Name: a high-content in vitro pancreatic islet β-cell replication discovery platform
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet Î²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Questo protocollo è stata effettuata in accordo con il Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della Stanford University School of Medicine. Il protocollo descritto viene scalata per isolamento delle isole da sei 250 - 300 g (8 - 9 settimane) maschi ratti Sprague Dawley, che è sufficiente a generare 228 pozzetti di una piastra a 384 pozzetti per la valutazione replica isolotto-cellula. 1. Preparazione del materiale <ol><li> Preparare supporti di rivestimento prima di iniziare isolamento delle isole raccogliendo media condizionato di cellule di carcinoma della vescica di ratto 804G mantenuti a confluenza per 3 giorni (20 ml di RPMI1640) in 15 centimetri coltura tissutale piatto 28. filtro sterile e conservare (-20 ° C) i media condizionata per un uso successivo. </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici (uno 12 cm pinze dei tessuti dentate, uno 11,5 cm forbici sottili, uno 14,5 cm forbici chirurgiche, due 16 cm pinze curve, uno di 12 cm emostatica ricurva, uno 12 cm maniglia bisturi) e un setaccio del tessuto 30 mesh prima di initiating isolamento delle isole. </li><li> Preparare la soluzione di digestione pancreatica sciogliendo un 60%: 40% miscela di classe I purificata: classe collagenasi II (attività collagenasi totale di 300.000 - 400.000 unità) in 60 ml di soluzione salina bilanciata 1x Hanks &#39;(HBSS) supplementato con calcio e magnesio. Carico 10 ml di tampone di digestione pancreatica in 10 ml siringhe (sei) con 1 &quot;22 ago G e posto su ghiaccio. Nota: 10 ml di soluzione di digestione viene iniettato per ratto. Scala di conseguenza. </li><li> Preparare 4,5 ml di cocktail di anestetico in una cappa ventilata miscelando 1,3 ml di ketamina (100 mg / ml), 0,2 ml di xilazina (100 mg / ml) e 3 ml di PBS. Preparare il cocktail anestetico entro 1 ora di iniziare isolamento delle isole. </li><li> Preparare tampone di lavaggio aggiungendo 25 ml di siero di vitello neonato a 500 ml di HBSS. Mettere il tampone di lavaggio in ghiaccio per un uso successivo. </li><li> Preparare 1 bottiglia di terreno isolotto che si trova a 500 ml di Modified Eagle Medium basso livello di glucosio Dulbecco (DMEM), 50 ml di siero fetale bovino (FBS), 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina. </li><li> Preparare funzione isolotto mezzo dalla soluzione funzionalità / vitalità (500 ml) con il 2% FBS, 2 mM glutammina, 5 mM di glucosio, 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina. Conservare il supporto funzionalità delle isole (4 ° C) per un uso successivo. </li><li> Preparare 40 ml di tampone di bloccaggio con l&#39;aggiunta di 2,5 ml di siero asino e 0,12 ml di Triton X-100-37,38 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). Conservare tampone bloccante (4 ° C) per un uso successivo. </li><li> Ottenere gli anticorpi necessari prima di iniziare il protocollo. Nota: PDX-1 (TRITC) e Ki-67 (FITC) co-colorazione viene utilizzato per lo screening primario replica β-cellule. Per l&#39;analisi replica specifici lignaggio, eseguire immunofluorescenza per i marcatori supplementari identità delle cellule (insulina, glucagone, vimentina o somatostatina; TRITC) insieme a nucleare (DAPI), PDX (Cy5) e Ki-67 (FITC) colorazione. rep Alternativemarcatori licazione, ad esempio, PCNA, possono anche essere utilizzati. </li><li> Preparare un piano di trattamento 228-bene con ogni condizione di trattamento effettuato in quadruplicato. Includi comandata (5-Iodotubercidin [1] micron o il dipiridamolo [15 micron]) e il veicolo di controllo (DMSO 1: 666 diluizione) pozzi. </li></ol> 2. Perfusione del pancreas <ol><li> Anestetizzare topi mediante iniezione ip di soluzione di cocktail anestetico diluito (0.30 ml / 100 g di peso corporeo). Una volta che il ratto è completamente anestetizzato e non risponde agli stimoli nocivi, eseguire la dislocazione cervicale. </li><li> Posizionare il topo eutanasia in posizione (orientamento cranio-caudale) in posizione supina su una pila di carta assorbente e spruzzare la zona addominale con il 70% di etanolo. </li><li> Aprire la cavità addominale con una U-incisione (base alla regione pubica) e retrarre pelle in direzione rostrale sul torace per esporre la cavità addominale. </li><li> afferrare con cautela il duodeno utilizzando due coppie di pinze curve, individuare la voce duodenale dei comuni Bcondotto ile (sfintere di Oddi) e serrare l&#39;apertura duodenale presso la papilla con una pinza emostatica curva. </li><li> Sollevare la pinza emostatica curva utilizzato per bloccare il dotto biliare comune papilla e afferrare il dotto biliare vicino al fegato utilizzando una pinza curve. Utilizzare smussa con le pinze curve per isolare ed esporre il dotto biliare. </li><li> Riposizionare il topo con la testa prossimale e distale i piedi. </li><li> Cannulate il dotto biliare comune (CBD) in corrispondenza o appena distale alla giunzione dei condotti epatici cistiche e comuni con una soluzione di digestione pancreatica MOLLA siringa da 10 ml e iniettare lentamente 10 ml di soluzione di digestione del pancreas. Mentre l&#39;iniezione, sostenere il CBD con un manico bisturi. Riposizionare l&#39;ago se il condotto e il pancreas non riescono a gonfiare. </li><li> Rimuovere il pancreas gonfiati utilizzando le pinze curve e forbici sottili per separarlo dal colon discendente, intestino, stomaco e la milza. Posizionare il pancreas gonfiati su ghiaccio in una provetta da 50 ml contenente 5 ml di <em&gt; soluzione di digestione del pancreas. Nota: Per ottenere la massima resa isolotto, raccogliere tutte pancreas in 30 minuti e il luogo solo 1 o 2 pancreas in ciascun tubo 50 ml digestione. </li></ol> 3. La dissociazione del pancreas <ol><li> Una volta che tutti pancreas sono raccolti, posizionare i tubi di digestione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 15 min. Mescolare delicatamente i tubi ogni 3 min. </li><li> Dopo 15 minuti, agitare vigorosamente (verticale) i tubi per 10 volte e aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio a freddo. Agitare vigorosamente i tubi di un ulteriore 5 volte e disporli sul ghiaccio. </li><li> Riempire i tubi di digestione a 50 ml con tampone di lavaggio a freddo e mescolare invertendo i tubi 5 volte. </li><li> Centrifugare le provette a 97 xg a 4 ° C per 1 minuto e versare il sopranatante. Fare attenzione a non rimuovere il tessuto pellet. </li><li> Aggiungere 25 ml di tampone di lavaggio e risospendere il tessuto vortex delicatamente. Ripetere i punti 3.4 e 3.5 altre due volte. </li><li> Posizionare un setaccio da 30 mesh tessuto su una sterile 250 ml bicchiere e versare la sospensione di tessuto sul setaccio. Sciacquare il tubo di digestione con altri 20 ml di tampone di lavaggio e versare sulla rete. I tessuti pancreatici e grasso non digerito vengono rimossi in questa fase. </li><li> Versare il materiale filtrato in due freschi provette da 50 ml e pellet tessuto facendo girare a 97 xg per 1 min a 4 ° C. tubi surnatante e invertire decantare per drenare l&#39;eccesso di buffer. </li></ol> 4. Purificazione di isolotti <ol><li> Aggiungere 20 ml di soluzione diatrizoato freddo polysucrose / sodio (1.119 g / ml densità) per il tessuto pancreatico pellet. Omogeneamente risospendere il contenuto di ciascuna provetta delicatamente pipettando su e giù cinque volte. </li><li> sovrapporre delicatamente la soluzione diatrizoato polysucrose / sodio con 10 ml di HBSS. Mantenere una interfaccia liquido tagliente aggiungendo lentamente l&#39;HBSS lungo la parete del tubo. </li><li> Centrifugare il pancreas digerito a 560 xg per 15 min (4 ° C) con lenta accelerazione e senza freno. </li><li> collect lo strato isolotto dall&#39;interfaccia con un 10 ml pipetta e posto isolotti in fresco provette da 50 ml. Non comune le isole in questa fase. </li><li> Aggiungere 40 ml di tampone di lavaggio a ciascuna provetta 50 ml e centrifugare per 1 min a 140 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere isolotti pool in 50 ml di tampone di lavaggio invertendo i tubi diverse volte. Centrifugare le provette per 1 min a 97 xga 4 ° C per raccogliere isolotti in un pellet. </li><li> Eliminare il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio. Portare isolotti nella cappa coltura tissutale e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere ogni tubo di isolotti in 6 ml di terreno isolotto. </li><li> Trasferire le isolette di ogni tubo da 50 ml in un pozzo di sei pozzetti piatto di coltura di tessuti. Agitare il piatto 6 pozzetti per la raccolta isolette in mezzo del pozzo e di osservare la qualità e la purezza isolotto al microscopio. </li><li> raccogliere manualmente isolotti usando una pipetta ml 1 e trasferire gli isolotti raccolti nella adiacentepozzetto contenente 6 ml di mezzi insulari. Ripetere vorticoso isolotto e raccogliendo fino a&gt; 90% di purezza si ottiene. </li><li> Trasferire gli isolotti purificati ad un 10 centimetri piatto di coltura tissutale contenente 20 ml di terreno isolotto. </li><li> Inserire isolotti in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2) durante la notte (Figura 1A). </li><li> In preparazione di placcatura cellule insulari, cappotto i pozzetti di una piastra da 384 pozzetti con 40 ml di 804G mezzi condizionati per pozzetto. Incubare per una notte in un incubatore di coltura tissutale. </li></ol> 5. Dispersione e placcatura di cellule insulari <ol><li> Il giorno seguente, staccare delicatamente isolotti dal 10 centimetri piatto con un raschietto cellulare e trasferire gli isolotti in un tubo da 50 ml. </li><li> Pellet gli isolotti di centrifugazione per 1 min a 22 xg a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante. </li><li> Lavare le isolette con 20 ml di PBS calda e decantare come sopra. </li><li> Risospendere isolotti a 0,25% tripsina (150 ml per il pancreas di ratto) E incubare a 37 ° C per 10 min. Pipetta isolotti su e giù per 10 volte con 1 ml pipetta dopo 5 e 10 minuti di incubazione. </li><li> Dopo 10 minuti, la valutazione di un campione di 20 ml di isolotti trypsinized sotto il microscopio per garantire la completa digestione e per contare le cellule delle isole con un emocitometro. Se isolotti non digerito rimangono, continuare incubazione per un ulteriore 3 - 5 minuti e pipetta su e giù per 10 volte di più. Ripetere se necessario. Nota: Il rendimento tipico è ~ 125.000 - 150.000 isolotto-cellule per topo. </li><li> Rimuovere 804G condizionata piastra a 384 pozzetti supporti rivestita dal termostato e rimuovere i supporti utilizzando un aspiratore 12-bene collettore. </li><li> Sospendere cellule insulari ad una densità di 45.000 cellule per ml in mezzo funzione Islet e piastra 70 microlitri (3.150 celle) per pozzetto con una pipetta multicanale (Figura 1B). Nota: Poiché cellule beta situati nei pozzetti esterni tendono a migrare verso il perimetro della piastra di uso righe C a N e colonne 4al 21 al piatto 228 pozzi con l&#39;isolotto cellule isolate da 6 ratti. </li><li> Porre la piastra in cultura incubatore di tessuto per 48 ore per permettere l&#39;adesione cellulare. </li></ol> 6. Cultura Islet-cellula di trattamento, fissaggio e la colorazione <ol><li> Preparare 200 ml di veicolo e composti (condizioni di trattamento vengono eseguite in quadruplicato) ad una concentrazione 2x in medium funzione Islet. Disporre composti in una piastra a 96 pozzetti sterili per facilitare multi-bene pipettaggio. </li><li> Rimuovere con cautela media isolotto con un aspiratore 12-bene collettore e sostituire con il mezzo funzionalità delle isole (35 ml / pozzetto) usando una pipetta 12-bene. Rimuovere e sostituire il supporto di una riga alla volta per limitare il rischio di essiccazione (Figura 1C). </li><li> Iniziare il trattamento con il trasferimento di 35 ml / pozzetto delle soluzioni composti 2x. Ritorna piastra al incubatore per la durata del trattamento 48 hr. </li><li> Dopo 48 ore di trattamento, decantare il supporto trattamento invertendo la piastra. &lt;/ Li&gt; <li> Lavare delicatamente le cellule delle isole con 50 ml per pozzetto di PBS 1x (1 min). Aggiungere il PBS usando una pipetta multicanale. </li><li> Decantare il PBS e fissare le cellule con l&#39;aggiunta di 50 ml per pozzetto di freddo 4% paraformaldeide (PFA) diluito in PBS 1x. Incubare le cellule per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule tre volte (5 min ciascuna) invertendo la piastra per rimuovere il PFA e aggiungendo delicatamente 60 ml di PBS per pozzetto come sopra. </li><li> Preparare la soluzione di recupero 15 ml antigene mescolando 14,25 ml di formammide e 0,75 ml 0,15 M citrato di sodio (pH 6). Rendere la soluzione di antigene recupero immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Rimuovere PBS dai pozzi invertendo la piastra e aggiungere 60 microlitri soluzione di antigene di recupero in ogni pozzetto. Riscaldare la piastra a 70 ° C bagnomaria per 45 min. Posizionare un blocco riscaldante sulla parte superiore della piastra durante l&#39;incubazione per evitare deformazioni della piastra multi-pozzo. Nota: L&#39;acqua dovrebbe essere a metà strada su per la gonna piatto; targa non deve essere immersa. </li><li&gt; rimuovere la piastra dal bagnomaria e lasciare raffreddare per 20 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che la piastra non è deformato mediante ispezione visiva. </li><li> Lavare le cellule con 60 ml per pozzetto di PBS 1x per tre volte (5 minuti ciascuno). Aggiungere PBS con una pipetta multicanale e decantare PBS invertendo la piastra. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale aggiungere 40 microlitri per pozzetto di tampone bloccante e incubare per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone bloccante invertendo la piastra e decantazione. </li><li> Aggiungere 40 ml di topo anti-umano Ki-67 (1: 200) e di capra anti-umano PDX-1 (1: 100) anticorpi diluiti in tampone bloccante in ciascun pozzetto e incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Il giorno successivo, decantare la soluzione anti-corpo e lavare le cellule con PBS 1x tre volte (5 min ciascuna) come sopra descritto. Decantare il PBS. </li><li> Aggiungere 40 ml per pozzetto di diluito (1: 200) asino biotinilato anti-topo IgG e asino rodamina-coniugato anti-IgG di capra in tampone di bloccaggio. Incubare per 1 oraa temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con PBS 1x per tre volte, 5 minuti ciascuno. Aggiungere 40 ml di diluito (1: 400 in tampone bloccante) fluoresceina coniugato streptavidina ad ogni pozzetto. Incubare 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con PBS 1x per tre volte, 5 minuti ciascuno. Aggiungere 40 ml per pozzetto di DAPI (300 Nm nel tampone di bloccaggio) e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con PBS 1x due volte e lasciare le cellule in 40 ml PBS 1x. La piastra è ora pronto per essere analizzati. </li></ol> La replica Analisi 7. β-cellulare Nota: Un protocollo dosaggio deve essere stabilito per l&#39;alto contenuto di microscopio di screening utilizzato per misurare la replica di β-cellule. Nella sua composizione semplice, questo protocollo è un saggio a due colori in cui un marcatore di identità viene utilizzato per definire cellule beta (PDX-1 + -cellule) e un indicatore di replica (Ki-67) viene utilizzato per definire gli eventi di divisione cellulare. <ol><li> Identificare oggetti (cellule beta) basate sul averagintensità di fluorescenza e di PDX-1 colorazione (549 filtro nm) all&#39;interno di un cerchio approssimativa (lunghezza: larghezza &lt;1.6) all&#39;interno dell&#39;area di pixel previsto un nucleo β-cellulare (Figura 2A). </li><li> Successivamente, stabilire le impostazioni per identificare gli eventi di replica (Ki-67-positività) basati sulla intensità media di fluorescenza (485 nm filtro) all&#39;interno del PDX-1 + (Figura 2B). Nota: I tempi di esposizione devono essere fissati per consentire il confronto di intensità dei pixel attraverso le immagini. parametri del protocollo del test vengono regolati in modo tale che le chiamate di macchine costantemente escludono colorazione, detriti e cellule aggregati non specifici che potrebbero influenzare negativamente la qualità dei dati. </li><li> Analizzare un minimo di 500 beta-cellule per pozzetto per massimizzare la precisione e limitare la variabilità. Nota: L&#39;indice replica β-cellule basali nelle culture delle isole di ratto dovrebbe essere 0,5-3%. Tipicamente, 40 immagini al bene è più che sufficiente per identificare 500 cellule beta. </li><li> Prima di analizzare ilintera piastra, analizzare negativo- selezionato (DMSO-trattato) e positivo di controllo (5-iodotubercidin [1 micron] o il dipiridamolo [15 micron]) -treated pozzi per valutare la validità del protocollo del test. Quando il test è stabilita in maniera corretta, composti di controllo positivi inducono almeno un aumento di due volte della percentuale di replicare cellule beta. </li><li> Leggi l&#39;intera piastra una volta che il protocollo di analisi viene convalidato. </li></ol>

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	<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes.">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li><li>Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pathology+and+the+pathogenesis+of+type+1+and+type+2+diabetes+mellitus+revisited.">Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited.</a> Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).</li><li>Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+travails+in+islet+transplantation.">Current advances and travails in islet transplantation.</a> Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).</li><li>Nath, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+pancreas+transplants+for+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).</li><li>Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissue+sources+for+new+beta+cells.">Adult tissue sources for new beta cells.</a> Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+to+insulin+secreting+cells:+two+steps+forward+and+now+a+time+to+pause.">Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Meier, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).</li><li>Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glucose+on+beta+cells+in+pancreatic+monolayer+cultures.">Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures.</a> Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).</li><li>Brelje, T. C., Sorenson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+prolactin+versus+growth+hormone+on+islet+B-cell+proliferation+in+vitro:+implications+for+pregnancy.">Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy.</a> Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF+signalling+controls+age-dependent+proliferation+in+pancreatic+beta-cells.">PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells.</a> Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+and+mammalian+target+of+rapamycin+pathways+contribute+to+DNA+synthesis,+cell+cycle+progression,+and+proliferation+in+human+islets.">Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets.</a> Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).</li><li>Metukuri, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChREBP+mediates+glucose-stimulated+pancreatic+beta-cell+proliferation.">ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation.</a> Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemical+screen+reveals+that+harmine-mediated+inhibition+of+DYRK1A+increases+human+pancreatic+beta+cell+replication.">A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication.</a> Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+replication+and+beta+cell+function+in+adenovirally-transduced+isolated+rodent+islets.">Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening.">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li><li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion:+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms.">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li><li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+(GSK3beta)+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+(Dyrk1A).">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li><li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K++channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion.">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li><li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines.">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li><li>Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transformation+of+a+pancreatic+beta-cell+line+derived+from+transgenic+mice+expressing+a+tetracycline-regulated+oncogene.">Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inducers+of+pancreatic+beta-cell+expansion.">Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).</li><li>Annes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication.">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication.">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li><li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents.">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).</li><li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells.">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, 997-1003 (1995).</li><li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1/insulin+dual-reporter+lentivirus.">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li><li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry,+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets.">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation.">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

metodi sperimentali per studiare i meccanismi molecolari che controllano la crescita delle cellule β-e rigenerazione sono strumenti importanti per i ricercatori del diabete. Qui, una piattaforma di screening basata rat-isolotto di identificare e caratterizzare stimolatori piccole molecole di replicazione β-cellule è presentato. Mentre la maggior parte degli aspetti di questo protocollo sono facilmente eseguiti da ricercatori esperti, a pochi passi richiedono particolare tecnica. In primo ...

Diabete comprende una raccolta di disturbi che condividono il punto finale di omeostasi del glucosio perturbato comune. Sebbene i meccanismi patogenetici dei sottotipi di diabete sono distinte, che condividono la conseguenza della riduzione della massa β-cellule, cioè, la perdita di capacità di produzione di insulina 1,2. Attualmente, le strategie di trattamento del diabete si basano su somministrazione cronica di insulina esogena, la stimolazione farmacologica della produzione di insulina o il miglioramento della sensibilità all&#39;insulina, e raramente, il trapianto di isole pancreatiche o tutta 3,4 pancreas. Purtroppo, il successo di queste strategie è di breve durata e / o non sufficientemente ricapitolare la funzione di produzione di insulina endogena. Nonostante l&#39;utilità di sviluppare un metodo per stimolare la rigenerazione β-cellule, non esiste tale approccio. Di conseguenza, uno dei principali obiettivi di ricerca del diabete è quello di sviluppare metodi per generare nuove cellule beta o per espandere la massa endogena β-cellule 5 </sup&gt;. Anche se la rigenerazione delle cellule β-da fonti rinnovabili come le cellule staminali embrionali sta avanzando, sicurezza ed efficienza preoccupazioni rendono il perseguimento di strategie alternative, tra cui l&#39;espansione delle beta cellule mature, una priorità 6,7. È importante sottolineare che la fonte principale di nuove beta-cellule in vivo è preesistenti beta-cellule, piuttosto che le cellule progenitrici specializzate 8,9. Sebbene cellule beta sembrano avere capacità di replicazione limitata, un piccolo incremento della massa β-cellulare (~ 30%) può essere sufficiente a ripristinare l&#39;omeostasi del glucosio in molti diabetici. Inoltre, in situ stimolazione farmacologica della massa β-cellule è una strategia di trattamento potenzialmente poco costoso e scalabile. Qui un metodo di screening ad alto contenuto per identificare e caratterizzare piccole molecole che stimolano la crescita delle cellule β-è presentato. Una varietà di metodi sperimentali in vitro può essere utilizzato per identificare prodotti genici e / o molecole that promuovere la replicazione β-cellule primarie. I primi sforzi per misurare l&#39;induzione replica β-cellule utilizzate fetale cultura roditore pancreas o culture isolate delle isole intatte per misurare [3 H] timidina, incorporazione di BrdU o gli organismi mitotico all&#39;interno della aldeide-tionina o insulina popolazione macchiato in risposta a condizioni di trattamento specifiche 10, 11. Questi approcci in vitro e varianti dello stesso hanno diverse limitazioni. Carenze prominenti includono (1) l&#39;uso di cellule fetali che, a differenza di beta-cellule mature, mostrano un alto tasso di replicazione β-cellule basali e sono la crescita regolata in modo distinto 12; (2) la natura personale di aggiudicazione sperimentatore-dipendente di eventi di replica β-cellule; (3) del lavoro e la natura intensiva tempo di conteggio sperimentatore-dipendente di eventi di replica β-cellule ritarda il throughput sperimentale; (4) l&#39;uso di armi nucleari incorporazione / macchie / aspetto di individuare replica anchets e una macchia citoplasmatica non sovrapposizione di identificare cellule beta porta alla falsa attribuzione di eventi di replica non β-cellule prossimità cellule beta. Più recentemente mature beta cellule primarie sono stati utilizzati per valutare l&#39;impatto del transgene sovra-espressione, così come prodotto del gene o composto trattamento sulla replica β-cellule 13-16. Tuttavia, questi studi hanno anche invocato il conteggio personale di eventi di replica, metodi staining- citoplasmatica o non specifici per l&#39;identificazione β-cellulare e / o passaggi alta intensità di lavoro che limitano il throughput, ad esempio, slide-ben placcatura individuale di cellule o isolotto intatto paraffina e l&#39;elaborazione 17. In particolare, un β-cellula umana metodologia di screening replica basata su immagine, simile a quella qui presentata, è stato pubblicato 18; tuttavia, l&#39;uso di successo di questo test non è stato dimostrato e l&#39;uso di isole umane per lo screening primario può non essere ampiamente FEAbile. Una strategia alternativa per identificare le sostanze replica di promozione è quello di valutare l&#39;induzione della crescita delle linee di β-cellule. Gli sforzi iniziali usati trasformate cellule beta-linee come MIN6 cellule o INS 832/13-celle 14,19-21. Tuttavia, queste linee cellulari dimostrano la crescita incontrollata e somigliano poco a ben differenziati cellule beta 22. Di conseguenza, la capacità di crescita di induzione è minima, di rilevanza poco chiare e talvolta difficile ricapitolare. Una migliore strategia per lo screening basato linea cellulare utilizza &quot;reversibile trasforma&quot; le cellule che sono la crescita arrestato in assenza di tetraciclina (doxiciclina) -dipendente SV40 antigene T espressione 23,24. Tuttavia, non è chiaro se queste cellule ritornare allo stato β-cell-like &quot;normale&quot; dopo la rimozione doxiciclina. Purtroppo, l&#39;uso di queste cellule ha ceduto composti promotori della crescita generalizzate che non sembrano avere utilità immediata24. In generale, l&#39;uso di linee cellulari per studiare regolazione della crescita di una cellula tipo visualizzazione minima attività di replica spontanea può avere limitata applicabilità. La piattaforma di screening replica β-cellule qui presentata utilizza maturi primari di ratto beta-cellule per mantenere nella regolazione della crescita in vivo, per quanto possibile, le culture isolotto-cellula di composizione delle cellule di tipo misto per consentire l&#39;identificazione delle attività di promozione della crescita lignaggio-ristretta, Multi -well formattazione per massimizzare il throughput e analisi automatizzata per eliminare pregiudizi e facilitare il throughput. Uso di successo di questa piattaforma ha permesso l&#39;identificazione di diversi composti che promuovono la replicazione β-cellule 25,26. Inoltre, il test è stato utilizzato per studi di relazione struttura-attività ed esperimenti epistatici chimici per fornire intuizioni meccanicistici nella regolazione molecolare della replicazione β-cellule. La piattaforma presentata è stata adattata con successo FOindagine R lentiviral RNAi-based di replica β-cellule Percorsi di 25. Limitazioni del test comprendono limitati scalabilità (uso di cellule primarie), uso di roditore piuttosto che isolotto-cellule umane (anche se il dosaggio può essere adattato per gli studi delle isole umane), spese associate con l&#39;imaging a base di anticorpi e l&#39;uso isolotto primaria, l&#39;uso di isolotti dispersi (architettura isolotto interrotto) per facilitare l&#39;acquisizione delle immagini automatizzata e dipendenza dalla disponibilità di un microscopio automatico con acquisizione delle immagini e capacità di analisi. Sebbene un metodo in vivo facile screening per identificare prodotti genici o composti che stimolano la rigenerazione β-cellule in situ sarebbe ideale, tale piattaforma non è ancora disponibile 27. Di conseguenza, la piattaforma descritto è appropriato per ricercatore interessa indagare molti aspetti della replica β-cellule.

<table><tbody><tr><td>250 g male Male Sprague Dawly Rat</td><td>Charles River</td><td>Stain # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 cm teeth tisuue forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14.5 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16 cm curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 cm curved hepostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12 cm scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue sieve-30 mesh</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI, 375,000 CDA units</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine (5 g/50 ml)</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>Functionality/Viability Solution&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 media&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>804G rat bladder carcinoma cell-line</td><td>Available upon request</td><td></td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Formamide 500 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td></tr><tr><td>Dextrose, Anhydrous</td><td>EMD Chemicals</td><td>DX0145-1</td><td>to make 1 M glucose solution</td></tr><tr><td>Nomal Donkey Serum (Powder)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Ki67 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human PDX-1 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Reagent Reservoir 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipettor</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12-channel vaccume aspirator</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Water Bath Model 2223&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

Per valutare β-cellula o la replicazione α-cellule, è necessario un protocollo di dosaggio a quattro colori. Innanzitutto, gli oggetti sono identificati dalla colorazione DAPI (Canale 1, 386 nm). Successivamente, le cellule beta (evento 1) sono contati: oggetti che co-esprimono PDX-1 + (canale 2, 650 nm) e di insulina peri-nucleare (canale 3, 549 nm). Successivamente, che replicano le cellule beta (evento 2) sono contati: le cellule beta (evento 1) che co-express Ki-67 (can...

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A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l&#39;attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

11.1K Views.  Stanford University School of Medicine.  sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato. 

Video: A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Medicina

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

Analisi co-coltura delle interazioni proteina extracellulare che influenzano secrezione di insulina da parte del pancreas cellule beta

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Bioingegneria

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Eventi di segnalazione intracellulare e secrezione ormonale in pseudoisole umane

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Autore in primo piano: Indagine sulle anomalie e sulla funzione delle isole con un protocollo Pseudoislet 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

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