Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

Aşağıdaki protokol New England Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Aşağıdaki protokol 4 yetişkin fare omurilik gelen glial kültürler hazırlamak içindir. Aseptik Koşullarında bir kültür Hood Solutions hazırlanması 1. <ol><li> Kültür ortamı hazırlayın: Eagle ortamı (cDMEM) DMEM içeren tam Dulbecco modifikasyonu,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin (4.5 g / L glukoz ile), 100 mg / ml streptomisin 250 ng / ml amfoterisin B ve 50 uM 2-merkaptoetanol (2-Me, 1.1.1 bakınız). Mix ve diğer tüm bileşenler sterilize filtre ve sonra FBS ekleyin. 4 o C&#39;de kültür ortamı Mağaza <ol><li> 50 mM 2-ME / fosfat tamponlu salin (PBS) bir stok çözelti hazırlayın: 100 mcL konsantre edildi 2-ME 28.6 1x PBS mL ve filtre ile sterilize (çözelti 4 o C&#39;de saklanabilir halinde (14.3 M) Birkaç ay). UKültür ortamı, her 1000 ml için 2-ME, stok çözeltisinin GD 1 mi. </li></ol></li><li> Yoğunluk gradyan ortamının hazırlanması <ol><li> Bir hisse senedi izotonik yoğunluk gradyan medya çözümü hazırlayın (örn% 100 Percoll) 1 kısım 10x normal steril PBS ve 9 parça steril stok yoğunluk gradyan medya (örneğin, Percoll) dan. </li><li> % 20 yoğunluk gradyan ortamı (örneğin, 1 x PBS, 40 mL% 100 yoğunluk gradyan, 10 mL ortam) yapmak için normal 1x steril PBS ile (1.2.1) yapılan% 100 yoğunluk gradyan ortamı seyreltilir ve 4 ° C&#39;de saklayın o C hücre kültürü hazırlamak önce oda sıcaklığında (RT) 20% yoğunluk gradyan ortamı getirin. </li></ol></li><li> Papain ayrışma sisteminden çözeltilerin hazırlanması Not: Papain ayrışma kaplama için Tablo l&#39;de tespit edilebilir. (In-house monte dahil) benzeri diğer ayrışma kitler de kullanılabilir. Tüm components steril olması gerekmektedir. <ol><li> ovomukoid inhibitörü karışımı (toz) için Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) 32 ml. </li><li> bir papain flakon (toz) için EBSS&#39;ye 5 ml ekleyin. 10 dakika süre ile ya da papain çözünene kadar 37 o C su banyosu içinde papain flakon yerleştirin. </li><li> bir DNaz flakon (toz) için EBSS&#39;ye 500 uL ekleyin. hafifçe karıştırın. </li><li> Papain şişeye DNase çözeltisi (yukarıda) 250 ul. </li><li> gerekli Yukarıdaki papain / DNaz karışımı (fare omurilik başına papain / DNaz karışımının yaklaşık 800 uL) &#39;nin toplam miktarını hesaplayın ve Doku sindirimi (adım 3.2) bir 50 ml tüp içine gerekli karışımı aktarın. en az iki hafta boyunca 4 ° C&#39;de orijinal şişeye, artmış saklayın. </li><li> ihtiyaç kadar buz üzerinde kitleri tüm bileşenleri tutun. </li></ol></li><li> spinal kord toplama tüpleri hazırlanması: Bir steril 15 ml tüp 5 ml Hank&#39;in dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS ile, Papain ayrılma sistemi,0; 1X PBS ile omurilik) ve bir steril 15 ml tüp toplanması için (5 ml şırıngaya doldurulmasında) adım 2.4. Buna ek olarak, HBSS 5 ml ile bir steril petri (35 mm veya 60 mm) hazırlamak ve kültürü kaputu içinde tutmak. </li></ol> 2. Omurilik Koleksiyonu Not: Tüm ekipman steril olması gerekmektedir. IACUC tarafından onaylanmış belirlenmiş bir alanda toplanmasını gerçekleştirin. <ol><li> hasat fare omurilik için aşağıdaki araçları edinin: düz keskin / künt 18 cm cerrahi makas, 12 cm standart neşter (# 3 katı), karbon çelik steril neşter bıçakları 10., küçük bir hayvan decapitator, 12 cm standart kavisli forseps ve steril bir 20G iğne 5 ml şırıngaya bağlanmış. </li><li> CO2 ile hayvan Euthanize ve fare baş ve% 70 etanol (EtOH) ile arka bölgeyi dezenfekte. </li><li> decapitator ile hayvan başını kesmek. kas tabakası açığa alt geri bir orta uzunlamasına bir kesi yapmak. YapmakKalça düzeyinde omurgalı sütun üzerinden temiz bir kesik steril düz cerrahi makas (18 cm) (aynı zamanda omurgalı sütunu kapsayan kas tabakası ile kesme). </li><li> tek kullanımlık taze mendil bir kağıda hayvan yerleştirin. Dikkatle rostral tarafına doğru omurganın içerisine (steril 1 x PBS (adım 1.4) ile doldurulmuş, 5 ml şırıngaya bağlanmış) 20 G iğne yerleştirin. aşağı sıkıca hayvan tutun ve hızlı bir şekilde şırınga itin. Bütün omurilik servikal ucundan çıkması gerekir. HBSS içeren 15 ml tüp içine omurilik toplayın. </li><li> Farelerin kalanı için yineleyin 2.4. Her bir hayvan arasında,% 70 EtOH ile kullanılan tüm araçların dezenfekte edin. NOT: Genellikle, bir tek 12-plaka her 4 fare omurilik (4.3 bakınız) kurulabilir. </li></ol> Tek Hücre Süspansiyon 3. hazırlanması Not: Steril her şeyi tutmak için bir kültürü kaputu adım 3 ve 4 gerçekleştirin. <ol><li> HBSS içeren petri (adım 1.4) içine tüm omurilik aktarın. Steril makas ve forsepsle bir çok ince, küçük parçalar halinde omurilik her kesim. bu daha hazırlıklı sulandırmak gibi steril forseps veya 10 ml pipet kullanarak hazırlanan papain / DNaz enzim karışımı (adım 1.3.5) içeren 50-ml konik tüp omurilik doku transferi (enzim karışımı HBSS eklemekten kaçının enzim çözeltisi ve enzimin azalmış performansa neden olabilir). </li><li> karıştırmak için tüp hafifçe karıştırın. Yörünge 150 rpm&#39;de çalkalanarak bir inkübatör / çalkalayıcıda 1 st için 37 o C&#39;de tüp inkübe edin. </li><li> Vorteks tüpü tekrar ve şiddetle ileri ayrışmasını teşvik etmek için bir 5 ml pipet kullanarak doku ile enzim çözeltisi çiğnemek. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de 15 ml tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Santrifüj sırasında yeniden albüminsiz ovomukoid inh 300 ul 2.7 mL EBSS karıştırınsteril tüp içinde ibitor çözeltisi (1.3.1). DNaz solüsyonu (adım 1.3.3) 150 mcL ekleyin. </li><li> Santrifüj sonrasında, süpernatant kaldırmak ve (3.5 adım a) yukarıda hazırlanan çözelti ile hücre pelletini. Vortex iyi hücre pelletini kırmak için. </li><li> Hücre süspansiyonuna yeniden albümin ovomukoid inhibitör çözeltisi (aşama 1.4.1) 3 ml. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 70 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. (Membran parçaları içerir) süpernatantı. </li></ol> Tek Hücre Süspansiyon gelen Miyelin 4. Ek Kaldırma <ol><li> Freni olmaksızın, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 800 xg&#39;de hücreleri topak bozmaya yavaşça Hücre topaklarını içeren tüpe girdap (adım 1.2.2 hazırlanmıştır)% 20 yoğunluk gradyan ortam 8 mL ekleyin ve santrifüjlenir. Dikkatle enkaz (çoğunlukla miyelin) ve süpernatant üst tabakasını kaldırmak, ancak pelet tutmak. </li><li> resuspendi hücreleri yıkayın, yoğunluk gradyanı kalıntıları çıkarmak içinBir seyreltilmiş cDMEM 8 mL (1 kısım cDMEM ve 2 kısım HBSS) hücre pelletini ng. 4 O C &#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj hücreleri Süpernatantı ve aynı şekilde seyreltilmiş cDMEM (yukarıda) ile tekrar yıkama hücreleri. Onları tohumlama kadar buz üzerinde hücreleri tutun. </li><li> Süpernatantı ve kültür ortamında hücre pelletini (cDMEM ile birlikte 2-ME (adım 1.1 hazırlanmış)). Bir 12-yuvalı plaka için, 3 mL x 4 (kullanılan farelerin sayısı) + 2 ml = 14 ml ortamı kullanın. Bu, tüm plaka için yeterli hücre süspansiyonu (12 oyuk) olmasını sağlamak ve oyuk başına ortalama hücre sayısı ve kültür mikroglial içeriğini belirlemek için kullanılabilir ilave kuyu sağlayacaktır. kültür damarlarının diğer türleri kullanılacak ise, orantılı gerekli kültür ortamı toplam hacmini hesaplamak. </li><li> 12 oyuklu plakanın her bir hücre süspansiyonu 1 ml. </li><li> % 5 CO 2 ile 35.9 o C&#39;de inkübe hücreleri. </li><l4 d sonra (1, 4, 8, ve 11, ve sonra 12. günde hücreleri kullanmak genellikle D ortamı değiştirmek) - i&gt; D 1 medya (aspirasyon yoluyla eski medya kaldırmak) değiştirin ve sonra her 3. NOT: 1. günde, kültür nedeniyle omurilik dokusundan kalıntı miyelin enkaz önemli miktarda içerebilir; böylece, 1 gün medyayı değiştirme (Daha fazla bilgi için tartışma bakınız) tavsiye edilir. D 12, oyuk başına 100,000 hücre 12 oyuklu bir plaka içerisinde bulunmaktadır, 14. hücreler genellikle D 12% 80 konfluent ve tipik olarak D 14 ile% 100 konfluent civarındaki olabilir - Kültürler 12 D arasında tedavi için hazır . </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Şekil 2:. Karışık glia kültürünün kurulmasından sonra farklı zamanlarda karışık glial hücreler Örnek Çıkan Birincil spinal kordon karışık Glia yetişkin C57BL / 6 farelerinden elde edildi. temsilcisi görüntülerikaplama sonrası glial kültür ilerlemesini gösterir. 1. günde, bazı hücreler kültür plakasına bağlı, ama çoğunlukla hala yuvarlak edilir. yüzen hücreleri ve önemli enkaz birçok vardır. 4. günde, hücreler çoğunluğu kültür plakasına bağlıdır. Hücreler görebilir süreçlerle dallanmış görünür. Hücreler sporadik dağıtılır ve kültürler şu anda yaklaşık% 20-30 konfluent. 8. günde, kültürler% 50-60 konfluent arasındadır. kültürlerin Bazı alanlar hücrelerinin büyük yamalar var. kültürlerin diğer alanlar hücrelerin seyrek bir büyüme var. yamalar içindeki bazı hücreler &quot;kare&quot; gibi görünüm alır. 12. günde, kültürler (Burada gösterilen görüntü ile ilgili olarak% 90 kaynaşık), ya da% 80 konfluent üzerindedir. Hücre şu anda büyüme log fazında ve 12-14 deneyler için glia hücreleri kullanarak için en uygun zaman gün arasında değişmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. <ol start="7"><li> Anti-fare-CD45 ve anti-fare CD11b monoklonal antikorların kombinasyonu kullanılarak Standart flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) boyama protokolü 11 üzerinden ilave kuyulardan hücreler (4.3 aşama) kullanarak mikroglial içeriği inceleyin. CD45 + CD11b + hücrelerinin mikroglialar olarak tanımlanır. </li></ol>

<ol><li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain%22%5BJournal%5D)">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li>
<li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+and+pain%3A+Is+chronic+pain+a+gliopathy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNi%2C+M+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Maines, M. D., et al. , (2010).</li>
<li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures%3A+microglial-dependent+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li>
<li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+%2F+v-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li>
<li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li>
<li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li>
<li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li>
<li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li>
<li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+Infiltrating+CD4%28%2B%29+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li>
<li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability%2C+tumor+necrosis+factor-alpha%2C+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7(2001).</li>
<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li>
<li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li>
<li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

Tüm adımları dahil deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tutarlı bir şekilde programı değişen ortama gerçekleştirmek için çok önemlidir. Aşağıdaki adımlar mükemmel kalitede yetişkin karışık glia elde özellikle kritiktir. enzimatik sindirim Bu protokolün önemli bir yönüdür. Doku parçaları, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyi sindirilir çok önemlidir. Bununla birlikte, aşırı sindirim önemli ölçüde daha az hücreleri n...

Kronik ağrı kadar 635.000.000.000 $ 1 tahmini yıllık maliyeti, ABD&#39;de yaklaşık 100 milyon yetişkin etkileyen ciddi bir sağlık sorunudur. Montaj kanıtlar nöropatik ağrı, kronik ağrı 2 en yıkıcı tür bir geliştirme omurilik glial hücrelerin önemli bir katkı göstermiştir. Uygun bir in vitro kültür sistemi ayrıca hücresel ve moleküler seviyede gliyal hücrelerinin rolleri araştırmak önemli ölçüde yardımcı olur. Şu anda, araştırmacılar tarafından kullanılan in vitro glial kültür sistemleri yenidoğan fare veya sıçan beyinleri kortikal dokulardan elde edilen ağırlıklı glial hücreler içerir ve ölümsüzleştirdi neonatal fare türetilen glial hücre hatları veya primer glial hücreler sıçan. Yenidoğan hücreleri böylece sağlayan başka (özellikle astrositler ve mikroglia) glial hücrelere ayırt edilebilir farklılaşmamış hücreler önemli miktarda içerenDeneysel kullanım 3 bundant hücreleri. Bununla birlikte, daha önceki bir çalışma neonatal beyin gliyal hücreler, lipopolisakkarit (LPS) ile stimülasyon üzerine yetişkin omurilik, glial hücrelerinden önemli ölçüde farklı yanıt göstermiştir. Örneğin, interlökin (IL) -4 neonatal beyin glia 4 ile karşılaştırıldığında, yetişkin fare omurilik glia (NO) üretimi, LPS ile uyarılmış nitrik oksit önleyici etkilerini arttırdığını sergiledi. Bundan başka, gen-ilişkili peptid (CGRP) kalsitonin bir nöro-peptid ile stimülasyon üzerine kemokin üretiminin profilleri, (5. Referans açıklanan yöntemlere) yenidoğan fare beyin glia arasındaki tartışmasız farklıdır ve yetişkin fare omurilik glia (Şekil 1). Hücre serileri kullanımı ve bakımı kolay olan ve kısa bir süre içinde geniş hücre temin edebilmektedir. Genel olarak, hücre çizgileri oluşturulur ya da 6, 7 ya da aşağıdaki TH (örneğin yaygın olarak kullanılan mikroglial hücre hattı BV2 gibi) bir virüs aracılı ölümsüzleşme sistemi kullanan ölümsüzleştirilmişSpontan dönüşümün e tespiti (örneğin astrosit hücre hattı C8-D1A ve mikroglial hücre hattı C8-B4 gibi) 8, 9 Hücre hatları ayrı ayrı astrositler ve mikroglia moleküler özelliklerini okuyan mükemmel.; Ancak, hücre çizgilerinden elde edilen sonuçlar her zaman birincil hücrelerde veya in vivo koşullara de doğrulama gerektirir. Aynı zamanda, bir kemirgen omurilik glia türetilen bir glial hücre hattının bir rapor olmamıştır unutulmamalıdır. Nöropatik ağrı, yetişkin sıçan karışık glial kültürler 4 üretmek için kullanılan daha önce bildirilen yöntem adapte tarafından geliştirilmiştir yetişkin fare omurilik türetilen bir kültür sisteminin geliştirilmesi, 5 omurilik glial hücre rolünü araştıran yardımcı olmak . fare omurilik glial kültürünü, en son 10 rafine edildi ve bu makalede daha detaylı olarak tarif edilmektedir. Yetişkin omurilik karışık glial kültürleri cBir özel çalışmada ihtiyaçlarına uygun seçilen türlerden bir fare ile kurulacak ve hücreler kültür başlatılmasını yayınlamak d fazla 21 için kültür içinde muhafaza edilebilir. Bu yöntem, hem de bu -associated amiyotrofik lateral skleroz (ALS), insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), duyusal nöropati, ve birden fazla sıra omurilik içinde patolojik değişikliklerin dahil çeşitli nörolojik hastalıkların araştırmalarda, nöropatik ağrı çalışmalarında kullanılabilir skleroz (MS).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modification of Eagle&amp;rsquo;s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 &amp;micro;g/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td></tr><tr><td>Papain dissociation system</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Individual components of this kit can be purchased separately.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td></tr><tr><td>Lab-line incubator/shaker&amp;nbsp;</td><td>Barstead/Lab-line</td><td>MaxQ4000&amp;nbsp;</td><td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides, &lt;em&gt;Salmonella Minnesota&lt;/em&gt; Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 DuoSet ELISA&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY406</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY410</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY466</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse chemokine Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>Accuri C6 flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&amp;nbsp;</td><td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td></tr></tbody></table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

Omurilik glial tepkiler nöropatik ağrı gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunduğunu çok iyi kabul edilmiştir. Hücresel ve moleküler seviyede glial faaliyetlerine ilişkin muazzam bilgiler, in vitro hücre kültür sistemleri ile elde edilmiştir. Kullanılan in vitro sistem, esas olarak neonatal beyin kortikal dokudan türetilen primer glia içerir ve hücre hatları ölümsüzleştirilmiş. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo olarak, spinal kord, glial hücrelerin özelliklerini yansıtmayabilir. Daha iyi in vivo durumunu yansıtan bir kültür sistemi kullanılarak periferik sinir hasarı-kaynaklı nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücre rollerini araştırmak üzere, laboratuar primer omurilik karışık glial kültürleri oluşturulması için bir yöntem geliştirmiştir yetişkin fareler. Kısaca, omurilik, yetişkin farelerden toplandı ve dens olan miyelin uzaklaştırılarak elde edilmiş papain sindirim yoluyla işlenirSığ gradyanlı araç. Tek hücre süspansiyonları, 35.9 O ° C&#39;de 2-merkaptoetanol (2-Me) ile desteklenmiş tam Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (cDMEM) kültürlenmiştir Bu kültür koşulları karışık glial hücrelerin büyümesi için özel olarak optimize edilmiştir. Bu koşullar altında, hücrelerin 12 ile deney için kullanılmak üzere hazır olan - 14 kültürde kurulması (D 0) sonra, (hücre, bu süre içinde log fazında genellikle) ve D 21 kadar kültür koşullarında muhafaza edilebilir. Bu kültür sistemi, çeşitli maddeler ve maddeler ile stimülasyonu ile omurilik glial hücre yanıtları araştırmak için kullanılabilir. Nöropatik ağrı Bunun yanı sıra, bu sistem, spinal kord, glial hücrelerin patolojik değişiklikler içeren diğer hastalıklarda glial yanıt incelemek için kullanılabilir.

Bu yöntem, farelerde ve sıçanlarda karma glial hücrelerini hazırlamak için de kullanılabilir. Hücreler fare omurilik elde zaman kültür D12 sonrası başlatma üzerinde 12 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına ortalama hücre sayısı göz başına yaklaşık 100,000 hücre ile nispeten kararlı olmalıdır. Bu yöntemle elde edilen glial hücreler madde ve ilgi maddelerin uygulanması üzerine, yetişkin omurilik, glial yanıt incelemek için dizayn edilmiştir deneylerde ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue at JoVE.com

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Görüntüleme.  University of New England.  nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor. 

Video: Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Nörobilim

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

<meta charset="utf8"></head><body>Doğum Sonrası Fare Beyinlerinden Primer Mikroglia İzolasyonu

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

Doğum Sonrası Fare Beyinlerinden Primer Mikroglia İzolasyonu

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

Prion kaynaklı iltihabı azaltmak için AdMSC'leri ve glia'yı birlikte kültürlemek

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth factors. These cells show an ability to regulate neuroinflammation in the context of neurodegenerative diseases such as prion disease and other protein misfolding disorders. Prion diseases can be sporadic, acquired, or genetic; they can result from the misfolding and aggregation of the prion protein in the brain. These diseases are invariably fatal, with no available treatments.
One of the earliest signs of disease is the activation of astrocytes and microglia and associated inflammation, which occurs prior to detectable prion aggregation and neuronal loss; thus, the anti-inflammatory and regulatory properties of MSCs can be harvested to treat astrogliosis in prion disease. Recently, we showed that adipose-derived MSCs (AdMSCs) co-cultured with BV2 cells or primary mixed glia reduce prion-induced inflammation through paracrine signaling. This paper describes a reliable treatment using stimulated AdMSCs to decrease prion-induced inflammation.
A heterozygous population of AdMSCs can easily be isolated from murine adipose tissue and expanded in culture. Stimulating these cells with inflammatory cytokines enhances their ability to both migrate toward prion-infected brain homogenate and produce anti-inflammatory modulators in response. Together, these techniques can be used to investigate the therapeutic potential of MSCs on prion infection and can be adapted for other protein misfolding and neuroinflammatory diseases.

Yazar Spotlight: Prion Hastalıkları Araştırmalarındaki Gelişmelere İlişkin Bakış

Adipose-derived mesenchymal stromal cells (AdMSCs) have potent immunomodulatory properties useful for treating diseases associated with inflammation. We demonstrate how to isolate and culture murine AdMSCs and primary mixed glia, stimulate AdMSCs to upregulate anti-inflammatory genes and growth factors, assess migration of AdMSCs, and co-culture AdMSCs with primary mixed prion-infected glia.

Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Yetişkin Fare Omuriliğinden Astrositlerin ve Mikroglia'nın Verimli Ekstraksiyonu

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Yazar Spotlight: Yetişkin Fare Omuriliğinden Glial Hücrelerin İzolasyonu 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Doğum Sonrası Fare Beyinlerinden Primer Mikroglia İzolasyonu

Doğum Sonrası Fare Beyinlerinden Primer Mikroglia İzolasyonu

Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler

Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler

Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu