Name: a high-content in vitro pancreatic islet β-cell replication discovery platform
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet Î²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Bu protokol, Stanford Üniversitesi Tıp Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. adacık hücre replikasyonu değerlendirilmesi için 384 oyuklu plakanın 228 kuyu üretilmesi için yeterli olan - (9 haftalık 8) erkek Sprague Dawley sıçanlarında, 300 g - açıklanan protokol altı 250 doku adacığı izolasyonu ölçeklenir. 1. Malzeme Hazırlama <ol><li> 15 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı 28 3 gün birleştiği noktada muhafaza 804G fare mesane kanseri hücre koşullu ortam (RPMI-1640 20 mi) toplayarak doku adacığı izolasyonu başlatmadan önce kaplama ortamı hazırlar. Steril filtre ve mağaza (-20 ° C), daha sonra kullanılmak üzere koşullu ortam. </li><li> cerrahi aletleri sterilize (bir 12 cm dişli doku forseps, bir 11.5 cm ince makas, bir 14.5 cm cerrahi makas, iki 16 cm kavisli forseps, bir 12 cm kavisli hemostat, bir 12 cm neşter sapı) ve init önce bir 30 gözlü doku elekadacık izolasyon iating. </li><li> Bir% 60 eritilerek pankreatik sindirim çözeltisi hazırlayın: Saflaştırılmış sınıf I% 40 karışımı: sınıf II kollajenazlar (300.000 toplam kolajenaz aktivitesi - 400.000 birim), kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş 1 x Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS), 60 ml. Yük buz üzerinde 1 &quot;22 G iğne ve yerine 10 ml şırınga (altı) olarak pankreas sindirim tamponu, 10 ml. Not: sindirim çözeltisi, 10 ml sıçan başına enjekte edilmiştir. buna göre Scale. </li><li> ketamin 1.3 ml (100 mg / ml), ksilazin 0.2 ml (100 mg / ml) ve 3 mL PBS karıştırılarak bir havalandırılmış başlığı içinde anestezi kokteyl 4.5 ml hazırlayın. adacık izolasyonu başlatılması 1 saat içinde anestezik kokteyl hazırlayın. </li><li> HBSS 500 ml yeni doğmuş dana serumu, 25 ml ekleyerek yıkama tamponu hazırlayın. daha sonra kullanmak için buz üzerinde yıkama tamponu yerleştirin. </li><li> Düşük glukoz Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM), 5, 500 ml adacık ortamın 1 şişesi hazırlayın0 ml cenin sığır serumu (FBS), penisilin 5000 ünite / ml streptomisin 5.000 ug / ml olmuştur. </li><li> % 2 FBS, 2 mM glutamin, 5 mM glukoz, penisilin 5000 ünite / ml streptomisin 5.000 ug / ml işlevsellik / canlılığı çözeltisi (500 mi) doku adacığı fonksiyonu orta hazırlayın. Daha sonra kullanmak üzere adacık fonksiyonu medya (4 ° C) saklayın. </li><li> 1X fosfat tamponlu salin içinde 37.38 ml (PBS) 2.5 mi eşek serumu ve 0.12 ml Triton X-100 eklenmesi ile bloke edici tampon 40 mi hazırlayın. daha sonra kullanmak için mağazası bloke tamponu (4 ° C). </li><li> protokolü başlamadan önce gerekli antikorları edinin. Not: PDX-1 (TRITC), Ki-67 (FITC) eş boyama primer β-hücresi çoğaltma taranması için kullanılır. nükleer (DAPI), PDX (Cy5) ve KI-67 (FITC) boyama ile birlikte, soya özel çoğaltma analiz edilmesi için ilave hücre kimliği belirteçleri (TRITC insülin, glukagon, vimentin ya da somatostatin) için immünofloresan boyama yapar. alternatif temsilcisilication belirteçler, örneğin, PCNA, de kullanılabilir. </li><li> dört nüsha olarak gerçekleştirilen her tedavi koşulu ile bir 228-kuyu tedavi planı hazırlayın. (: 666 seyreltme DMSO 1) kuyular pozitif-(5-iyodotübersidindir [1 uM] veya dipiridamol [15 mM]) ve araç kontrolü ekleyin. </li></ol> Pankreas 2. perfüzyon <ol><li> seyreltilmiş anestezik kokteyl çözeltisi (0.30 mL / 100 g vücut ağırlığı) IP enjeksiyonu ile sıçanlarda anestezisi. Sıçan tam anestezi ve ağrılı uyarılara tepkisiz sonra, servikal dislokasyon gerçekleştirin. </li><li> kağıt havlu bir yığın yatar pozisyon (kranial-kaudal yönde) ötenazi sıçan yerleştirin ve% 70 etanol ile karın bölgesini püskürtün. </li><li> U-kesi (kasık bölgesinde baz) ile karın boşluğuna açın ve karın boşluğuna maruz göğüs üzerinde rostral yönde cildi geri çekin. </li><li> Dikkatle, kavisli bir forseps iki çift kullanarak duodenum kapmak ortak b duodenum girdisini bulunile kanal (Oddi sfinkter) ve kavisli hemostatla papillada duodenum açılış kelepçe. </li><li> koledok papilla kelepçe ve kavisli bir forseps kullanarak karaciğere yakın safra kanalı kapmak için kullanılan kavisli hemostat kaldırın. yalıtmak ve safra kanalı ortaya çıkarmak için kavisli bir forseps ile künt diseksiyon kullanın. </li><li> Baş proksimal ve ayak distal ile sıçan yerleştirin. </li><li> Bir pankreas sindirim çözeltisi ile kistik ve hepatik kanalların birleştiği ortak safra kanalı da (MİA) ya da sadece uzak cannulate 10 ml şırınga -yüklü ve yavaş yavaş pankreas sindirim çözeltisi 10 ml enjekte edilir. enjekte ederken, bir neşter sapı ile CBD destek. kanal ve pankreas şişirmek için başarısız olursa iğne yerleştirin. </li><li> inen kolon, bağırsak, mide ve dalak ayırmak için kavisli bir forseps ve ince makas kullanarak şişirilmiş pankreas kaldırın. 5 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içinde buz üzerinde, şişirilmiş pankreas yerleştirin <em&gt; pankreas sindirim çözüm. Not: Maksimum adacık verimi için, her biri 50 mi sindirim tüp içinde 30 dakika ve yerine, sadece 1 veya 2 pankreası içindeki tüm pancreata toplar. </li></ol> Pankreas 3. Ayrışma <ol><li> Bir kez tüm pankreata, toplanan 15 dakika süreyle 37 ° C su banyosu içine sindirim tüpü yerleştirmek edilir. Tüpleri yavaşça her 3 dk girdap. </li><li> 15 dakika sonra, şiddetle boruları (dikey) 10 kez sallayın ve soğuk yıkama tamponu 10 ml ekleyin. Şiddetle boruları ek 5 kez sallayın ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Tüpler, 5 kez ters yüz edilerek gibi soğuk yıkama tamponu ile bir karışımı, 50 ml sindirim tüpü doldurmak. </li><li> 1 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 97 x g&#39;de tüpler santrifüj ve süpernatant dökün. pelet haline doku çıkarmak için dikkatli olun. </li><li> 25 ml yıkama tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırın doku yeniden askıya. Tekrarlayın iki kez daha 3.4 ve 3.5 adımları tekrarlayın. </li><li> Bir st üzerinde 30 gözlü doku elek yerleştirin250 ml beher erile ve elek üzerine doku süspansiyonu dökün. Yıkama tamponu ilave 20 ml ile sindirim borusunu yıkayın ve örgü üzerine dökün. sindirilmemiş pankreas ve yağ dokuları bu aşamada çıkarılır. </li><li> İki yeni bir 50 ml&#39;lik tüplere süzüldü malzeme dökün ve 4 ° C&#39;de 1 dakika için 97 x g&#39;de iplik doku topağı. Durusu süpernatant ve invert tüpleri aşırı tampon süzün. </li></ol> Adacık 4. saflaştırılması <ol><li> tanelenmiş pankreas dokusu soğuk polisükroz / sodyum Diatrizoate çözeltisinin 20 ml (1.119 ug / ml yoğunlukta) eklenir. Homojen hafifçe yukarı pipetleme ve beş kat aşağı her tüpün içeriğini yeniden askıya. </li><li> Yavaşça 10 ml HBSS ile polisükroz / sodyum diatrizoate çözümü kaplaması. yavaş yavaş tüp duvarı boyunca HBSS ekleyerek keskin bir sıvı arayüzü koruyun. </li><li> Yavaş hızlanma ve hiçbir fren 15 dakika (4 ° C) 560 xg&#39;de sindirilmiş pancreata santrifüj. </li><li> CoTaze 50 ml tüpler içinde 10 ml pipet ve yer adacıklar kullanarak arayüzü adacık katmanı llect. Bu aşamada adacıklar havuz yok. </li><li> 4 ° C&#39;de 140 x g&#39;de 1 dakika boyunca, her bir 50 ml tüp ve spin yıkama tamponu 40 ml ekleyin. </li><li> Süpernatantı dökün ve boruları birkaç kez ters yüz edilerek yıkama tamponu 50 ml toplanmış adacıklar yeniden askıya. Bir pelet adacıklar toplamak için 4 ° C&#39;de 97 x g&#39;de 1 dakika için tüpler santrifüjleyin. </li><li> Yıkama tamponu dökün ve yıkama tekrarlayın. doku kültürü kaputu içine adacıklar getirin ve süpernatant aspire. </li><li> Adacık orta 6 ml adacıkların her tüp yeniden askıya. </li><li> Altı oyuklu doku kültürü kabına her bir 50 ml tüp adacıklar aktarın. Kuyunun ortasına adacıklar toplamak ve bir mikroskop altında adacık kalite ve saflıkta gözlemlemek için 6-çukurlu bir tabak döndürülür. </li><li> El ile 1 ml pipet kullanarak adacıklar toplamak ve bitişik içine aldı adacıklar transferide doku adacığı ortam 6 ml ihtiva etmektedir. Tekrarlayın adacık dönen ve 90&gt; kadar% saflık toplama elde edilir. </li><li> Adacık ortamı 20 ml içeren 10 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı saflaştırılmıştır adacıklar aktarın. </li><li> Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde yer adacıklar (37 ° C,% 5 CO2), gece boyunca (Şekil 1A). </li><li> Adacık hücrelerinin, her kat de 804G koşullu ortamın 40 ul 384 gözlü bir levhanın gözleri kaplama hazırlanmasında. bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin. </li></ol> 5. Dağılma ve adacık hücresi Kaplama <ol><li> Ertesi gün, nazikçe hücre kazıyıcı ile 10 cm çanak adacıklar ayırmak ve 50 ml&#39;lik bir tüp içine adacıklar aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 22 xg&#39;de 1 dakika için santrifüjleme ile adacıklar Pelet. süpernatant aspire. </li><li> ılık PBS, 20 ml adacıklar yıkanır ve yukarıdaki gibi süzün. </li><li> % 0.25 tripsin adacıklar (sıçan pankreas başına 150 ul yeniden askıya10 dakika için 37 ° C &#39;de) ile inkübe edilir. Pipet adacıklar ve aşağı 10 kat inkübasyondan 5 ve 10 dakika sonra 1 mL pipet kullanılarak. </li><li> 10 dakika sonra, tam bir sindirim sağlamak ve bir hemositometre kullanılarak adacık hücreleri saymak için mikroskop altında tripsinize adacık 20 ul örnek değerlendirir. 5 dakika ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez daha - sindirilmemiş adacıklar kalırsa, ek 3 inkübasyon devam ediyor. Gerektiği kadar tekrarlayın. Not: Tipik verim ~ 125.000 olan - sıçan başına 150.000 adacık hücreleri. </li><li> inkübatör 804G klimalı ortam kaplı 384-plaka çıkarın ve bir 12-iyi manifoldu aspiratörü kullanarak ortamı çıkarın. </li><li> Adacık fonksiyonu ortamı içinde ml başına 45.000 hücre yoğunluğunda doku adacığı hücre askıya alma ve çok kanallı bir pipet (Şekil 1B) ile oyuk başına 70 ul (3.150 hücre) plaka. Not: Dış kuyularda bulunan β-hücrelerinin N ve sütunlar 4 plaka kullanım satırlar C çevresine doğru göç eğilimi nedeniyle21 6 sıçanlardan izole edilen adacık hücreleri ile 228 kuyu plaka. </li><li> hücre yapışmasını sağlamak için 48 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde plaka koyun. </li></ol> 6. Adacık hücre Kültür Tedavi Tespit ve Boyama <ol><li> Adacık fonksiyonu ortamında 2x konsantrasyonda (muamele koşulları dört kez yapılır) araç ve bileşik 200 ul hazırlayın. Çok-çukurlu pipetleme kolaylaştırmak için bir steril 96 oyuklu plaka içinde bileşikleri düzenlemek. </li><li> Dikkatli bir şekilde 12 oyuklu manifoldu aspiratör adacık orta kaldırmak ve 12 oyuklu bir pipet kullanarak doku adacığı fonksiyonu ortamında (35 ul / oyuk) ile değiştirin. Çıkarın ve (Şekil 1C) kuruma riskini sınırlamak için bir defada bir satır ortamı değiştirin. </li><li> 35 ul / transfer kuyunun 2x bileşik çözeltileri ile muamele başlatın. 48 saat tedavi süresi için inkübatör plaka dönün. </li><li> Tedavinin 48 saat sonra, plakayı baş aşağı çevirerek işleme ortamı süzün. &lt;/ Li&gt; <li> Yavaşça 1 x PBS (1 dakika) oyuk başına 50 ul adacık hücrelerinin yıkayın. Çok kanallı bir pipet kullanılarak PBS ekleyin. </li><li> PBS süzün ve 1 x PBS içinde seyreltilmiş, soğuk% 4 paraformaldehit (PFA), oyuk başına 50 ul ilave edilerek hücrelerin tespit. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> PFA çıkması için plakayı baş aşağı çevrilerek ve yavaşça yukarıdaki gibi göz başına PBS 60 ul ekleyerek hücreleri üç kez (her biri 5 dakika) yıkanır. </li><li> formamid 14.25 ml ve 0.75 mL, 0.15 M sodyum sitrat (pH 6) karıştırılarak 15 mi antijen alma çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce hemen antijen alma çözüm olun. </li><li> plakayı baş aşağı çevirerek oyuklardan çıkarın PBS ve her bir oyuğa 60 ul, antijen alma çözeltisi ilave edilir. 45 dakika süre ile 70 ° C su banyosu içinde plaka ısıtılır. Çok-çukurlu plaka kırışmayı önlemek için Bu kuluçka sırasında plaka üzerine bir ısıtıcı blok yerleştirin. Not: Su yarım yukarı plaka etek olmalıdır; Plaka batık edilmemelidir. </li><li&gt; Su banyosu plaka çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca soğumaya bırakın. plaka görsel muayene ile çarpık olmadığından emin olun. </li><li> 1x PBS üç kez oyuk başına 60 ul (her biri 5 dakika) ile hücrelerin yıkayın. Çok kanallı bir pipet ile PBS ilave edin ve plakayı baş aşağı çevirerek PBS süzün. </li><li> Bloke edici tamponun oyuk başına 40 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek çok kanallı bir pipet kullanın. plakayı baş aşağı ve aktarma yoluyla Bloklama tamponunu çıkarın. </li><li> ve keçi anti-insan PDX-1 (1: 100): Fare Ki-67 (200 1) anti-insan 40 ul ekle her oyuğa blokaj tamponunda seyreltilmiş antikor ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir sonraki gün, yukarıda tarif edildiği gibi üç kez (her biri 5 dakika), anti-vücut çözeltisi süzün ve 1 x PBS ile yıkama hücreleri. PBS Durusu. </li><li> bloke edici tampon içinde (200 1) biyotinile edilmiş eşek anti-fare IgG ve rodamin-konjüge edilmiş eşek anti-keçi IgG seyreltilmiş oyuk başına 40 ul ekle. 1 saat süre ile inkübeoda sıcaklığında. </li><li> 1x PBS ile üç kez, her biri 5 dakika hücreleri yıkayın. Her kuyucuğa Flüoresanla Birleşik streptavidin (bloke edici tampon içinde 400 1) ile seyreltildi ve 40 ul ekle. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkalayın. </li><li> 1x PBS ile üç kez, her biri 5 dakika hücreleri yıkayın. DAPI oyuk (bloklama tamponu içinde 300 nM) başına 40 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve PBS 1x 40 ul hücreleri bırakın. Plaka hemen analiz için hazırdır. </li></ol> 7. β-hücre çoğaltma Analizi Not: Bir deney protokolü β-hücre çoğaltma ölçmek için kullanılan yüksek içerik tarama mikroskop için oluşturulmalıdır. En basit bileşim, bu protokol, bir kimlik markör β-hücrelerinin tanımlamak için kullanılan bir iki-renkli deneyidir (PDX-1 + p-hücreleri) ve bir çoğaltma işaret (Ki-67), hücre bölünmesi olayları tanımlamak için kullanılır. <ol><li> ORTALAMA dayanan nesne (β-hücreleri) belirlenmesiBir β-hücresi çekirdeğine (Şekil 2A) beklenen piksel alanı içinde: (genişlik &lt;1.6 uzunluğu) yaklaşık daire içinde PDX-1 boyama (549 nm filtre) e flüoresans şiddeti. </li><li> Sonraki, PDX-1 + alanda (Şekil 2B) içinde ortalama floresan yoğunluğu (485 nm filtresi) dayalı çoğaltma olayları (Ki-67-pozitifliği) tanımlamak için ayarları oluşturmak. Not: Pozlama süreleri görüntüler arasında piksel yoğunluğu karşılaştırmalar izin sabitlenmelidir. Deney protokol parametreleri makine çağrıları sürekli olumsuz veri kalitesini etkileyecek spesifik olmayan boyama, enkaz ve hücre agrega hariç şekilde ayarlanır. </li><li> doğruluğu ve limit değişkenliği en üst düzeye çıkarmak için, göz başına 500 β-hücrelerinin en az analiz edin. Not: Sıçan adacık kültürlerde bazal β-hücre replikasyonu indeksi 0.5 olması beklenmektedir -% 3. Tipik olarak, kuyu başına 40 resim 500 β-hücreleri tanımlamak için fazlasıyla yeterli. </li><li> analiz öncesindetüm plaka, seçilen negatif-(DMSO-tedavi) ve pozitif kontrol analiz (5-iyodotübersidindir [1 uM] veya dipiridamol [15 mM]) tahlil protokolü geçerliliğini değerlendirmek için kuyu ile tedavi edilen. Deney doğru kurulduğunda, pozitif kontrol bileşikleri, β-hücrelerinin replike yüzdesi en az iki kat artışa neden olur. </li><li> tahlil protokolü doğrulandıktan sonra tüm plaka okuyun. </li></ol>

<ol>
	<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes.">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li><li>Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pathology+and+the+pathogenesis+of+type+1+and+type+2+diabetes+mellitus+revisited.">Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited.</a> Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).</li><li>Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+travails+in+islet+transplantation.">Current advances and travails in islet transplantation.</a> Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).</li><li>Nath, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+pancreas+transplants+for+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).</li><li>Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissue+sources+for+new+beta+cells.">Adult tissue sources for new beta cells.</a> Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+to+insulin+secreting+cells:+two+steps+forward+and+now+a+time+to+pause.">Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Meier, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).</li><li>Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glucose+on+beta+cells+in+pancreatic+monolayer+cultures.">Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures.</a> Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).</li><li>Brelje, T. C., Sorenson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+prolactin+versus+growth+hormone+on+islet+B-cell+proliferation+in+vitro:+implications+for+pregnancy.">Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy.</a> Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF+signalling+controls+age-dependent+proliferation+in+pancreatic+beta-cells.">PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells.</a> Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+and+mammalian+target+of+rapamycin+pathways+contribute+to+DNA+synthesis,+cell+cycle+progression,+and+proliferation+in+human+islets.">Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets.</a> Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).</li><li>Metukuri, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChREBP+mediates+glucose-stimulated+pancreatic+beta-cell+proliferation.">ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation.</a> Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemical+screen+reveals+that+harmine-mediated+inhibition+of+DYRK1A+increases+human+pancreatic+beta+cell+replication.">A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication.</a> Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+replication+and+beta+cell+function+in+adenovirally-transduced+isolated+rodent+islets.">Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening.">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li><li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion:+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms.">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li><li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+(GSK3beta)+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+(Dyrk1A).">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li><li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K++channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion.">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li><li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines.">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li><li>Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transformation+of+a+pancreatic+beta-cell+line+derived+from+transgenic+mice+expressing+a+tetracycline-regulated+oncogene.">Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inducers+of+pancreatic+beta-cell+expansion.">Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).</li><li>Annes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication.">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication.">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li><li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents.">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).</li><li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells.">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, 997-1003 (1995).</li><li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1/insulin+dual-reporter+lentivirus.">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li><li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry,+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets.">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation.">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

β-hücre büyümesini ve yenilenmesini kontrol moleküler yollarını inceleyerek için deneysel yöntemler diyabet araştırmacılar için önemli araçlardır. Burada, bir fare-adacık bazlı tarama platformu sunulmuştur β-hücresi çoğalmasının küçük moleküllü uyarıcıları belirlemek ve karakterize etmek. Bu protokolün en yönlerini kolaylıkla deneyimli araştırmacılar tarafından yerine getirirken, bir kaç adım belirli teknik gerektirir. İlk olarak, adacık izolasyonu...

Diyabet bozulmuş glikoz dengesinin ortak uç noktasını paylaşan bozuklukların bir koleksiyon kapsar. Diyabet alt tiplerinin patojenik mekanizma belirgin olmasına rağmen, azalmış β-hücresi kütlesi, yani insülin üretim kapasitesi 1,2 kaybı sonucu paylaşır. Halen, diyabet tedavi stratejileri eksojen insülin, insülin üretimi veya insülin duyarlılığı geliştirme farmakolojik stimülasyon kronik idaresi itimat ve nadiren, pankreas adacık ya da tüm pankreas 3,4 nakli. Ne yazık ki, bu stratejilerin başarısı kısa sürelidir ve / veya yeterince endojen insülin üretiminin işlevini özetlemek için başarısız olur. β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için bir yöntem geliştirme programı olmasına rağmen, böyle bir yaklaşım var. Sonuç olarak, büyük bir şeker araştırma hedefi, yeni bir β-hücrelerinin üretilmesi için ya da endojen β-hücresi kütlesi 5 genişletmek için yöntemler geliştirmektir </sup&gt;. Bu embriyonik kök hücreleri gibi yenilenebilir kaynaklardan β-hücresi rejenerasyonu ilerlemektedir, ancak, güvenlik ve etkinlik ilgilidir olgun β-hücrelerinin genişlemesi, bir öncelik 6,7 dahil olmak üzere alternatif stratejileri, takip edin. Önemli olarak, in vivo olarak, yeni β-hücrelerinin baskın kaynağı önceden var olan β-hücrelerinin yerine özel bir progenitör hücreler 8,9 olan. β-hücrelerinin, sınırlı çoğaltma kapasitesine, β-hücresi kütlesindeki küçük bir artış sahip gibi görünmektedir, ancak (~% 30) pek çok diyabet hastası glukoz homeostazisin yeniden için yeterli olabilir. Ayrıca, β-hücresi kütlesi yerinde farmakolojik stimülasyon potansiyel olarak pahalı olmayan ve ölçeklenebilir bir tedavi stratejisidir. Burada β-hücresi büyümesini teşvik küçük molekülleri tanımlamak ve ayırt etmek için yüksek içerik tarama yöntemi sunulmaktadır. In vitro deney yöntemleri çeşitli gen ürünlerini ve / veya molekülleri tha tanımlamak için kullanılabilirt birincil β-hücre çoğalmasını teşvik. Β-hücre replikasyonu indüksiyonunu ölçen ilk çabalar, belirli bir tedavi koşullarında 10 yanıt olarak aldehit tiyonin veya insülin lekeli nüfus içinde [3H] timidin eklenmesini, BrdU dahil ve mitotik organları ölçmek için, fetal kemirgen pankreası kültürü ya da dokunulmamış izole adacığı kültürleri kullanılan 11. Bunlar in vitro yaklaşımlar ve yakın varyantları birkaç sınırlamaları vardır. Tanınmış eksiklikler olgun β-hücrelerinin aksine, yüksek bazal β-hücre çoğaltma oranı görüntüleyebilir ve farklı bir şekilde 12 düzenlenen büyümesi, fetal hücrelerin (1) kullanımını içerir; (2) β-hücre çoğaltma olaylarının deneyci bağımlı yargı öznel doğası; (3) β-hücre çoğaltma olaylarının deneyci bağımlı sayım emek ve zaman yoğun doğa deneysel verim geciktirir; Nükleer kuruluş / leke / görünüm (4) kullanımı bile çoğaltma tanımlamak içints ve β-hücreleri belirlemek için bir üst üste binmeyen sitoplazmik leke hücreleri olan B için yakın olmayan β-hücre replikasyonu etkinlikleri yanlış atıf yol açar. Daha yakın zamanda, olgun primer β-hücrelerinin β-hücresi çoğaltma 13-16 aşırı ifade transgenin etkisini hem de gen ürünü ya da bileşim tedavisi değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar, çoğaltma etkinlikleri, β-hücresi tanımlama ve / veya hacmini sınırlayan bağımlı adımlar, örneğin, hücre ya da sağlam adacık bir kayma oyuklu kaplama için sitoplazmik staining- veya spesifik olmayan yöntemlerin ilgili sayımı dayanmıştır parafin gömme ve işleme 17. Özellikle, burada sunulan birine benzer bir görüntü tabanlı insan β-hücre çoğaltma tarama yöntemi, 18 yayımlanmıştır; FEA Ancak, bu testin başarılı bir kullanımı ortaya konmamıştır ve birinci tarama için insan adacık kullanımı genel olarak olmayabilirsible. replikasyon teşvik maddelerin belirlenmesi için alternatif bir strateji, β-hücresi çizgilerinin büyümesi indüksiyonunu değerlendirmek için. İlk çabaları dönüştürülmüş β-hücre hatları gibi min6 hücreleri ya da INS 832/13 hücreleri 14,19-21 kullanılır. Ancak, bu hücre hatları kontrolsüz büyüme gösteren ve iyi diferansiye β-hücreleri 22 az benzerlik taşımaktadır. Sonuç olarak, büyüme-indüksiyon kapasitesi, en az belirsiz alaka ve recapitulate bazen zordur. Hücre satırı tabanlı tarama için geliştirilmiş bir strateji tetrasiklin (doksisiklin) yokluğunda tutuklanan büyüme bağımlı SV40 T antijeni ifade 23,24 olan hücreler &quot;geri dönülebilir dönüştürülmüş&quot; kullanmaktadır. Ancak, bu hücrelerin doksisiklin kaldırılması üzerine &quot;normal&quot; bir β-hücre benzeri duruma dönmek belirsizdir. Ne yazık ki, bu hücrelerin kullanımı derhal kullanıma sahip görünmüyor genelleştirilmiş büyüme destekleyici bileşikler vermiştir24. Genel olarak, en az spontan replikasyon aktivitesi gösteren bir hücre tipi büyüme düzenleme çalışma hücre çizgilerinin kullanımı kısıtlı kullanımı olabilir. Burada sunulan β-hücre çoğaltma tarama platformu mümkün olduğu ölçüde, soy-kısıtlı büyüme destekleyici faaliyetlerin tanımlanmasını sağlamak için karma hücre tipi bileşiminin adacık hücre kültürleri, multi canlılarda büyüme yönetmelikte korumak için olgun birincil sıçan β-hücreleri kullanır eh verimlilik ve otomatik analiz maksimize etmek biçimlendirme önyargı ortadan kaldırmak ve verimi kolaylaştırmak için. Bu platformun başarılı kullanımı β-hücre çoğaltma 25,26 teşvik birkaç bileşiklerin belirlenmesini sağladı. Ayrıca, tahlil β-hücre çoğaltma moleküler regülasyonu içine mekanistik anlayış sağlamak için yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları ve kimyasal epistasi deneyleri için kullanılır olmuştur. sunulan platformu başarıyla fo uyarlanmıştırβ-hücre çoğalmasının r lentiviral RNAi tabanlı soruşturma 25 yolaklarıyla. tahlilinde sınırlamaları (birincil hücre kullanımının) ölçeklenebilirlik Kısıtlı&#39;dır yerine antikor bazlı görüntüleme ve primer adacık kullanım, kullanım ile bağlantılı (deney insan doku adacığı çalışmaları için adapte edebilir) insan doku adacığı hücrelerinden, giderleri daha kemirgen kullanımı görüntü elde etme ve analiz yeteneği ile otomatik mikroskop doluluk durumuna bağlı olarak otomatik görüntü toplama ve bağımlılığını kolaylaştırmak için dağınık adacıklar (bozulmuş adacık mimarisi). Gen ürünlerinin ya da in situ β-hücresi rejenerasyonunu teşvik eden bileşiklerin belirlenmesi için basit, in vivo bir tarama yöntemi ideal olacaktır, ancak bu platform yapılmamış 27 kullanılamaz. Sonuç olarak, açıklanan platformu β-hücre çoğalmasının en yönlerini araştıran ilgilenen araştırmacı için uygundur.

<table><tbody><tr><td>250 g male Male Sprague Dawly Rat</td><td>Charles River</td><td>Stain # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 cm teeth tisuue forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14.5 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16 cm curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 cm curved hepostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12 cm scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue sieve-30 mesh</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI, 375,000 CDA units</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine (5 g/50 ml)</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>Functionality/Viability Solution&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 media&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>804G rat bladder carcinoma cell-line</td><td>Available upon request</td><td></td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Formamide 500 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td></tr><tr><td>Dextrose, Anhydrous</td><td>EMD Chemicals</td><td>DX0145-1</td><td>to make 1 M glucose solution</td></tr><tr><td>Nomal Donkey Serum (Powder)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Ki67 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human PDX-1 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Reagent Reservoir 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipettor</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12-channel vaccume aspirator</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Water Bath Model 2223&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

β-hücre ya da α-hücresi çoğalmasını değerlendirmek için, dört renkli bir deney protokolü gereklidir. İlk olarak, nesnelerin DAPI lekelemesi (kanal 1, 386 nm) ile belirlenmiştir. Sonraki, β-hücreleri (olay 1) sayılır: nesneleri PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) ve peri-nükleer insülin (kanal 3, 549 nm) co-ifade eder. Daha sonra, kopyalayan β-hücreleri (olay 2) sayılır: (olay 1) co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (Şekil 3)-hücreleri ß. β-hüc...

Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet Î²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

a-high-content-vitro-pancreatic-islet-cell-replication-discovery

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

11.1K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine.  diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek. 

Video: A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Gelişim Biyolojisi

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Tıp

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Biyomühendislik

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biyoloji

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

İnsan Psödoisletlerinde Hücre İçi Sinyalleşme Olayları ve Hormon Salgılanması

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Yazar Spotlight: Pseudoislet Protokolü ile Adacık Anormalliklerinin ve İşlevinin Araştırılması 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Bir Yüksek içerik

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler