Bu çalışma ARK, Amerikan Kalp Derneği 14GRNT20390154 bir ödül ile, ve kısmen Indiana Üniversitesi-Purdue Üniversitesi, Indianapolis bir Araştırma Destek Fonu Grant (RSFG) tarafından kısmen desteklenmiştir

1. Bakteriyel ifadesi. Not: Bu çalışmada kullanılan ifade plazmidleri Tablo 1 &#39;de tarif edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan çözümler, medya ve tamponlar Tablo 2&#39;de açıklanmıştır. Arke proteazom alt-birim genlerinin klonlanması ve ifadesi plazmid üretimi başka 18,20 açıklanmaktadır. Kısaca, alt birimlerin rekombinant koekspresyonu için plazmidler bireysel alt birimden 18,20 karşılaştırılabilir ifade seviyelerini elde yardımcı olan bir bicistronic operon stratejisini kullanır. Aşağıda listelenen sentezleme parametreler Bu çalışmada, proteazom alt birimleri için en uygun olduğu deneysel olarak tespit edilmiştir. Diğer arke türlerden ya da diğer rekombinant protein kompleksleri (tartışma) için proteazomların gibi diğer proteazom mutantlar için sentezlenmesini optimize etmek üzere gerekli olabilir. <ol><li> (Kimyasal yetkili E.coli BL21 ilgi ifadesidir plazmid DönüşümüDE3) hücreleri. </li><li> Taze buz üzerinde eritildi DE3 hücrelerinin bir kısım göre - (100 ng, tipik olarak 50), ve 20 dakika buz üzerinde inkübe devam plazmid 2 uL - 1 eklenir. </li><li> Isı şoku 45 sn 42 ° C &#39;de hücreleri ve additionl 2 dakika süreyle buza tüp döner. </li><li> LB ortamı, 1 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca (150 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> ((Kanamisin ile takviye katı LB ortamı içeren plakalar bu antibiyotiğe karşı bu çalışma kodlamak direnci kullanılan tüm plazmidler)) LB-kan plakalar üzerine dönüşüm karışımı 200 mcL - 100 yayıldı. 37 ºC O / N plakaları inkübe edin. </li><li> Sonraki sabah, camdan yapılmış bir kültür tüpü içinde sıvı LB-kan ortam 3 ml LB-kan plaka tek bir koloni inoküle. Yaklaşık 2.5 (150 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin - 3 saat veya kadar bulanıklık görülmüştür. </li><li> Spektrofotometrede 600 nm&#39;de (OD600) kültürün optik yoğunluğu ölçmek. Hücre kült seyreltin6 mL bir son hacim içinde, 0.4 OD 600 önceden ısıtılmış LB-kan ortamın uygun bir miktarda ure. 40 dakika boyunca 37 ºC&#39;de sallayarak devam edin. </li><li> 1 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar bir stok çözeltiden IPTG eklenerek sıvı kültürlerde proteinin ifadesini teşvik eder. 7 saat - yaklaşık 6 için (150 rpm) sallayarak ile 37 ºC&#39;de inkübe edin. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine bütün olarak bakteriyel hücre kültürleri hasat. </li><li> mikrosantrifüj tüpü içine bir kültürün 1.5 mL ekleyin. 1 dakika için 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın ve pelet aynı kültürün başka bir 1.5 mL ekleyin. 1 dakika için 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> tüm kültür dek adımı yineleyin 1.11 mikrosantrifüj tüp içine hasat edilir. </li><li> liziz kadar -80 ° C &#39;de neden pelet saklayın. </li></ol> 2. Bakteriyel Lizis ve Lizat Karıştırma. Not: </strong&gt; koekspresyonu üzerinden çalışılan örnekler için, bölüm 2.1 (ve onun alt bölümler) izleyin. Lizat karıştırma gerektiren numuneler için, bölüm 2.2 (ve onun alt bölümler) izleyin. protokolüne dahil TSP (Toplam çözünür, topak) analizi karıştırma lizat (tartışma) boyunca birleştirilir α ve β alt birimlerine bu yaklaşık eşit miktarda sağlamak yardımcı olabilir protein ifadesini optimize yararlıdır. Aynı zamanda aşağı sonuçlar beklendiği değil gibi (yani protein ifade ve çözülebilir olduğunu doğrular) önemli bir kontrol sağlar. Böylece, son derece başlangıçta TSP analizi de dahil olmak üzere tavsiye ederiz. optimal bir protokol özel bir alt-birim kombinasyonu için elde edildikten sonra, TSP analizi katı aşağıda istemli olarak neden olan gerekli değildir. <ol><li> bakteriyel hücrelerin ve çözülebilir fraksiyonları hazırlanması Lizis. <ol><li> 5 dakika buz üzerinde uyarılan hücre pelletini çözülme. liziz tamponu 600 uL pelletini. </li><li> inctoplam ham lizat oluşturmak için 30 dakika boyunca (150 rpm) çalkalama ile 30 ° C &#39;de süspansiyon Ubate. Not: Aşağıdaki adım ve aşağıdaki alt bölüm isteğe bağlıdır. </li><li> Ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler içine toplam ham lizat iki 25 uL&#39;lik çıkarın ve aşağıdaki gibi TSP analizini yürütmek. <ol><li> İki 25 uL alikot biri için, 1X bir son konsantrasyon elde etmek için 5X SDS örnek tamponu ilave edin. &quot;Toplam ham lizat&quot; için &quot;T&quot; ile tüp etiketleyin. </li><li> 5 dk tamamen proteinleri denatüre etmek için 100 ° C&#39;de &quot;T&quot; örnek inkübe edin. </li><li> Bu arada, ikinci 25 uL kısım alın ve 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj o. Dikkatle küçük pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. &quot;Çözünür fraksiyon&quot; bu yeni tüpü &quot;S&quot; etiketleyin. </li><li> minik pelet sol behi içinND, önceki adımda, tekrar süspansiyon liziz tamponu ve vorteks 25 uL ekleyin. &quot;Pelet fraksiyonu&quot; için bu tüp &quot;P&quot; etiketleyin. </li><li> &quot;S&quot; ve &quot;P&quot; tüplerine 6 uL 5X SDS örnek tamponu ilave edin ve yukarıda tarif edildiği gibi 100 ° C &#39;de inkübe edilir. Not: TSP örnekleri ifadesini analiz etmek için o gün kullanılmayacak ise ihtiyaç duyulana kadar, onlar -20 ° C&#39;de donmuş olabilir. % 12 ve / veya% 15 standart SDS-PAGE jeli üzerinde hemen önce yükleme, yukarıda tarif edildiği gibi bir kez çözündürüldü, bunlar, 100 ° C&#39;de yeniden inkübe olması gerekir. </li></ol></li><li> TSP analizi yapılır iken, santrifüj toplam ham lizat kalan 550 uL 10 dakika 10.000 x g&#39;de (veya toplam ham lizat tüm 600 uL TSP analizi yürütülen değilse). yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde supernatant toplamak. Bu saflaştırma için kullanılacak Çözünür lizat olduğu. </li></ol></li><li> Lizat karıştırma. <ol><li> adımlar 2.1.1 ve üzeri 2.1.2&#39;de anlatıldığı gibi lizis yürütmek. </li><li> İstenilen β alt birimini ifade bakterilerden toplam ham lizat 600 uL istenen α alt birimini ifade bakterilerden toplam ham lizat 600 mcL karıştırın. Yavaş, 30 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: (Tartışma) karıştırma lizat sırasında maksimum derleme elde etmek için kuluçka süresini optimize etmek için gerekli olabilir. Zaman ve burada verilen sıcaklık bu çalışmada yeniden birleştirici protein için en uygun olan ve başka bir yerde, 18 tespit edilmiştir. </li><li> Santrifüj 10 dakika için 10,000 x g&#39;de karışık lisatı çözünmeyen topak çözünür malzemeyi ayırmak için. yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın. protein saflaştırma için bu karma Çözünür lizat kullanın. </li></ol></li></ol> İmmobilize Kobalt Affinity Reçine üzeri 3. Protein Saflaştırma(ICAR). <ol><li> reçine dengelenmesi. <ol><li> İyice şişe ters çevirerek reçine tekrar süspansiyon ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bulamacın 50 uL aktarın. Pelet reçine 2 dakika süreyle 700 x g&#39;de santrifüj. Dikkatle süpernatant aspire. Not: Biz sıvının toplu kaldırmak için mavi 1 ml pipet kullanarak pipet aspirasyon yürütmek. Beyaz bir 2 uL ucu boncuklar içeren sıvının çok ince bir tabaka bırakarak geri kalan süpernatan uzaklaştırılması iyi kontrol etmek için kullanılır. </li><li> Yumuşak reçine pelet 2 dakika boyunca 700 x g &#39;de reçine ve santrifüj tekrar süspansiyon 1 ml tampon maddesi A Karışım ekleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire ve bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. </li></ol></li><li> dengelenmiş reçineye bölüm 2.1 veya 2.2 daha önce elde edilen çözünebilir lizat uygulayın. 60 dakika boyunca 4 ° C&#39;de nazik bir dönme ile tüp inkübe edin. G &lt;700 × tüp santrifüj/ 5 dakika boyunca em&gt; ve dikkatli süpernatant aspire. </li><li> spesifik olmayan bağ proteinlerini ortadan kaldırmak için aşağıdaki şekilde reçine yıkayın. <ol><li> Tampon A 1 ml ile yeniden süspanse reçinesi yumuşak, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de sallanarak inkübe edin. 5 dakika boyunca 700 x g&#39;de tüp Santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant aspire. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Süspanse Tampon B 1 mL (5 mM imidazol ile tampon A) reçine ve yumuşak, 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de sallanarak inkübe edin. 5 dakika boyunca 700 x g&#39;de tüp Santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant aspire. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Süspanse Tampon C 1 mL (10 mM imidazol ile tampon A) reçine ve yumuşak, 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de sallanarak inkübe edin. 5 dakika boyunca 700 x g&#39;de tüp Santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant aspire. </li></ol></li><li> t (200 mM imidazol ile tampon A) 400 Tampon E ul ekleyerek proteinini ayrıştırmakreçine o. nazik 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de sallanan ile kuluçkaya yatmaktadır. 5 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> yeni bir 1.5 ml santrifüj tüpüne saflaştırılmış proteini ihtiva eden üst sıvıyı aktarın. </li><li> aşağıdaki gibi seri santrifüj ile saflaştırılmış protein desalt. <ol><li> Saflaştırılmış proteinin 400 uL (bu 160 mM, 200 mM ila imidazol konsantrasyonunu azaltır) 100 uL Tampon A ilave edin. 10 kDa molekül ağırlığı kesmesi olan 0.5 mL ultrasentrifugal filtrelere saflaştırılmış protein uygulanır. 5 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> süzüntü atın ve tekrar bakiyenin ve santrifüj sulandırmak için 400 uL Tampon A ekleyin. imidazol konsantrasyonu aşağıda 4 mM düşene kadar santrifüj / seyreltme döngüleri devam edin. Her bir santrifüj ~ 70 ul (ya da yaklaşık 7 kat) aşağı 500 ul konsantre Örnek olarak, daha sonra, iki döngü Yaklaşık başlayan 160 mM imidazol konsantrasyonu (7 x 7 = 49-kat) azaltacaktıroximately 3.3 mM. </li><li> BCA deneyi 21 kullanılarak tuzu giderildikten numunenin protein konsantrasyonu ölçümü. Not: üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi Tuzdan arındırma, BCA tahlil için tolerans sınırının altında imidazol düzeylerini düşürmek için gereklidir. Bizim laboratuvar hassas olduğundan, BCA deneyi tercih geniş bir dinamik aralığı vardır ve daha az protein için protein varyasyon sergiler. Bununla birlikte, protein konsantrasyonu belirlemek için diğer yöntemler BCA deneyi için ikame edilebilir. Anahtar, her yöntemin avantaj ve sınırlamaları farkında olmaktır. </li></ol></li><li> 1X bir son konsantrasyon elde etmek için 5X yerel numune tamponu ilave edin ve elektroforez geçin. Alternatif olarak, mağaza örnekleri daha sonra analiz için -20 ° C&#39;de. </li></ol> 4. Nondenaturing Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE). Dikkat: unpolymerized akrilamid bir nörotoksin. Uygun koruyucu gea giyinr. <ol><li> şöyle nondenaturing PAGE jel hazırlayın. <ol><li> temiz bir cam plakalar kullanılarak döküm ve standı döküm için jel kasetini hazırlayın. küçük bir manyetik karıştırıcı üzerine gradyan yapıcı yerleştirin ve her bir bölme içine küçük bir karıştırma çubuğu yerleştirin. </li><li> (Ağırlık / hacim) akrilamid ve% 2 (a / h) bisakrilamid stok çözeltileri,% 5 ve% 10 hazırlama% 40 kullanılarak (a / h) bir yerli çözme tamponu içinde akrilamid jeli çözümler. bisakrilamid toplam akrilamid oranı 37.5 olduğundan emin olun: 1. Buz üzerinde soğutma dökülmesinden önce. Not: Burada kullanılan nondenaturing PAGE sistemi Laemmli SDS-Page sistemi esas olarak aynı olan, SDS 22 atlanmış. </li><li> Polimerizasyonun başlatılması için akrilamid çözümleri (su içinde hazırlanmış / hac) stok çözeltisi (w% 10 arasında), amonyum persülfat ekleme. Amonyum persülfat nihai konsantrasyonu% 0.1 (ağırlık / hacim). </li><li> degrade yapımcısı iki odalarına akrilamid çözümleri dökün. çıkış boru takılı between jel kaset plakaları, manyetik karıştırıcı etkinleştirmek ve degrade yapımcısı vanalarını açın. % 10 nondenaturing gradyan jel - 5 dökün. </li><li> Bir kez döküldü izopropanol ince bir tabaka ile kaplamak jel ve jel, 30 dakika süreyle polimerize izin verir. Bu süre boyunca, doğal çözme tamponu taze% 5 akrilamid jel solüsyon hazırlanır. Jel setleri sonra, izopropanol kapalı dökün ve bir bücür şişe deiyonize su ile jel üst durulayın. </li><li> Yukarıda hazırlanan% 5 jel çözeltiye, (tam olarak 4.1.3&#39;de tarif edilmiştir), amonyum persülfat ekleme ve cam levha tam kadar polimerize jel üstünde dökülür. Jel tarağı yerleştirin. Kaplanmış jel ilave bir 30 dakika boyunca polimerize olmaya bırakın. </li><li> Jel polimerize sonra, elektroforez cihazının içine jel kasetini monte edin. Alternatif olarak, kullanıma hazır olana kadar nemli kağıt havlu ve plastik wrap sarılı 4 ° C&#39;de jel depolamak. </li></ol></li><li> Bir kez nondenaturing PAGE jel elec içine monte edilirtrophoresis aparatı, 10X yerli çalışan tampon stok taze hazırlanmış 1X yerli çalışan tamponu ile deposunu doldurun. </li><li> her bir cam şırınga kullanılarak içine bölüm 3 sonunda elde edilen saflaştırılmış protein Yük 10 ug. </li><li> kuyu içine (1X ana çalışma tamponu içinde seyreltilmiş), yüksek molekül ağırlıklı doğal protein standart yüklenebilir 2 uL. </li><li> (- 4.5 saat yaklaşık 4) 55 V ve 4 ºC de jel çalıştırın boya ön jel kapalı bitene kadar. </li><li> Nondenaturing jel ek olarak, standart bir SDS-PAGE 22 ile saflaştırılmış proteinin alikotları analiz eder. <ol><li> 1X bir son konsantrasyon elde etmek için 5X SDS-numune tampon maddesi ile bölüm 3 sonunda elde edilen saflaştırılmış protein örnekleri, alikotları (10 ug) karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca 100 ° C &#39;de kuluçkaya bırakılır ve 12 standart% ve / veya% 15 SDS-PAGE jelleri 22 üzerine yüklenir. </li><li> 20 dakika boyunca 80V çalıştırmak ve boya ön jel (kapalı bitene kadar sonra 120 V bu yaklaşık bir eklenti olduğunuitional% 12 jel 75 dakika ve% 15 jel 120 dakika). </li></ol></li></ol> 5. görselleştirme Aktivite ve Protein Boyama. <ol><li> Elektroforez, dikkatli bir şekilde, ayrı cam plakalar izlenerek ve iyonu giderilmiş su 50 mL içeren bir jel tepsiye nondenaturing jel aktarın. nazik 5 dakika boyunca sallanan ile jel durulayın. su atın ve bu yıkama adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> şu şekilde alt-tabaka Kaplama Testi gerçekleştirmek. <ol><li> florojenik peptit substratı Suc-LLVY-AMC içeren tampon geliştirme 1 ml ilave edilir ve jel üzerinde eşit olarak yayıldı. 30 dakika 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: bir cam çubuk veya jel serbest bırakıcı (ayrı cam levhalar için kullanılan küçük plastik takoz) jel üzerinde sıvıyı dağıtmak için kullanılabilir. </li><li> Dikkatle nedeniyle parçalanmış peptid alt tabakaya jel görüntüleme sistemi, UV transilluminator&#39;de üzerine jel aktarmak ve floresan gözlemleyin. Kayıt görüntüsü. Dikkatle jel ba transferiJel tepsisine ck. </li><li> hafifçe çalkalanarak 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su 50 mL ile iki kez jel durulayın. </li><li> hafifçe çalkalanarak 60 dakika boyunca Coomassie leke reaktifi 10 mL jel leke. arka olana kadar 50 mL su ile destain jeli açık hale gelir. Bu boyama aşaması de bir standart SDS-PAGE jelleri için de geçerlidir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panorama+of+ancient+metazoan+macromolecular+complexes.">Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes.</a> Nature. 525, 339-344 (2015).</li><li>Marsh, J. A., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+dynamics,+assembly,+and+evolution+of+protein+complexes.">Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).</li><li>Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+macromolecular+assembly.">Cooperativity in macromolecular assembly.</a> Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).</li><li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li><li>Groll, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+20S+proteasome+from+yeast+at+2.4+A+resolution.">Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution.</a> Nature. 386, 463-471 (1997).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+subunit+architecture+of+the+proteasome+regulatory+particle.">Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle.</a> Nature. 482, 186-191 (2012).</li><li>Lowe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+20S+proteasome+from+the+archaeon+T.+acidophilum+at+3.4+A+resolution.">Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution.</a> Science. 268, 533-539 (1995).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+proteasome+and+mechanism+of+inhibition+by+a+peptidyl+boronate.">Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate.</a> Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).</li><li>Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+elements+in+proteasome+assembly.">Critical elements in proteasome assembly.</a> Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).</li><li>Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+the+maturation+and+regulation+of+archaebacterial+proteasomes.">Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes.</a> J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).</li><li>Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+denaturation+and+elevated+folding+temperatures+are+required+for+wild-type+activity+and+stability+of+recombinant+Methanococcus+jannaschii+20S+proteasome.">Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome.</a> Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).</li><li>Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+the+20S+proteasome+from+the+methanoarchaeon+Methanosarcina+thermophila.">Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila.</a> J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).</li><li>Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteasome+from+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+thermophila.">A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila.</a> J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).</li><li>Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperonin-mediated+protein+folding:+GroES+binds+to+one+end+of+the+GroEL+cylinder,+which+accommodates+the+protein+substrate+within+its+central+cavity.">Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity.</a> EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).</li><li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+subunit+assembly+into+respiratory+chain+complexes+using+Blue+Native+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).</li><li>Tomko, R. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+the+Rpn12+subunit+couples+completion+of+proteasome+regulatory+particle+lid+assembly+to+lid-base+joining.">Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining.</a> Mol Cell. 44, 907-917 (2011).</li><li>Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-ring+Independent+Assembly+of+the+20S+Proteasome.">Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome.</a> Sci Rep. 5, 13130 (2015).</li><li>Zimmerman, S. B., Trach, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+macromolecule+concentrations+and+excluded+volume+effects+for+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli.">Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+20S+proteasome+assembly+factor+requires+a+C-terminal+HbYX+motif+for+proteasomal+precursor+binding.">A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Chen, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocatalytic+subunit+processing+couples+active+site+formation+in+the+20S+proteasome+to+completion+of+assembly.">Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly.</a> Cell. 86, 961-972 (1996).</li><li>Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint.">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes.">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biz rekombinant arke proteazomlar kullanarak PAGE nondenaturing ile proteazom düzeneğini analiz için kombine yaklaşımın yararını göstermektedir. Proteazom alt birimlerin bakteri koekspresyonu olağan yöntem 9,11 hızlı analiz sağlar ancak anahtar montaj ara maddeleri açığa olmayabilir. Biz montaj olayları daha geniş bir resim geliştirmek için karıştırma lizat ile yakımının birlikte birleştirerek öneririz. Bu kombine yaklaşımın avantajı a ayrı ifades...

Multiprotein kompleksleri çok sayıda kritik hücresel faaliyetler 1 yürütmek. Bu komplekslerin çoğu için, çok daha fazla kendi montajı 2,3 hakkında daha kendi yapısı ve işlevi hakkında bilinmektedir. proteazom böyle bir kompleks ve hayatın tüm alanlarında bulunur. Ökaryotlarda, bu moleküler makine Ubiquitin / Proteozom Sistemi (UPS) merkezinde yer alır ve hücre içi protein yıkımı 4 ana yol sağlar. Bir 20S proteazomu veya çekirdek parçacığına (BF) 5, bir 19S düzenleyici parçacık (RP), 6 ile bir ya da her iki ucunda başlıklı edilebilir: (26S proteazomu olarak anılacaktır) ökariyotik proteazom iki ana alt montajlar oluşmaktadır. 20S proteazomu büyük bölümlere proteazdır. Bu kuaterner yapı kesinlikle yaşamın her alan boyunca muhafaza ve yapısal olarak ilgili alt-birimlerinin iki türü ihtiva eden dört ila yedi üyeli halkalardan oluşan bir istifin oluşur, α; ve 5,7,8 ß. Ökaryotlarda, iki dış halkalar, her yedi farklı α alt birimlerinden oluşan ve iki iç halkalar, her yedi farklı β alt birimlerinden oluşur; proteolitik aktivitesi β alt birimlerine üç içinde bulunur. Buna karşılık, arke ve bakteri CP halkalar genellikle a sadece bir tip ve β alt birimi bir tür oluşmaktadır. Arke proteazomlar nedeniyle kompozisyon sadelik ve onların kendi ökaryotik meslektaşları 9-13 ortak bir montaj mekanizmasını paylaşan hem proteazom düzeneğini incelemek için önemli bir model sistem sağladı. Kısaca, α alt birimi alt-birimleri monte p olan, üzerine bir iskele olarak hizmet eden birinci α halkalar halinde bir araya getirin. Sebebiyet veren Elde edilen yarı proteazomların (α 7 β 7) dimerize tam CP (α 7 β 7 β 7 α 7) monte etmek. dimerizasyonu sırasında propeptidlerinin ß alt birimler üzerinde mevcutotokatalitik katalitik N-terminal treonin açığa çıkarılır. Montaj model arkeal proteazomların kullanımı sıklıkla Escherichia coli içinde rekombinant arke proteazom proteinlerin üretiminde yararlanır. çeşitli kombinasyonlarda üretilecek alt birimi kendi proteazomların üretmeyen bir konakçı organizmada, WT ve mutant versiyonları gibi, sağlar, bu değerli bir yaklaşımdır. Çok protein komplekslerinin birleşmesini İzleme biyokimyasal montaj ara ve öncüleri tamamen monte kompleksleri ayıran bölme yönteminin çeşit gerektirir. Bağlı poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) nondenaturing üstün çözme kapasitesi, çeşitli büyük multiprotein kompleksleri 14-17 fraksiyonlanması, özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır. rekombinant arke proteazom üretimi ve nondenaturing PAGE kombinasyonu disseksiyonu güçlü bir yaklaşım haline gelmiştirg proteozom düzeneği 9,11,12,18. Bununla birlikte, bu yaklaşım, tatbik edildiği (yani. Α ve β alt birimlerine rekombinant ekspresyonuna ile) normal bir yöntem önemli bir dezavantaja sahiptir. Meclis reaksiyonları kooperatif ve güçlü konsantrasyon bağımlı 3 vardır. Hücre içinde protein konsantrasyonu nedeniyle dışlanmış hacim etkileri, 19 çok yüksek olduğu göz önüne alındığında, montaj reaksiyonları in vivo hızla devam edin. Dolayısıyla α ve β alt birimi eksprese olduğunda önemli düzeneği ara maddeleri kaçırmak mümkündür. Burada, rekombinant arke proteazom alt birimlerini kullanarak proteazom montaj çalışmasında bir kombine yaklaşım savunuyorlar. Bu yaklaşımda, hem birlikte ekspresyonu ve lizat karıştırma yöntemleri kullanılmaktadır. Koekspresyon daha az emek yoğun olması nedeniyle eski meclis hızlı analiz sağlar. ikinci karıştırma ardından α ve β alt ünitelerle birlikte, ayrı ayrı ifade bağlıdır. Bu requi olsakoekspresyonu daha res biraz daha çaba, bu koekspresyonu sırasında kaçırılan ara maddelerin tespit etme yeteneğine tarafından telafi daha fazladır. Birlikte, bu iki yöntem proteazom düzeneğinin daha eksiksiz bir resim sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide (40%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 competent cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Colloidal coomassie stain reagent for gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>Gel releasers</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td></tr><tr><td>Glass rod</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Glass syringe for loading gels</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Native calibration kit</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>High molecular weight protein standards</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Gradient maker</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>For induction of protein expression</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmid</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard for SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Quickchange mutagenesis kit</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Fluorogenic substrate</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>For UV imaging of gels</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

Proteazomlar hayatın her alanında bulunur. bunların montajı tam olarak anlaşılamamıştır olmamakla birlikte, Ökaryotlarda hücre içi protein degradasyon ana yol sağlar. Tüm proteazomların iki heptameric α alt birimi halkaları arasında sandviç yapılmış iki heptameric β alt birimi halkalar ihtiva eden bir yapısal korunmuş çekirdek partikülü (CP) ya da 20S proteazomu içerir. Arke 20S proteazomlar kendi ökaryotik muadillerine göre içerik olarak daha basittir, ancak her ikisi de ortak bir montaj mekanizmasını paylaşır. Sonuç olarak, arke 20S proteazomlar ökaryotik proteazom montajı için önemli modeller olmaya devam etmektedir. Özellikle, nondenaturing poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile birleştiğinde arke 20S proteazomların rekombinant ifade proteazom biyogenezi içine birçok önemli bilgiler vermiştir. Burada, arke proteazom a koekspresyonu olağan stratejisi geliştirmek için bir araç tartışmak ve ß alt birimleri önce nondenaturi içinng PAGE. Bu hızlı ve etkili olsa da, tek başına birlikte ekspresyonu yaklaşım, kilit düzeneği ara maddeleri kaçırma olduğunu göstermektedir. proteazom durumunda, birlikte ekspresyonu yarı proteazom saptanmasını bir ara ihtiva eden tam bir α-ring ve bir tam β-halka izin vermeyebilir. Bununla birlikte, bu ara madde hali hazırda lizat karıştırma ile tespit edilebilir. Biz Lizat karıştırma yakımının birlikte birleştirerek takımını analiz daha kapsamlı bir yaklaşım verir, ancak emek nonintensive kaldığını göstermektedir. Bu yaklaşım, diğer rekombinant multiprotein kompleksleri çalışılması için yararlı olabilir.

A alt birimleri formu halkaları 9 birleşerek zaman proteazom düzeneği (Şekil 1) başlar. C-terminal ile hekzahistidin (His-etiketli) türevleri (Tablo 1) etiketlenmiş olarak arke Methanococcus maripaludis S2 a alt birimi, E. coli içinde ifade edilmiştir, bu gösterilebilir. Rekombinant α-His proteini PAGE nondenaturing ile ICAR ile arıtılmış ve analiz edildi, iki bant (Şekil 2A, şerit 1) tespit edilmiştir. Biz daha önce bu t...

Watch this Scientific Journal Video about Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach at JoVE.com

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Bu protokol alt birimi yakımının birlikte ve rekombinant proteazom montaj daha kapsamlı bir muayene için karıştırma postlysis alt birimini hem kullanır.

Rekombinant Archaeal proteazomlar ve Nondenaturing PAGE ile Proteozom Meclisi İncelenmesi: Durum bir Kombine Yaklaşım

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K Görüntüleme.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  Bu protokol alt birimi yakımının birlikte ve rekombinant proteazom montaj daha kapsamlı bir muayene için karıştırma postlysis alt birimini hem kullanır. 

Video: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Biyokimya

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Biyoloji

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is therefore fundamental for the understanding of cellular processes. However, many protein complexes are dynamic assemblies and are not accessible by conventional structural techniques. Mass spectrometry contributes to the structural investigation of these assemblies, and particularly the combination of various mass spectrometric techniques delivers valuable insights into their structural arrangement.
In this article, we describe the application and combination of two complementary mass spectrometric techniques, namely chemical cross-linking coupled with mass spectrometry and native mass spectrometry. Chemical cross-linking involves the covalent linkage of amino acids in close proximity by using chemical reagents. After digestion with proteases, cross-linked di-peptides are identified by mass spectrometry and protein interactions sites are uncovered. Native mass spectrometry on the other hand is the analysis of intact protein assemblies in the gas phase of a mass spectrometer. It reveals protein stoichiometries as well as protein and ligand interactions. Both techniques therefore deliver complementary information on the structure of protein-ligand assemblies and their combination proved powerful in previous studies.

The architecture of protein complexes is essential for their function. Combining various mass spectrometric techniques proved powerful to study their assembly. We provide protocols for chemical cross-linking and native mass spectrometry and show how these complementary techniques help to elucidate the architecture of multi-subunit protein assemblies.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Rekombinant Archaeal proteazomlar ve Nondenaturing PAGE ile Proteozom Meclisi İncelenmesi: Durum bir Kombine Yaklaşım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler