We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Hôpital Maisonneuve-Rosemont - tüm hayvan çalışmaları için protokoller Centre de Recherche de Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Timus Dilimleri Hazırlanması ve Tek hücre süspansiyonları 1. Hasat Fare Thymus <ol><li> Servikal dislokasyon CO2 ile fare öldürülür. </li><li> Laminer akış kaputu, bir diseksiyon kurulu fare ventral tarafı pin up. % 70 etanol ile fare püskürtün. göğüs boşluğu giren ve doku zarar etanol önlemek için gazlı bez ile dabbing herhangi bir aşırı alkol çıkarın. </li><li> Forseps bir çift ile sternum üssünde cildi kaldırın ve deri yoluyla bir kesim yapmak. Her ön ayakları yukarı derinin kesim uzatın. </li><li> göğüs kafesinden diyaframı ayırmak için sternum alt kısmında ek bir kesim olun. Sonra klavikula doğru göğüs kafesinin her tarafını kesti. göğüs boşluğu açığa kafasına doğru göğüs kafesini ters çevirin. iki lobutimüs kalbin üstüne yalan. </li><li> forseps, mikro-diseksiyon makas kullanarak timik lobları etrafında bağ dokusunu çıkarın ve / veya keskin kavisli makas. alttan veya bağ dokusu kalan aracılığıyla bireysel lobları kaldırmak için ince uçlu eğri forseps bir çift kullanın. Not: doğrudan timus tutmayın. </li><li> PBS içeren 15 ml konik tüp içinde timik lobları yerleştirin ve gerektiği kadar buz üzerinde bir kenara koyun. </li></ol> 2. Agaroz gömülmesi ve Timus Lobların Vibratome Dilimleme <ol><li> Steril PBS, 50 ml 2 g, düşük erime noktalı agaroz eritilmesi ve agaroz tamamen eriyene kadar düşük bir ayar mikrodalga tarafından yerleştirmek için,% 4 agaroz çözeltisi hazırlayın. Kullanım için hazır olana kadar, 55 ° C&#39;de bir su banyosu içinde, alüminyum folyo ve yer ile balon örtün. </li><li> Bir doku kültürü kaputu tam% 10 fetal bovin serumu içeren RPMI-1640 ortamı (FBS), 4 mM L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin ve 10 uM hazırlanması2-merkaptoetanol. </li><li> 6 oyuklu hücre kültürü plakasına oyuk başına 1.5 mi tam RPMI-1640 ortamı ekleyin ve iyice her bir hücre kültürü ekleme yerleştirin. kadar gerekli 37 ° C&#39;de bir kuluçka kenara plaka ayarlayın. </li><li> bir buz kovası, su ve buz ile bir sulu buzlu su banyosu hazırlayın. </li><li> Dikkatle ince uçlu forseps kullanarak her timik lobu çevreleyen kalan tüm bağ dokusu kaldırmak. Bir doku üzerine transferi PBS ile ıslatılmış veya bir mikroskop altında mendilin sonra timik lob, bir doku kültürü çanak PBS batmış ise bunu yapın. </li><li> Agaroz doku aşırı ısınmasını önlemek için, şişeyi dokunma sadece sıcak 40 ° C&#39;nin altında soğumasını bekleyin. Yaklaşık 1 cm yüksekliğe kadar doku kalıba agaroz soğutuldu% 4 dökün. </li><li> dikkatli bir doku silin ve doku zarar vermeden kurutmak için yavaşça rulo timik lob aktarmak için forseps bir çift kullanın. doku tamamen kurur emin olun veya dilimleme sırasında agaroz dışarı kayar. </li><li> Dikkatle agaroz lob yerleştirin ve yatay olarak bir kalıbın tabanındaki (dilim sayısını artırmak için) dikey olarak (her dilimin yüzey alanını arttırmak için) ya da her iki konumlandırmak. Agaroz katılaşmaya izin vermek için 5-10 dakika boyunca, buzlu su kalıp yerleştirin. </li><li> Bu süre boyunca, tampon kasası montaj numune diski monte ve vibratome bıçak sokulmasıyla dilimleme vibratome hazırlar. numune disk üzerinde laboratuvar bant bir parça yerleştirin. % 70 etanol ile temiz, monte çalışma alanını sterilize edin. </li><li> Agaroz katılaşır sonra, yavaşça agaroz gömülü lob serbest bırakmak için kendi merkezinde kalıp ve basın ters. </li><li> altta ~ 0.5 cm lob her tarafı ve agaroz ~ 2 mm bırakarak çevreleyen aşırı agaroz kesmek için keskin bir bıçak kullanın. </li><li> numune disk üzerinde bant parçasına doku yapıştırıcı bir damla ile her agaroz blok sabitleyin. Birden fazla blok bant yapıştırılmış olabilir. </li><li> Vibratome bıçak wi hizalayınAgaroz blok üst th. Bıçak ve agaroz blok (ler) tamamen dalmış kadar steril PBS ile tampon tepsisini doldurun. </li><li> Bölüm agaroz gömülü doku 400-500 um bir kalınlığı olan dilimler elde edilmiştir. 0.225 mm / sn hızında, 100 Hz frekansında ve 5 ° açıya Vibratome ayarlayın. </li><li> bunlar kesilir steril PBS içeren bir doku kültür plakasına timik dilim toplamak için bükülmüş bir spatula kullanın. İlk ve son dilim atın. </li><li> 4X büyütme bir ışık mikroskobu altında dilimleri inceleyin. Bozulmamış timus dokusu ve çevresindeki agaroz (Şekil 1A) ile dilimleri seçin. </li><li> yavaşça hücre kültürü eki üzerine eğilmiş spatula gelen timik dilim kaydırmak için pipet kullanarak adım 2.3 hazırlanan plaka dilimleri aktarın. Her insert ~ 3 dilim konaklayabilir. dilimler birbirlerine ya da hücre kültürü eklemek duvarlara dokunmayın emin olun. </li><li> gerekli olana kadar, 37 ° C &#39;de plaka muhafaza edin. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Kaplama için timositlerin hazırlanması <ol><li> Bölüm 1&#39;de tarif edildiği gibi% 2 FBS içeren steril PBS, 5 ml ile dolu bir steril 15 ml doku öğütücüsü kullanılarak tek bir hücre süspansiyonu yapmak için el loblar ayrıştırmaları timik loblar izole edin. 15 ml konik tüp hücreleri aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 545 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Süpernatant atılır ve kırmızı kan hücreleri lize etmek için 3 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x ACK lisiz tamponu (0.15 M NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM Na2EDTA) içinde 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> PBS,% 2 FBS içeren 15 ml tüp doldurun. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 545 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> % 2 FBS içeren 10 ml PBS hücrelerin tekrar ve 255 um ağ filtre içerisinden hücreleri geçer. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 545 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve concentr% 2 FBS içeren PBS içinde hücre pelletiniml başına 1 x 10 7 hücre yapımı. </li><li> Hücresel böyle carboxyfluorescein süksinimidil ester gibi boyalar (KAKE) dilim endojen hücrelerden ayırt etmek congenic işaretleri veya genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere ifade farelerden alınan timositleri kullanarak değilse üretici protokollerine göre hücreleri etiketleyin. </li><li> Etiketli hücrelerin nihai yıkamadan sonra, 15 ul başına 1-3 x 10 6 hücre tam RPMI-1640 ortamı içinde hücre pelletini. </li></ol> 4. Timus Dilimleri üzerine timositlerdeki Kaplama <ol><li> uç üzerindeki timik dilimleri çevreleyen herhangi bir sıvı aspire bir pipet kullanın. Not: agaroz zarar vermemek için özen gösterin. agaroz bozuksa, Kaplanmış timositleri nedeniyle yüzey gerilimi kaybı dilim yüzeyine takmak olmaz. </li><li> pipet, bindirme her timik dilim üzerine 3. bölümünde hazırlanan timositlerin 15 ul dilim dokunmadan. </li><li> pla inkübe2 saat boyunca 37 ° C &#39;de te hücreleri timik dilimler halinde göç izin vermek. </li><li> 2 saat sonra, henüz dokuya göç değil aşırı Kaplanmış timositleri çıkarmak için 1 ml PBS ile timik dilimleri 3 kez yıkayın. </li><li> timik dilim hasat edilmeye hazır olana kadar deneye bağlı olarak genellikle 1-72 saat 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li></ol> Akım Sitometrisi için Timik Dilimleri 5. Ayrışma <ol><li> % 2 FBS içeren PBS 150 ul ilave edilerek, her bir dilim için bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. </li><li> timik dilimleri ile doku kültür eki% 2 FBS içeren PBS ile 1 ml ilave edilir ve yavaşça, hücre kültürü ucun yüzeyinden dilim ayırmak için bükülmüş bir spatula ile karıştırılmıştır. </li><li> bükülmüş spatula ile mikrosantrifüj tüp Ovülden dilim aktarın. </li><li> El ile bir mikrosantrifüj tüp numune havaneli kullanarak dilim bozabilir. bir son hacim 300-2% FBS içeren PBS 150 ul ekleul. </li><li> Bir yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine 40 um&#39;lik bir filtreden ayrışan doku filtre. Süzülmüş hücreler akım sitometri analizi 40 lekeli hazırdır. </li><li> sitometresinde tüm agaroz kaldırılır ve akış sitometresinin yapışmasına neden olmadığından emin olmak için bir akış iletmeden önce hücreleri ikinci kez Filtre. </li><li> Bir akış sitometresinde hücreleri elde edilmesi ve daha önce 40 tarif edildiği gibi verileri analiz. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada timik dilimleri ve akış sitometrisi ile Kaplanmış ön seçim MHC sınıf I kısıtlamalı TCR transjenik timositlerin etkin pozitif ve negatif seçim için temsili sonuçlar hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu sistem, agonist antijen, negatif seçim ve timus regülatör T geliştirme 11,12 mevcudiyetinde, ön seçim DP timositleri 32 MHC sınıf II kısıtlı CD4 + T hücrelerinin pozitif seçim destek benzer başarı ile kullanılabilir, ve e...

T hücreleri bir işlevsel, serbest-dayanıklı T hücresi repertuarının 1-3 üretimi sağlamak birçok kontrol noktaları karşılaşma, bu süre içinde timus gelişim ara bir dizi farklılık gösterir. Pozitif seçim kortikal timik epitelial hücreler (CTEC) -2,3 üzerindeki majör histokompatibilite kompleks molekülleri (MHC) tarafından sunulan, orta dereceli afınitede, peptide düşük, tanıyan T hücre reseptörleri (TCR) ile timositler hayatta kalmasını teşvik eder. Negatif seçim ve düzenleyici T (T reg) hücre gelişimi MHC 2,4 tarafından sunulan öz-peptid kuvvetle cevap timositlerin ortadan kaldırılması ya da saptırma yoluyla kendini tolerans kurulmasına katkıda bulunur. Olgunlaşmamış CD4 + CD8 + çift pozitif (DP) olgun T hücre alt içine seçim süreci geçmesi ayırt TCRler ifade timositleri, hangi MHC sınıf I kısıtlı CD8 + sitotoksik çoğunluğuveya MHC sınıf ikincil lenfoid organlara 1-3 efektör işlevleri gerçekleştirmek için timus çıkmadan önce, CD4 + yardımcı tek pozitif (SP) T hücrelerini II kısıtlı. T hücre gelişiminin karmaşıklığı ekleme dinamik göç ve stromal hücre ağının 5-9 boyunca timositleri gelişen hücresel karşılaşır olduğunu. Bu stromal hücreler timosit gelişiminde belirgin rol oynayan ve farklı şekilde pozitif ve negatif seleksiyon 10 meydana timik kortikal ve medüller bölgeler arasında dağıtılır. Pozitif seçim öncelikle korteks yer alsa da, DP timositleri medulla göç ve medulla pozitif seçimi ve soy tamamlanması için gerekli ek sinyaller olabileceğini düşündürmektedir olgun T hücreleri içine ayırt önce TCR sinyallerini gerektirecek devam ettiğini biriken kanıtlar vardır farklılaşma 11,12. Bundan başka,reaktif timositleri 13,14 silinmesini kolaylaştırmak ifade uzman medüller timik epitelial hücreler (MTec) ve mevcut dokuya sınırlı antijenlerin varlığına rağmen, negatif seçim büyük bir kısmı her yerde bulunan bir kendinden peptit dendritik tarafından sunulan ifade yanıt olarak kortekste meydana hücreler 15,16. Böylece, T hücre gelişiminin doğru modelleri timositlerde ve stromal hücreleri arasındaki etkileşimi kolaylaştırır ve bu hücreler pozitif ve negatif seçim tabi olarak timosit göç destekler sağlam kortikal ve medüller bölgeler ile, son derece organize timik mikro sağlamalıdır. Ex vivo olarak tamamlamak için, yerinde, pozitif ve negatif seçim in vitro bir dizi okuyan bir araç olarak timositlerin analiz eder ve T hücresi gelişiminin in vivo modellerde 17-22 geliştirilmiştir. Recapitulate etmek oldukça zor olmuşturPozitif in vitro seleksiyon, ama Notch ligandı ifade eden kök hücre popülasyonlarının veya stromal hücreler ile T hücre öncülerinin kokültürünün, özellikle OP9-DL1 / 4 hücreleri, in vitro modelde o paha biçilmez bir hale T soy bağlılığı ve sınırlı olumlu seçimi desteklemek için yeteneğine sahiptir çalışma T hücre gelişimi 23-25. Bu sistemin Sınırlamalar Bununla birlikte, bu hücreler timik stromal hücrelerinde bulunan benzersiz peptid işleme makine ve üç boyutlu timik mikro yoksun olduğu gerçeğini içerir. Daha teknik hantal, in vitro sistemler ile ilgili bazı engelleri aşmak yerinde ve timus seçim vivo modellerde rağmen. Reaggregate timik organ kültürleri (RTOC) timositlerde ve timik stromal hücrelerin 18,26,27 karışımlarını tarif içerir. Bu timik epitel hücre Reaggregates MHC sınıf I ve II ifadesini korumak ve developme destekleyebilirnt konvansiyonel T hücre alt, ama yine de kortikal ve medüller yapıları tanımlanmıştır yoksundur. Fetal timik organ kültürü (FTOC) lymphoreplete timik loplara lymphodepleted timik lob veya timositlerin enjeksiyon yoluyla asılı bırakma kültürü ile timositler ile tohumlandı ve CD4 + ve CD8 + T etkin gelişimini desteklemek edilebilir T hücresi gelişiminin popüler bir modeldir kültür 18,28-31 zaman içinde hücre. Fetal timik lobların kültürünün başlangıcında mTECs bir yetersizlik var, ama tanımlanan kortikal ve medüller yapılar koşullara bağlı zamanla gelişebilir. Önemli bir husus, bu model, tercihan yetişkin T hücre gelişimi karşısında fetal destek olmasıdır. Son olarak, erişkin farelerde tanımlanan timik öncülerinin intrathymic enjeksiyonu teknik olarak zordur ama açıkça destekleyen bir ortam sağlar In vivo T hücresi gelişme. In situ ve in vivo modellerde Bu mükemmel araçlar t&#39;nino çalışma T hücre gelişimi ve kullanımı bir deneme-by-deney temelinde ele alınmalıdır. Timik dilimleri, ancak, son zamanlarda benzersiz, karmaşık ve genellikle daha yüksek verim denemeleri karşılamak için imkanı ile yerinde timik seçimi incelemek için çok yönlü, tamamlayıcı model olarak ortaya çıkmıştır. Timik dilim kortikal ve medüller bölgeler bütünlüğünü korumak ve geliştirme yanı sıra verimli pozitif ve negatif seleksiyon 11,32-39 sırasında timosit göç destekler stromal hücrelerin bir çerçeve sunmaktadır. Timik dilimleri üstünde eklenen timosit alt kümeleri dokuya ve bunların uygun microenvironmental niş 34,37 göç. üst üste timositleri konjenik işaretleri veya floresan etiketler ile timik dilim endojen hücrelerden ayırt edilebilir ve birkaç gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir. Timik dilim Organotipik kültürler çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilirdiğerleri arasında timus seçimi, timosit davranışı (göç ve hücresel etkileşimleri) ve timosit lokalizasyonu da dahil olmak üzere T hücresi gelişiminin. Fare başına ~ 20 timus dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, deney ölçeklenebilirlik timus seçimi yerinde modellerinde diğerinden daha genel olarak daha fazladır. timik dilim hazırlanması uzman gibi vibratome gibi ekipmanları, ve hücre ölümü aracılığıyla zamanla hücre kaybı ve bir kapsül zarının olmaması nedeniyle sınırlıdır kültürde timik dilim yaşam süresi gerektirmesine rağmen, timik dilimleri mükemmel bir model sağlamak olgun timik mikroçevresinin içinde timositlerin senkronize popülasyonlarının timus seçimi analizi için. Burada akım sitometri analizi için timik dilim, izolasyon ve timositlerin bindirilirken, ve ayrışma (timus, timus lobları agaroz gömme ve gömülü doku vibratome bölümlendirilmeleri hasat dahil) timik dilimleri hazırlanmasını tarif etmektedir.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50080</td><td>Low melting temperature agarose</td></tr><tr><td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td><td>Polyciences</td><td>18986</td><td>22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>Double Edge Prep Blades</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Adhesive</td><td>3M&amp;nbsp;</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;micro;m Cell Culture Inserts&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 with L-glutamine</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Wisent</td><td>080-110</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>L-Glutamine, 200 mM</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Filter</td><td>Component Supply</td><td>U-CMN-255</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td><td>Bel-Art</td><td>F19922-0000</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Nylon Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Inox Tip</td><td>Dumont&amp;nbsp;</td><td>RS-5047</td><td>Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm</td></tr><tr><td>Micro Forceps</td><td>Dumont&amp;nbsp;</td><td>RS-5090&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

Fonksiyonel, kendini hoşgörülü T hücre repertuarının nesil sonuçlanan eşsiz ve son derece organize timik mikroçevresinin timik seçim ilerler. T soy bağlılığı ve gelişimini incelemek için in vitro modeller bu süreçte değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu sistemler, T hücresi gelişimi için gerekli olan tam üç boyutlu timik ortam eksikliği ve bu nedenle, in vivo olarak timus seçim eksik yaklaşık değerlerdir. Modelleme T hücre gelişimi ile ilgili sorunlardan bazıları tamamen T hücrelerini gelişmekte olan timus seçimi destekleyen sağlam bir timik mikro sağlamak yerinde modellerinde kullanılarak aşılabilir. Timik dilim Organotipik kültürler in situ teknikleri mevcut tamamlayacak. Timik dilim timik kortikal ve medüller bölgelerin bütünlüğünü korumak ve tanımlanmış bir gelişim aşamasında veya endojen T c Kaplanmış timositlerin gelişimini incelemek için bir platform sağlamakolgun timik mikroçevresinin içinde arşın. fare başına ~ 20 dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, timik dilim yüksek verimlilik deneyler için ölçeklenebilirlik açısından benzersiz bir avantaj sunuyoruz. Dahası, farklı genetik geçmişleri farklı timik alt kümelerini ya da diğer hücre popülasyonları bindirmek için timik dilimleri ve potansiyelini üreten göreli kolaylığı bu yöntemin çok yönlülüğünü artırır. Burada timik dilimleri, izolasyon ve timositlerin kaplaması ve akış sitometrik analiz için timik dilimlerin ayrışma hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu sistem aynı zamanda timosit taşıma, timosit-stromal hücre etkileşimleri ve iki foton mikroskobu ile timik seçimi ile bağlantılı TCR sinyallerinin geleneksel olmayan T hücresi gelişimini incelemek ve görselleştirmek için adapte edilebilir.

Böyle pozitif ve negatif seçim olarak T hücre gelişiminin farklı yönlerini timus dilim destek analizi. Başarılı deneyler için, timus dilim kalitesi çok önemlidir. Böylece, timik dilim timus dokusunun bütünlüğünü sağlamak için muayene edilmelidir ve timus dilim çevreleyen agaroz bozulmamış (Şekil 1A) olduğunu. Agaroz doku içine göç timositlerin sayısında önemli bir azalmaya neden zarar gördüğünde Yüzey gerilimi tehli...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir.

Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

preparation-and-applications-of-organotypic-thymic-slice-cultures

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Görüntüleme.  Hôpital Maisonneuve-Rosemont.  Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir. 

Video: Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Gelişim Biyolojisi

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Nörobilim

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Kanser Araştırmaları

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Biyoloji

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. Tissue&#160;slices immediately cut from freshly resected tumors preserve spatial aspects of intratumor heterogeneity (ITH), thus making them useful surrogates of in vivo biology. Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments. This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly floating slices and stagnant filter supports. Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself. In summary, this protocol describes the generation of murine lung tumor slices and their culture on a rotating incubation unit and demonstrates how slices should be systematically analyzed for the expression of heterogeneous tissue markers, as a prerequisite prior to drug response studies.

We provide a method for the generation, cultivation and systematic analysis of organotypic slices derived from murine lung tumors. We also describe how to optimize for slice thickness, and how to select drug concentrations to treat tumor slices.

Kuruluş ve tümör dilim analizini Explants tanı testleri için bir önkoşul olarak

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...