 ° C&#39;de, embriyoların 6 çekirdekleri - 8 saat Yumurta Döşeme sonra (AEL) 53 çevre yumurtaya doğru göç ederler. 10 saat AEL 53 - Bir hücresel blastoderm 8 içinde kurulmuştur. 3 saat AEL embriyolar kullanım 53 için önerilen - sağlamak için hücresel blastoderm aşamasında önce embriyolar 0, enjeksiyon için kullanılır. cam kapilerleri iyi durumda olup olmadığını Embriyo toplama, hazırlama ve enjeksiyon genellikle az 2 saat sürebilir. Bu nedenle, tüm süreç 5 saat AEL içinde tamamlanabilir. <ol><li> adımlarda açıklandığı gibi embriyolar toplayın 2.2-2.5. </li><li> Petri kabı kapağı toplama içine embriyo transferine siyah inşaat kağıt dokunun. </li><li> slayt kenarı boyunca çift taraflı bant yapıştırın. </li><li> Bir boya fırçası kullanarak, kenarında anterior ve posterior ucu ile slayt kenarına dik kasete embriyolar hizalayın. ortalama yarım ideal arka sonunda enjekte edilecektir böylece üzerinde, erken embriyo anterior ve posterior uçları kolayca ayırt olmadığını unutmayın. </li></ol></li><li> Kılcal cam içine dsRNA yükleniyor <ol><li> 20 ul Microloader pipet içine dsRNA 4 ul - 2 alın. </li><li> önceden çekilmiş cam boru içine ucu takın (iğne olarak da adlandırılır) ve yavaşça kapiller dsRNA solüsyonu pipetle. Mikropipet çektirmenin kullanarak ticari cam kılcal damarlardan iğneler hazırlayın. İdeal çekilmiş iğnenin bir örneği Şekil 5&#39;te gösterilmektedir. uzunluğu ve iğne konik af optimize edilmesi gerekebilirter enjeksiyon denemeleri. </li><li> kılcal cam tutucu içine cam kapiller sabitleyin. </li><li> mikromanipülatör içine kılcal tutucu monte edin. </li></ol></li><li> Embriyolar içine dsRNA enjekte <ol><li> Dikkatle diseksiyon mikroskobu sahneye embriyolar ile slayt aktarın. </li><li> alan ve odak mikroskop merkezine bir embriyo getirmek için slayt taşıyın. </li><li> mikroskop içine bakarken mikromanipülatör ile kılcal ucu yerleştirin. satırdaki ilk embriyonun sonuna yakın ucu getir. </li><li> azot ya da diğer hava beslemesini açın. </li><li> vakum selenoid giriş seçme anahtarını ayarlayın. </li><li> 15 psi - 10 çıkarma basınç regülatörü ayarlayın. aparat bağlı basıncını ayarlayın. </li><li> Gerekirse kılcal açın. ucu açık olduğunda, renkli dsRNA çözüm ucu dolduracaktır. </li><li> e delinme ileri kılcal ucu Taşımbryo. Basınç ayarı idealdir ise, hiçbir embriyonik sıvı kılcal akacaktır. </li><li> çözümün uygun bir miktar çıkarılana dek embriyo içine dsRNA çözüm çıkarmak için ayak anahtarı Adım. Çözümün uygun ve uygun olmayan miktarlarda enjekte edildikten sonra Şekil 5 embriyo morfolojisi örneklerini gösterir. </li><li> ~ 2 saniye embriyo içinde kılcal ucu tutun ve sonra çıkarın. </li><li> Bir sonraki embriyonun kılcal hareket ettirin ve tekrar 5.4.8 adımları - tüm embriyolar enjekte kadar 5.4.10. Tıkanmış veya sonları alırsa cam kapiller değiştirin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon sonrası kurtarma ve Kuluçka <ol><li> Enjeksiyondan sonra, bir Petri kabındaki slayt yerleştirin. </li><li> Petri kabı ıslak pamuk ekleyin. pamuk slayt dokunmasına izin vermeyin. </li><li> Petri kabı Kapak ve filmi sızdırmazlık ile sarın. Enjekte dsRNA, konsantrasyon, tarih, saat, sayısı ve adı ile çanak Etiketembriyolar. </li><li> Embriyoların yumurtadan kadar 30 ° C inkübatör Petri kabı yerleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Ebeveyn RNAi <ol><li> PRNAi için Pupalar Ayırma <ol><li> koloniden pupa toplayın. </li><li> Sıralama erkek ve mikroskop altında dişi pupa (Şekil 6). Resim birleşme enjeksiyondan önce cereyan etmesini sağlamak üzere 30 ° C kuluçka makinesi içinde, iki ayrı bir Petri tabaklarına tutun. </li><li> eclosed yetişkinler için her gün kontrol edin. 30 ° C &#39;de 7 gün - pupa devresi, genellikle 5 alır. </li><li> Aktarım eclosed erkek ve kadın iki ayrı Petri kapları (Şekil 6) ve enjeksiyon için hazır olana kadar her gün onları kedi maması yem. </li><li> Yeterince kadın ve uygun yaşta erkek var bir kez enjeksiyon geçin. post-eclosion Dişiler 4 ila 8 gün en iyisidir. Tipik bir analiz için 8-12 kadın kullanılmaktadır. Erkeklerin eşit sayıda 54 çiftleşme için gereklidir. </li></ol></li&gt; <li> Kadın Karın içine dsRNA enjekte <ol><li> buz (5.1.2 ve 5.1.3) üzerinde dsRNA hazırlayın. </li><li> 10 ul şırıngaya 32 gauge iğne takın. </li><li> CO 2 sahnede kadın Anesteziyoloji. </li><li> herhangi bir hava almadan enjektöre dsRNA çözüm yükleyin. </li><li> Bir yandan bir kadın ventral tarafı yukarı tutun ve diğer şırınga tutun. </li><li> Yavaşça iğne ucu ile sternites 2 ve 3 arasında segmacoria (membran) nüfuz eder. Şekil 7, enjeksiyon sırasında bir dişi göstermektedir. İğne kolaylıkla dokuya nüfuz etmezse, açı iğne yukarı ve yavaş yavaş aşağı doğru bastırın. vücuda iğne yaklaşık 2 mm yerleştirin. </li><li> yavaş yavaş dişi başına ~ 2 ul enjekte dalgıç iterken şırınga ölçeğini kontrol edin. </li><li> enjekte ettikten sonra, dişinin karın çıkarmadan önce en az 5 saniye boyunca hareketsiz iğne tutun. </li><li> (Petri kabı enjekte kadın aktarın90 mm çap) ve kedi maması ile beslenirler. </li><li> dsRNA adı, enjekte edilen miktarın, tarih ve dişilerin sayısı ile Petri kabı etiketleyin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon sonrası kurtarma ve Çiftleşme <ol><li> 30 ° C inkübatör Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 24 saat sonra, transfer mini kafese kadın enjekte edilmiştir. </li><li> Kafesin uninjected genç erkeklerin eşit sayıda ekleyin ve kafesi etiketleyin. </li><li> kafesin içine kedi maması ile tartı tekne ekleyin. </li><li> birleşmesine olanak tanımak için 30 ° C kuluçka makinesi içinde kafes bırakın. 24 saat sonra, dişiler yumurtalarını bırakmak için başlamalı ve embriyolar günlük veya gerekli zaman aralıklarında alınabilir. </li></ol></li></ol> 7. Fenotipik Analizi sonra RNAi NOT: yumurta 50 yumurtadan 30 ° C&#39;de, o ~ 55 saat sürer. <ol><li> eRNAi Canlılık Analizi <ol><li> toplam nu için yumurtadan larva sayısını karşılaştırarak ambar oranını hesaplamakenjekte edilen embriyoların mber. embriyolar zarar veya enjeksiyon prosedürü tarafından öldürülen edilebilir bir negatif kontrol enjeksiyonu dahil emin olun. % 60 - Tipik ambar oranları% 30 arasında değişmektedir. çıkmamış yumurta yeme yumurtadan larva sakının. </li></ol></li><li> pRNAi Canlılık Analizi NOT: kadın canlılığı RNAi tarafından hedeflenen gen tarafından etkilenirse, dişiler belirli dsRNA enjekte değil negatif kontrol dsRNA ölmeye başlayacak. yumurta üretimi veya yumurtlama etkilenirse, dişiler kısmi veya tam kısırlığa sergileyecek. negatif kontrollere kıyasla kadın yaşamını Puan ya da deney ve kontrol kadın (7.2.3) tarafından atılmıştır yumurta sayısını karşılaştırın. <ol><li> Adım 2.2 Aşağıdaki embriyo toplama ayarlayın. </li><li> 2,5-24 saat sonra, adım 2.4 Aşağıdaki embriyolar toplar. </li><li> embriyo sayısını saymak. </li><li> 90 mm petri embriyoların transferi. embriyoların hedeflenen gen, toplama tarihi ve numarası ile Petri kabı etiketleyin. </li&gt; <li> onlar yumurtadan kadar 30 ° C inkübatör embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. çıkmamış embriyolar üzerinde yumurtadan larva besleme yana, forseps (Tartışma) kullanılarak çıkmamış embriyolardan Petri kabı sık sık ve ayrı yumurtadan larva kontrol edin. </li><li> yumurtadan embriyoların sayısını ve ambar oranını hesaplamak. </li></ol></li><li> Yumurtadan larva içinde Kütikül Kusur incelenmesi <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde Yumurtadan Çıkmış Larvalarına toplayın. </li><li> Bir duman başlığı içinde, sabitleme çözeltisi 1 ml. </li><li> Çözelti larva doku nüfuz için en az bir gece süreyle 4 ° C&#39;de mikrosantrifüj tüpü terk. </li><li> görselleştirmek için, mümkün olduğu kadar tüpten kadar fiksatif çıkarın. </li><li> PBST ile durulayın larva en az üç kez. </li><li> PBST sonu olmayan bir P-1000 pipet kullanarak bir çok kuyu cam plaka Transfer larva bunu genişletmek için kesti. </li><li> bir mikroskop altında, kusurları incelemek için forseps kullanarak larva germek. bent sabitleştirici vücutları sözleşme olarak kusurları incelemek için larva germek için kritik öneme sahiptir. </li></ol></li><li> Çıkmamış Larva içinde Kütikül Kusur incelenmesi Not: Bu prosedür özellikle kuluçka için hayatta olmayan embriyolar için, erken embriyonik fenotip incelenmesi için yararlıdır. <ol><li> pRNAi için Petri kabı (7.2.4) içine PBST ekleyin ve son kesti ile P-1000 pipet kullanarak 1.5 ml mikrosantrifüj tüp çıkmamış embriyolar transfer. eRNAi için mikroskop lamı kapalı Petri kabındaki (5.5.4), fırça çıkmamış embriyoların içine PBST ekleyin ve bir mikrosantrifüj tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Sabitleme Çözümü ile embriyolar Fix ve adımları 7.3.2 Aşağıdaki görselleştirme PBST ile durulayın - 7.3.6. </li><li> forseps kullanarak, PBST bir mikroskop altında yumurta kabuğu dışarı embriyolar incelemek. </li><li> Lütfen bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (• Her bir tüp içinde embriyo 200 ul) embriyoların transferi. </li><li> kadar sol kaldırmümkün Katkı. </li><li> % 90 Laktik asit /% 10 EtOH 1 ml ilave edilir. En az gece boyunca 60 ° C&#39;lik bir kuluçka makinesi içinde santrifüj tüpü boş. Not: Embriyolar birkaç gün boyunca 60 ° C &#39;de bırakılabilir. </li><li> embriyolar monte etmek için, uç kesti ile P-1000 pipet kullanarak bir mikroskop lamı üzerine onları pipetle. </li><li> El ile ideal bir yönelime forseps ile embriyoların yerleştirin. </li><li> Bir kapak kayma ile embriyolar Kapak ve DIC kullanarak mikroskop altında görselleştirmek. </li></ol></li><li> Hücresel ve Moleküler Hataları incelenmesi Not: Bu yordam manikür kusurları eşlik etmez manikür fenotipleri veya letalitesinin yatan nedenleri araştırmak için yararlıdır. <ol><li> pRNAi için uygun gelişim aşamasında pamuk topları ayrı embriyolar ve embriyo toplama sepet içine aktarabilirsiniz. Toplama sepeti, aynı veya Drosophila embriyo koleksiyonları için kullanılana benzer olabilir. <ol><li> Yapmakkaldırıldı şişenin dibinde ile 25 ml&#39;lik plastik sintilasyon flakon yumurta sepeti ve kapağın (kabaca 1 cm çapında) dışında bir daire kesilmiş. süper ince bir daire kapağının iç çapı yaklaşık 2.5 cm örgü yerleştirin ve ardından parıldama ampulünün vida ve baş aşağı kullanın. </li><li> Embriyolar yıkanır sonra ağ kolayca çıkarılabilir de, örgü yapışma bir embriyo kurtarma su ile mikrosantrifüj tüpü içinde örgü bırakın. </li></ol></li><li> eRNAi için, uygun bir aşamada, bir Petri kabı PBST ekleyin. mikroskop lamı kapalı embriyolar fırçalayın ve bir embriyo toplama sepeti aktarabilirsiniz. NOT: Fiksasyon, in situ hibridizasyon, antikor boyama ve nükleer boyanma protokolleri Xiang vd bulunabilir. 2015 53. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Gelişmiş model sistemler (fareler, sinekler, solucanlar) az sayıda 20. yüzyılda geliştirilen iken, 21. yüzyılın yeni hayvan sistemlerinin bir dalga tüm dünyada laboratuvarlarında geliştirilen gördü. Bu yeni sistemler bilim yalnızca &#39;standart&#39; modeli sistemleri kullanılarak tanınacak olamaz karşılaştırmalı evrimsel soruları için izin verir. yeni modellerin Bu dağıtım laboratuvar kültürleme, gen tanımlama ve yeni türlerde fonksiyonel yaklaşımları yöntemleri...

1998, yangın ve Mello çift zincirli RNA (dsRNA) Caenorhabditis elegans 1 gen işlevinin engellenmesi uyarabilir bildirmiştir. DsRNA ile tetiklenen Bu yanıt bir RNA interferans (RNAi) olarak adlandırılmıştır, ve RNAi aracılı gen susturma hayvan, bitki ve mantar 2-7 korunmuş olduğu bildirilmiştir. Bitkiler ve bazı hayvanlarda, RNAi fonksiyonları sistemik, yani etkisi (8-10 gözden) dsRNA doğrudan tanıtıldı değil diğer hücre / dokulara yayılabilir. Bilim adamları, böylece doğrudan (11-14 gözden) genomu manipüle etmeden gen fonksiyonu aşağı vurma, ilgi genleri hedef dsRNAs tasarlayarak bu endojen hücresel RNAi tepkisinin kullanımı yaptık. RNAi aşağıdaki avantajları nedeniyle fonksiyonel çalışmalar için güçlü bir araçtır. İlk olarak, daha az gen sekansı bilgileri ile bir gen RNAi kullanılarak hedeflenebilir. Bu st için özellikle önemlidirgenomik veya transkriptomik verileri eksik olmayan model organizmaların udies. İkinci olarak, RNAi yanıtı sağlam sistemik organizmalarda, RNAi aracılı gen yok etme hemen hemen herhangi bir gelişme aşamasında gerçekleştirilebilir. Bu özellik, pleitropik genlerin işlevini çalışmak için çok yararlıdır. Üçüncü olarak, bazı durumlarda, RNAi etkileri fenotipleri yavrular 15,16 görülmektedir, öyle ki gonadlar ve soyu, yayıldı. Tek bir enjekte ebeveyn tarafından üretilen çok sayıda yavru yumurta doğrudan manipülasyonu olmadan muayene edilebilir ebeveyn RNAi (pRNAi) olarak bilinen bu fenomen, embriyonik gelişmeyi etkileyen genler için özellikle avantajlıdır. Bu nedenlerden dolayı, pRNAi tercih edilen bir yöntemdir. pRNAi etkisiz, ancak oogenez için gerekli olan genlerin, örneğin, daha sonra embriyonik RNAi (eRNAi) kullanılmalıdır. Dördüncü olarak, RNAi mutlaka kusurlar zayıf üretilmesi için dsRNA miktarı aralığında değişebilir teslim edilen bir alelik dizi eşdeğer oluşturmak için kullanılabilir. fenotipleri Böyle bir derece geni ölümcül bir kompleks süreci ve / veya fonksiyon tam kaybı söz konusu olduğunda gen fonksiyonu anlamak için yararlı olabilir. Beşinci olarak, dsRNA teslim özellikle sağlam sistemik RNAi yanıtları gösteren hayvanlarda genellikle kolay ve mümkündür. dsRNA mikroenjeksiyon 1,5, beslenme / yutma 17,18, ıslatma, 19,20 ve virüs / bakteri aracılı teslim 21,22 sokulabilir. Altıncı, bazı gen hedefleme / düzenleme yöntemlerin aksine, mutasyonu taşıyan organizmalar için ekrana veya RNAi kullanırken homozigotlarını üretmek için genetik haçlar yürütmek için gerek yoktur. Bu nedenle, gen fonksiyonu incelemek için pek çok teknikler ile karşılaştırıldığında, RNAi ucuz, hızlı ve büyük ölçekli ekranlar 23-25 için uygulanabilir. RNAi geniş bir kullanım Beyon çalışma için uygun türlerin yelpazesini genişleterek, organizmaların geniş bir fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir araç sağlarGenetik araçlar geliştirilmiştir olan geleneksel model sistemler d. Örneğin, sigara modeli sistemleri kullanılarak çalışmalar farklı gelişim modları temsil veya farklı morfolojik özellikler 26-29 sergileyen türlerden ortologlarda işlevlerini karşılaştırarak genler ve gen ağlarının evrimi anlayışlar vermek zorundadırlar. Bu tür çalışmalar uygulamalı ve temel hem de araştırma için etkileri olan, biyolojik çeşitliliğin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Gezegendeki en büyük hayvan grubunda olmak, böcekler mekanizmaları altta yatan çeşitliliğini keşfetmek için büyük bir fırsat sağlamaktadır. Ayrıca, böcekler, genellikle küçük, kısa yaşam döngüleri, yüksek doğurganlığını var ve laboratuarda arka kolaydır. Son yirmi yılda, RNAi başarıyla Diptera (gerçek sinekler) 5, Lepidoptera (Kelebekler) 30 olmak üzere, emirleri kapsayan böceklerde tatbik edilmiştir, Coleoptera (böcekleri) 16,31, Hymenoptera (sawfyalan, Arı, karınca ve arılar) 32, Hemiptera (gerçek böcek), Isoptera (termitler) 34, Blattodea (hamamböceği) 35, Orthoptera (cırcır, çekirge, çekirgeler ve çekirgeler) 36 ve Phthıraptera (bitler) 37. RNAi başarılı bir uygulama, ekdison 42 sinyalizasyon, erken embriyogenez desenleme çalışmaları için fonksiyonel verileri (ön-arka eksen 32, dorsal-ventral eksen 28, segmentasyon 26,38), cinsiyet tayini 39,40, kitin / manikür biyosentezini 41 sağladı sosyal davranış 43, ve daha fazlası. Farklı böcek türleri için geliştirilmiş RNAi yöntemler de (44-46 gözden) haşere kontrolü için yararlı olması muhtemeldir ki ek bir fayda olabilir. RNAi etkileri olmayan korunmuş bölgeler hedefleme için seçilen sürece, gene özel ve türe özgü olacaktır. yaşaması için hayati genleri hedef bal arıları ve ipek böceği gibi yararlı böcek türlerinin, içinenfeksiyon kontrol etmek için virüs veya parazitler bu türlerin 47,48 korumak için yeni bir strateji sağlayabilir. Dermestes maculatus (D. maculatus), ortak adı gizlemek böceği, Antarktika hariç tüm dünyada dağıtılır. Bir holometabolous böcek gibi, D. maculatus yaşam döngüsü embriyonik larva, pupa ve erginleri (Şekil 1) içerir. O eti beslenir, çünkü D. maculatus ölü hayvanları iskeletini için müzelerde kullanılan ve adli entomologlar ölüm 49,50 zamanını tahmin etmek için kullanabilirsiniz. D. maculatus gövdeleriçin, kurutulmuş et, peynir ve pupa / diğer böceklerin koza de dahil olmak üzere hayvansal ürünlerde beslenir ve böylece hane zarar, depolanmış gıda ve ipek, peynir ve et endüstrileri 51,52 neden olur. Bu böceği de RNAi uygulayarak ekonomik etkisini en aza indirmek için etkin ve çevre dostu bir şekilde sağlayabilir. Bizim laboratuvar, yeni bir m olarak D. maculatus kullandıodel böcek segmentasyonu 53 incelemek için. O kısa ve uzun mikrop gelişimi arasındaki geçişi incelemek için kullanışlı bir tür yapma, bir ara-germ geliştiricisi olarak laboratuvar yetiştirme mükellef olmasının yanı sıra, D. maculatus temel araştırmalar için ilgi çekicidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg" /> Şekil 1: D. maculatus Yaşam Döngüsü. Belirtildiği gibi farklı yaşam evrelerinde D. maculatus Fotoğraf,. yetişkine yumurtadan ömrü daha düşük sıcaklıklarda, üç ila 30 ° C &#39;de hafta ama daha uzun sürer. (A, K) Yeni bırakılmış embriyolar yaklaşık olarak boyuna 1.5 mm, açık sarı ve oval beyazdır. Embriyo ~ 30 ° C &#39;de 55 saat sürer. (B, C ve G) Larva koyu pigmentli çizgili ve kıl ile kaplıdır. Larva 1 üzerinde cm&#39;ye kadar uzatabilirsiniz çevre ve uzunluklarına bağlı olarak birkaç instars geçmesi. (D, H) </strong&gt; Genç pupa sarı ışık bulunmaktadır. 30 ° C &#39;de 7 gün - pupa devresi ~ 5 alır. Kısa bir süre eclosion sonra (E, ben), koyu pigmentasyon yetişkin böceği vücut üzerinde görünür. Yetişkin birkaç ay kadar yaşayabilir ve bir kadın yaşamı boyunca embriyo yüzlerce düzenleyebilirsiniz. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Daha önce, RNAi D. maculatus 53 gen fonksiyonunu aşağı vurma etkili olduğunu göstermiştir. İşte laboratuvarda D. maculatus kolonileri yetiştirme deneyim embriyonik ve ebeveyn hem RNAi set-up, enjeksiyon, enjeksiyon sonrası bakım ve fenotipik analizi için adım-adım protokolleri ile birlikte paylaşılır. Burada tanıtılan dsRNA aracılı gen demonte ve analiz yöntemleri D. maculatus soruları ele almak için ayrıntılı bilgi sağlar, fakat aynı zamanda fo potansiyel öneme sahip değilr olmayan diğer modeli böceği / böcek türlerinde RNAi uygulamak.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Dermestes maculatus&lt;/em&gt; live beetles</td><td>Our lab or Carolina Biological Supply</td><td>#144168</td><td>Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out</td></tr><tr><td>Wet cat food</td><td>Fancy Feast</td><td></td><td>Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores</td></tr><tr><td>Dry dog food</td><td>Purina Puppy Chow</td><td></td><td>Can buy at most pet food and grocery stores</td></tr><tr><td>Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>For colony maintenance. Can use larger cage if needed</td></tr><tr><td>Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>For embryo collection</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>Cotton ball</td><td>Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 transcription kit</td><td>Fisher</td><td>AM1334</td><td>For 40 reactions</td></tr><tr><td>Pneumatic pump</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary holder</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Black filter paper (90&amp;nbsp;mm)</td><td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>Food coloring (green)</td><td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Hilgenberg</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller (micropipette puller)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscope glass slide</td><td>WorldWide Life Sciences Division</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>Sealing film (Parafilm M)</td><td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Model 801 Syringe (10&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>Needle (32-gauge)&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>Fixation Solution (Pampel&#039;s)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>Toxic, needs to be handled in fume hood</td></tr><tr><td>Forcep (DUMONT #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5)</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscopy for embryo injection</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. V12</td><td></td></tr><tr><td>DIC microscopy</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager. M1</td><td></td></tr></tbody></table>

rearing and double-stranded rna-mediated gene knockdown in the hide beetle, dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Yazarların laboratuar böcekler 53,55 yılında segmentasyon düzenleyen genlerin fonksiyonel evrimini incelemek için RNAi teknolojisini kullandı. Tüm böcekler Parçalara edilirken, bu süreci düzenleyen genlerin böcek radyasyonlar 26,38,56-63 sırasında ayrılmaktadır görünmektedir. Drosophila genetik ekranlar vücut segmentlerinin 64-70 oluşumunu teşvik sorumludur dokuz çift-kural segmentasyon genlerinin bir dizi belirledi. Burada...

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus at JoVE.com

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

10.6K Görüntüleme.  University of Maryland.  Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır. 

Video: Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Çevre

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Nörobilim

Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, morphology, and behavior drastically from aquatic larvae to terrestrial/aerial adults without pupal stage. Odonata adults have a well-developed color vision and show a remarkable diversity in body colors and patterns across sexes, stages, and species. While many ecological and behavioral studies on Odonata have been conducted, molecular genetic studies have been scarce mainly due to the difficulty in applying gene functional analysis to Odonata. For instance, RNA interference (RNAi) is less effective in the Odonata, as reported in the Lepidoptera. To overcome this problem, we successfully established an RNAi method combined with in vivo electroporation. Here we provide a detailed protocol including a video of the electroporation-mediated RNAi method as follows: preparation of larvae, species identification, preparation of dsRNA/siRNA solution and injection needles, ice-cold anesthesia of larvae, dsRNA/siRNA injection, in vivo electroporation, and individual rearing until adult emergence. The electroporation-mediated RNAi method is applicable to both damselflies (suborder Zygoptera) and dragonflies (suborder Anisoptera). In this protocol, we present the methods for the blue-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) as an example of damselfly species and the pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) as another example of dragonfly species. As representative examples, we show the results of RNAi targeting the melanin synthesis gene multicopper oxidase 2. This RNAi method will facilitate understanding of various gene functions involved in metamorphosis, morphogenesis, color pattern formation, and other biological features of Odonata. Moreover, this protocol may be generally applicable to non-model organisms in which RNAi is less effective in gene suppression due to the inefficiency and low penetrance.

We provide a detailed protocol for electroporation-mediated RNA interference in insects of the order Odonata (dragonflies and damselflies) using the blue-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) and the pied skimmer dragonfly (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Odonata'da Elektroporasyon aracılı RNA Girişim Yöntemi

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, ...

Gelişim Biyolojisi

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous characteristics. Altogether with well-annotated genome sequences, these advantages have made American cockroach, Periplaneta americana, an important hemimetabolous insect model. Limited by the shortage of knockout strategy, effective RNA interference (RNAi)-based gene knockdown becomes an indispensable technique in functional gene research of P. americana. The present protocol describes the RNAi operation techniques in P. americana. The protocol includes (1) selection of the P. americana at proper developmental stages, (2) preparation for the injection setting, (3) dsRNA injection, and (4) gene knockdown efficiency detection. RNAi is a powerful reverse genetic tool in P. americana. The majority of P. americana tissues are sensitive to extracellular dsRNA. Its simplicity allows researchers to quickly obtain dysfunctional phenotypes under one or multiple targeting dsRNA injections, enabling researchers to better use the P. americana for developmental and metamorphic studies.

The present protocol describes step-by-step guidelines for the RNAi operation techniques in P. americana.

Amerikan Hamamböceğinde RNA Girişiminin Uygulamaları

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Biyoloji

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully annotated genome sequence, transposon-based transgenesis, and effective RNA interference (RNAi). Among these advantages, RNAi-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. T. castaneum show a robust systemic RNAi response, making it possible to perform RNAi at any life stage by simply injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the beetle&#8217;s body cavity.
In this report, we provide an overview of our larval RNAi technique in T. castaneum. The protocol includes (i) isolation of the proper stage of T. castaneum larvae for injection, (ii) preparation for the injection setting, and (iii) dsRNA injection. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides us with quick access to loss-of-function phenotypes, including multiple gene knockdown phenotypes as well as a series of hypomorphic phenotypes. Since virtually all T. castaneum tissues are susceptible to extracellular dsRNA, the larval RNAi technique allows researchers to study a wide variety of tissues in diverse contexts, including the genetic basis of organismal responses to the outside environment. In addition, the simplicity of this technique stimulates more student involvement in research, making T. castaneum an ideal genetic system for use in a classroom setting.

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA interference (RNAi)-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. Here, we provide an overview of our larval RNAi technique in Tribolium castaneum. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides quick access to loss-of-function phenotypes, allowing researchers to study gene functions in diverse contexts.

Kırmızı Un Beetle Larva RNA Girişim,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (

Odonata'da Elektroporasyon aracılı RNA Girişim Yöntemi

Amerikan Hamamböceğinde RNA Girişiminin Uygulamaları

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus

Büyük ölçekli Gen demonte olarak

Kırmızı Un Beetle Larva RNA Girişim,

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

içine RNAi Tetik Teslimat