Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

以下のプロトコルは、ニューイングランド大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。以下のプロトコルは、4成体マウスの脊髄から膠細胞培養を調製するためのものです。 無菌条件下で培養フードでソリューションの調製<ol><li>培地を準備しイーグル培地（CDMEM）DMEMを含有する完全ダルベッコ改変、10％ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、100 IU / mLペニシリン（4.5グラム/ Lのグルコース）を100mg / mLのストレプトマイシン、250 ngの/ mLのアンホテリシンB、および50μMの2-メルカプトエタノール（2-ME; 1.1.1を参照してください）。混合し、他のすべてのコンポーネントを滅菌フィルタした後、FBSを追加します。 4 O℃で培養培地を保存します<ol><li> 50 mMの2-ME /リン酸緩衝生理食塩水（PBS）原液を準備します（ソリューションは、4°Cので保存することができる滅菌28.6 1×PBSのミリリットル、およびフィルタに濃縮された2-ME（14.3 M）の100μLを追加数ヶ月）。 U培地の1,000 mLのためのSE 1 mLの2-MEの原液。 </li></ol></li><li> 密度勾配媒体の調製 <ol><li> 1部の10倍、通常の滅菌PBSおよび9部の滅菌在庫密度勾配媒体（ 例えば、パーコール）から株式等張密度勾配培地溶液（ 例えば、100％パーコール）を準備します。 </li><li> 20％の密度勾配媒体（ 例えば、1×PBSの40mLの100％の密度勾配培地の10 mL）を作るために定期的な1×滅菌PBSで（1.2.1製）100％の密度勾配媒体を希釈し、4℃で保管し℃。細胞培養物を調製する前に室温（RT）で20％の密度勾配媒体をもたらします。 </li></ol></li><li> パパイン解離システムからの溶液の調製 注： パパイン解離システムは、材料表に特定することができます。 （社内で組み立てられたものを含む）、他の類似の解離キットを使用することもできます。すべてのcompone国税庁は無菌でなければなりません。 <ol><li>オボムコイド阻害剤混合物（粉末）にアールの平衡塩溶液（EBSS）の32ミリリットルを追加します。 </li><li> 1パパインバイアル（粉末）にEBSSの5ミリリットルを追加します。 10分間またはパパインが溶解するまで37 O Cの水浴中でパパインバイアルを置きます。 </li><li> 1のDNaseバイアル（粉末）にEBSSの500μLを追加します。穏やかに混合します。 </li><li>パパインバイアルにDNase溶液（上記）の250μLを追加します。 </li><li> （マウス脊髄あたりパパイン/ DNアーゼ混合物の約800μL）に必要以上のパパイン/ DNアーゼ混合物の総量を計算し、組織消化（ステップ3.2）を50 mLのチューブに必要な混合物を移します。少なくとも2週間、4℃で、元のバイアル内の残り物を格納します。 </li><li>必要になるまで氷上でキットからすべてのコンポーネントを置かないでください。 </li></ol></li><li>脊髄コレクションチューブを準備します。1滅菌15 mLチューブを5 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSSのと、パパイン解離システムから、脊髄を収集するための）および1×PBSで1無菌の15 mLチューブ（5 mLシリンジを埋めるために、ステップ2.4を参照のこと）; 0。また、HBSS 5mLで1滅菌ペトリ皿（35ミリメートルまたは60ミリメートル）を作製し、培養フードに保管してください。 </li></ol> 2.脊髄コレクション注：すべての機器は、無菌でなければなりません。 IACUCによって承認された指定された領域でコレクションを実行します。 <ol><li>収穫マウスの脊髄のための以下のツールを入手：ストレートシャープ/ブラント18-cmの手術用はさみを、12-cmの標準メス（＃3固体）、炭素鋼滅菌メスの刃＃10、小動物decapitator、12-cmの標準曲線状鉗子、および滅菌20Gの針は5-mLシリンジに取り付けました。 </li><li> CO 2で動物を安楽死させると、70％エタノール（EtOH）中でマウスの頭部と背部を消毒。 </li><li> decapitatorで動物を刎ねます。筋層を露出するために背中の下部の中央の縦切開を行います。作ります無菌ストレート手術用はさみ（19センチ）とヒップレベルで脊椎動物のカラムを通してクリーン離断（また、脊椎動物の列をカバーする筋肉層を切断します）。 </li><li>ワイプ新鮮な使い捨てのシートの上に動物を置きます。慎重に吻側側に脊柱に（滅菌1×PBS（ステップ1.4）を充填した5 mLシリンジに取り付けられた）20 G針を挿入します。しっかりとダウン動物を持って、すぐに注射器を押してください。全体の脊髄は、子宮頸部の端から出てくる必要があります。 HBSSを含む15 mLのチューブに脊髄を収集します。 </li><li>マウスの残りの手順を繰り返し2.4。各動物の間で、70％EtOHですべて使用される器具を消毒します。 注：一般的に、単一の12ウェルプレートは、すべての4マウス脊髄（4.3を参照）のために確立することができます。 </li></ol>単一細胞懸濁液の調製注：無菌のすべてを維持するために培養フードに手順3と4を実行します。 <ol><li> HBSS含有ペトリ皿（ステップ1.4）に、すべての脊髄を転送します。滅菌はさみやピンセットで多くの素晴らしい、小片に脊髄のそれぞれをカット。これはさらに、調製希釈れるように、滅菌鉗子または10mLのピペットを使用して調製パパイン/ DNアーゼ酵素混合物（ステップ1.3.5）を含む50mLのコニカルチューブに脊髄組織を転送する（酵素混合物にHBSSを追加しません酵素液と酵素のパフォーマンスが低下する場合があります）。 </li><li>混合するために穏やかにチューブをボルテックス。軌道は、150 rpmで振盪しながらインキュベーター/シェーカーで1時間、37°Cのでチューブをインキュベートします。 </li><li>ボルテックスチューブを再び激しくさらに解離を促進するために5mLのピペットを用いて組織を有する酵素液を粉砕します。 </li><li>室温で5分間、300×gで15 mLチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。 </li><li>遠心分離中に、再構成されたアルブミン - オボムコイドINHの300μLで2.7 mLのEBSSを混ぜます滅菌チューブでibitor溶液（1.3.1）。 DNase溶液（ステップ1.3.3）の150μLを追加します。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、上記で調製した溶液（ステップ3.5）で細胞ペレットを再懸濁します。ウェル細胞ペレットを破る渦。 </li><li>細胞懸濁液に再構成されたアルブミン - オボムコイド阻害剤溶液（ステップ1.4.1）の3ミリリットルを追加します。室温で6分間、70×gで遠心分離した細胞。 （膜断片を含んでいる）、上清を取り除きます。 </li></ol>単一細胞懸濁液からのミエリンの4さらなる除去<ol><li> ブレーキなしで RTで30分間、800×gで細胞をペレットを破壊するために優しく、細胞ペレットを含むチューブに渦を（ステップ1.2.2で調製した）20％の密度勾配媒体の8 mLを加え、遠心操作します。慎重に破片のトップ層（主にミエリン）、上清を除去したが、ペレットを保持します。 </li><li>密度勾配の残骸を削除するには、resuspendiによって細胞を洗浄希釈CDMEM（1部CDMEMと2部HBSS）の8 mLで細胞ペレットをngの。 4 O℃で10分間、400×gで細胞を遠心分離上清を除去し、同じように希釈したCDMEM（上記）で再度細胞を洗浄します。それらを播種するまで氷上で細胞を保管してください。 </li><li>上清を除去し、培養培地中の細胞ペレットを再懸濁（CDMEMは、付属の2-ME（ステップ1.1で調製しました））。 1 12ウェルプレートの場合は、3 mLの×4（使用したマウスの数）+ 2ミリリットル= 14 mLのメディアを使用しています。これは、全体のプレートに十分な細胞懸濁液（12ウェル）があることを確認し、ウェルあたりの平均細胞数と培養のミクログリアの内容を決定することができる余分のウェルのために提供されます。培養容器の他のタイプが使用される場合、比例的に必要とされる培地の総体積を計算します。 </li><li> 12ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液1mlを加えます。 </li><li> 5％CO 2で35.9°Cので細胞をインキュベートします。 </li><l4日間、その後、（：1、4、8、11、その後12日目に細胞を使用し、通常、D上のメディアを変更する） - i&gt;はD 1上のメディアを（吸引経由古いメディアを削除）を変更し、その後、3。 注：1日目に、培養物を伴う脊髄組織から残留ミエリンへの破片のかなりの量を含んでいてもよいです。このように、1日目にメディアを変更するには、（より多くの情報のための議論を参照してください）をお勧めします。培養物を12 Dとの間で治療のための準備ができている - 14細胞は、通常、D 12で80％コンフルエントであり、典型的には、D 14で100％コンフルエントに近いことができ、D 12で、12ウェルプレート中のウェルあたり約100,000細胞が存在します。 </li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> 図2：混合グリア文化の確立後の異なる時点での混合グリア細胞の代表的な画像初代脊髄混合グリアは、大人のC57BL / 6マウスから調製しました。代表的な画像めっき後グリア文化の進行状況が表示されます。 1日目に、いくつかの細胞を培養プレートに取り付けられ、彼らはまだほとんどがラウンドされています。多くの浮遊細胞および重要な破片もあります。 4日目に、細胞の大部分は培養プレートに取り付けられています。細胞は、可視プロセスと枝分かれ表示されます。細胞は、散発的に分布しているとの文化は、この時点で約20〜30％コンフルエントです。 8日目に、培養物を50〜60％コンフルエントの間です。文化の一部の地域では、細胞の大規模なパッチを持っています。文化の他の領域は、細胞の疎な成長を持っています。パッチ内のいくつかの細胞は、「正方形状」の外観を取ります。 12日目に、培養物を、80％コンフルエント（ここに示されている画像では約90％コンフルエント）で、または上回っています。セルは、この時点で対数増殖期にあり、12から14日の間は、実験のためにグリア細胞を使用するための最適な時間です。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版。 <ol start="7"><li>抗マウスCD45及び抗マウスのCD11bモノクローナル抗体の組み合わせを使用して、標準的な蛍光活性化セルソーティング（FACS）染色プロトコル11を介して余分なウェルから細胞を（4.3ステップ）を使用して、ミクログリアの内容を調べます。 CD45 +のCD11b +細胞はミクログリアとして同定されます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States.">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li><li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+pain:+Is+chronic+pain+a+gliopathy?.">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?.</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li><li>Ni, M., Aschner, M., Maines, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+icroglia:+isolation,+culturing+and+selected+applications.">Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications.</a> Curr Protoc Toxicol. , (2010).</li><li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures:+microglial-dependent+effects.">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li><li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4.">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li><li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella.">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li><li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability,+tumor+necrosis+factor-alpha,+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia.">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

全ての工程、を含む、実験間の再現性のある結果を得るためにスケジュールで一貫した方法を変更するメディアを行うことが重要です。次の手順では、優れた品質の大人混合グリアを得る上で特に重要です。 酵素消化は、このプロトコルの重要な側面です。組織片は、単一細胞懸濁液を得るために十分に消化されることが重要です。しかし、過剰消化が有意に少ない細?...

慢性疼痛は、最高$ 635 10億の推定年間コストで、米国では、約100万人の成人に影響を与える深刻な健康問題です。証拠は、神経因性疼痛、慢性疼痛2の最も破壊的な種類の一つの開発における脊髄グリア細胞の有意な寄与を示しています。適切なインビトロ培養系は、さらに、細胞および分子レベルでのグリア細胞の役割を調査中で有意に役立つだろう。 現在、研究者によって利用されるインビトログリア培養系は、新生仔マウスまたはラットの脳の皮質組織に由来する主としてグリア細胞を含み、新生仔マウスまたはラット初代グリア細胞由来のグリア細胞株を不死化。新生児の細胞は、このように提供し、さらに（主にアストロサイトとミクログリア）グリア細胞に分化させることができる未分化細胞のかなりの数が含まれています実験的な使用方法3 bundant細胞。しかし、我々の以前の研究では、新生児の脳グリア細胞は、リポポリサッカライド（LPS）刺激により、成人の脊髄グリア細胞から大幅に異なって応答することが示されています。例えば、インターロイキン（IL）は-4新生児の脳のグリア4に比べて成体ラットの脊髄グリアにおけるLPS誘導性一酸化窒素（NO）産生に対する強化された阻害効果を示しました。さらに、遺伝子関連ペプチド（CGRP）カルシトニン神経ペプチドによる刺激時のケモカイン産生のプロファイルは、（5。参考文献に記載される方法）新生児マウスの脳グリア間でunarguably異なって、成体マウス脊髄グリア（ 図1）。確立された細胞株を使用して、保守が容易であり、短時間で多数の細胞を提供することができます。一般的に、細胞株を生成いずれかの6,7または下記目（例えば、広く使用されているミクログリア細胞株BV2ように）ウイルス媒介性不死化システムを使用して不死化自発的な転換の電子識別（例えば、アストロサイト細胞株C8-D1Aとミクログリア細胞株C8-B4など）8、9細胞株を個別にアストロサイトとミクログリアの分子特性を研究する上で優れています。しかし、細胞株から得られた結果は、常にプライマリ細胞またはin vivoの条件にさらなる検証が必要です。また、齧歯類脊髄グリア由来するグリア細胞株の報告がなされていないことに留意すべきです。 神経因性疼痛の発達における脊髄グリア細胞の役割を調査するために、成体マウスの脊髄に由来する培養系は成体ラット混合膠細胞培養物4を生成するために使用される以前に報告された方法を適合させることにより開発された、5マウス脊髄グリア細胞の培養物は、さらに、最近10を精製し、この記事に詳細に記載されています。大人脊髄混合膠細胞培養C特定の研究の必要性に合うよう選択された株からのマウスで確立され、そして細胞は、培養の最大21 Dの開始後、培養物中に維持することができます。この方法は、ならびに - 関連筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感覚神経障害、および複数のような脊髄内の病理学的変化を伴う様々な神経学的疾患の研究において、神経因性疼痛の研究に使用することができます硬化症（MS）。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modification of Eagle&amp;rsquo;s media (DMEM) with 4.5 g/L glucose</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researchers can decide where to purchase the DMEM and all other components used to make cDMEM media.</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researchers can decide where to purchase L-glutamine.</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/mL penicillin G, 10 mg/mL streptomycin sulfate and 25 &amp;micro;g/mL amphotericin B. Individual researchers can decide where to purchase individual components.</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td></tr><tr><td>Papain dissociation system</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Individual components of this kit can be purchased separately.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td></tr><tr><td>Lab-line incubator/shaker&amp;nbsp;</td><td>Barstead/Lab-line</td><td>MaxQ4000&amp;nbsp;</td><td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides, &lt;em&gt;Salmonella Minnesota&lt;/em&gt; Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses though, may vary.</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 DuoSet ELISA&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY406</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY410</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY466</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td></tr><tr><td>Mouse chemokine Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>This product was not available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td></tr><tr><td>Accuri C6 flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&amp;nbsp;</td><td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td></tr></tbody></table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

脊髄グリア応答が神経因性疼痛の発展に大きく寄与することが広く受け入れられてきました。細胞および分子レベルでのグリア活性に関する膨大な情報は、インビトロ細胞培養系を介して得られています。利用インビトロ系は、主に新生児の脳皮質組織に由来する初代グリアを含む、細胞株を不死化。しかしながら、これらのシステムは、 インビボで脊髄グリア細胞の特性を反映しないかもしれません。さらに優れたin vivoでの条件を反映した培養系を用いて、末梢神経損傷誘発性神経障害性疼痛の発達における脊髄グリア細胞の役割を調べるために、我々の研究室から、一次脊髄混合膠細胞培養を確立するための方法を開発しました成体マウス。簡単に言えば、脊髄を成体マウスから収集し、洞穴とミエリン除去しパパイン消化を介して処理されています性勾配の媒体。単一細胞懸濁液は、35.9℃でO 2-メルカプトエタノール（2-ME）を補充した完全ダルベッコ改変イーグル培地（CDMEM）で培養しますこれらの培養条件は、混合グリア細胞の増殖のために特別に最適化しました。これらの条件下では、細胞は12間の実験のために使用される準備ができている - 14日間の培養の確立（D 0）の後に（細胞は、この時間中対数期に通常ある）、およびD 21までの培養条件で維持することができます。この培養系は、様々な物質および薬剤による刺激の際に脊髄グリア細胞の応答を研究するために使用することができます。神経因性疼痛に加えて、このシステムは、脊髄グリア細胞の病理学的変化を伴う他の疾患におけるグリア細胞の応答を研究するために使用することができます。

この方法は、マウスおよびラットの両方からの混合グリア細胞を調製するために使用することができます。細胞は、マウス脊髄由来しているときに文化のD 12ポスト開始するときに、12ウェルプレート中のウェルあたりの平均総細胞数はウェルあたり約10万セルで、比較的安定であるべきです。この方法から得られたグリア細胞は、目的の物質および薬剤の投与の際に?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue at JoVE.com

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

神経因性疼痛の発症は、脊髄グリア細胞の病理学的変化を伴います。成人脊髄組織に由来し、 インビトロでこれらの細胞を研究するために設計された信頼性のあるグリア培養システムが欠如しています。したがって、我々は、成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養を確立する方法をここに示します。

成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養の調製

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K ビュー.  University of New England. 神経因性疼痛の発症は、脊髄グリア細胞の病理学的変化を伴います。成人脊髄組織に由来し、 インビトロでこれらの細胞を研究するために設計された信頼性のあるグリア培養システムが欠如しています。したがって、我々は、成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養を確立する方法をここに示します。 

ビデオ: Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

免疫・感染学

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

神経科学

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

<meta charset="utf8"></head><body>出生後マウス脳からの一次ミクログリア単離

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

出生後マウス脳からの一次ミクログリア単離

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

プリオン誘発性炎症を軽減するためのAdMSCとグリアの共培養

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth factors. These cells show an ability to regulate neuroinflammation in the context of neurodegenerative diseases such as prion disease and other protein misfolding disorders. Prion diseases can be sporadic, acquired, or genetic; they can result from the misfolding and aggregation of the prion protein in the brain. These diseases are invariably fatal, with no available treatments.
One of the earliest signs of disease is the activation of astrocytes and microglia and associated inflammation, which occurs prior to detectable prion aggregation and neuronal loss; thus, the anti-inflammatory and regulatory properties of MSCs can be harvested to treat astrogliosis in prion disease. Recently, we showed that adipose-derived MSCs (AdMSCs) co-cultured with BV2 cells or primary mixed glia reduce prion-induced inflammation through paracrine signaling. This paper describes a reliable treatment using stimulated AdMSCs to decrease prion-induced inflammation.
A heterozygous population of AdMSCs can easily be isolated from murine adipose tissue and expanded in culture. Stimulating these cells with inflammatory cytokines enhances their ability to both migrate toward prion-infected brain homogenate and produce anti-inflammatory modulators in response. Together, these techniques can be used to investigate the therapeutic potential of MSCs on prion infection and can be adapted for other protein misfolding and neuroinflammatory diseases.

著者スポットライト:プリオン病研究の進歩への洞察

Adipose-derived mesenchymal stromal cells (AdMSCs) have potent immunomodulatory properties useful for treating diseases associated with inflammation. We demonstrate how to isolate and culture murine AdMSCs and primary mixed glia, stimulate AdMSCs to upregulate anti-inflammatory genes and growth factors, assess migration of AdMSCs, and co-culture AdMSCs with primary mixed prion-infected glia.

脂肪由来間葉系間質細胞を初代混合グリアと共培養したプリオン誘発性炎症の軽減

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

成体マウス脊髄からのアストロサイトおよびミクログリアの効率的な抽出

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

著者スポットライト:成体マウス脊髄からのグリア細胞の単離 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養の調製

要約

さらに動画を探す

この動画の章

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

出生後マウス脳からの一次ミクログリア単離

出生後マウス脳からの一次ミクログリア単離

脂肪由来間葉系間質細胞を初代混合グリアと共培養したプリオン誘発性炎症の軽減

脂肪由来間葉系間質細胞を初代混合グリアと共培養したプリオン誘発性炎症の軽減

脂肪由来間葉系間質細胞を初代混合グリアと共培養したプリオン誘発性炎症の軽減

成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)