この作品は、JDRF 1-FAC-2014から243-AN APF、ADA、BCMにおける糖尿病研究センター（P30-DK079638）のパイロット/フィージビリティプログラム、MLBにNIH（5K22A1119151-01と1R56DK104903-01）からの助成金によってサポートされていました1-15-JF-07、MBに免疫フェローシップ、およびロバートとジャニス・マクネア財団でAAI採用。

倫理文：あらゆる努力を照射し、尾静脈注射時に最小限に動物の不快感やストレスを維持するために行われます。マウスをこれらの実験における細胞の供給源として使用されます。以下のような何の手順や操作が安楽死から離れてはありません。マウスは死を確認するために、頸椎脱臼に続いてCO 2吸入によって安楽死させます。この手順では、アメリカ獣医師会の安楽死に関するパネルの勧告と一致しています。 1.レトロウイルス構築物を準備します<ol><li>サブクローンT細胞受容体（TCR）αおよびβ鎖は、MSCVベースのレトロウイルス11ベクター（例えば、pMIAIIまたはpMIGII）11内に、図2（a）のリンカーによって分離されます。 注：図2（a）リンカーは単一のオープンリーディングフレームからのαおよびβTCR鎖の化学量論と一致発現を可能にします。ベクターがするために使用されるIRES蛍光タンパク質カセット（アメトリンまたはGFP）が含まれ形質導入した細胞と形質導入効率を追跡します。詳細なプロトコルの場合ホルストらを参照してください。11 </li><li>商業的に得られた血漿プレップキットまたは類似の製品を使用してプラスミドDNAを単離します。 μlの2μgの-1 - 1の作業濃度を使用してください。 </li></ol>レトロウイルスプロデューサー細胞株の2世代<ol><li>レトロウイルスプロデューサー細胞株を生成するために二段階のプロセスを利用します。 注：詳細なプロトコルでは、ホルストら 11を参照してください。 <ol><li> 3つのプラスミド（pVSVG、PEQ-Pam3（-E）および利息11のベクトル）と293T細胞の一過性トランスフェクションによって、レトロウイルスを生成し、GP + E86エコトロピックレトロウイルスプロデューサー細胞株を形質導入した293T細胞からのレトロウイルス上清を取ります。 </li><li> FACSによってGP + E86プロデューサーを発現する細胞の蛍光の上部40％を隔離し、ウイルスのソースとしてtransdcuced-GP + E86プロデューサー細胞を増殖させます。 注：世代高力価生産の骨髄細胞の効率的な形質導入のために重要です。完全なプロトコルについてはホルストらをご覧ください。11 </li></ol></li></ol> 3.レトロウイルス媒介性の幹細胞の遺伝子導入（日-5） <ol><li>このプロトコルの0日によって2コンフルエント150 mmプレートのための十分な成長を可能にするために、完全DMEM中の各GP + E86のプロデューサー細胞株10％（体積/体積）のFBS 0.5 -1.0×10 6を解凍し、文化。 注：解凍0.5 -また、GP + E86を拡大するために5日間の培養を可能にします。この5日目で50％の密集度- 10cmプレート内の各GP + E86プロデューサー細胞株の1.0×10 6、30を可能にします0日目で2コンフルエント150 mmプレートにプロデューサー細胞株。 <ol><li> 5％フェタチーズウシ血清、及びマイコプラズマ汚染を避けるために、シプロフロキサシン（10μg/ ml）を含む完全組織培養培地中で培養レトロウイルスプロデューサー細胞株。 注：シプロフロキサシンの使用を中止するときgeneratinグラム骨髄形質導入のためのウイルス上清。これは負の骨髄形質導入効率に影響を与えるように、プロデューサー細胞株の過剰成長は避けてください。 </li></ol></li></ol> 5-フルオロウラシル（5-FU）（3日目）4.注入するドナーマウス<ol><li>必要な5-FUの量を決定するために - （12週齢5）ドナーマウスを秤量します。低骨髄収率の年齢結果の5週間よりも若いマウスを用いました。単一のTCRの発現を確実にするために、このようなSCID、RAGまたは骨髄ドナーとしてTCRアルファ欠損マウスなどのT細胞欠損マウス系統を使用します。 </li><li>組織培養フード内で作業し、10ミリグラムmlのに十分な量-1体重のグラムあたり0.15 mgの5-FUを送達するための5-FUのワーキング溶液を作製するために、無菌PBSで5-FUのストックを希釈します。 </li><li> 37 G針で1mlシリンジを用いて、腹腔内に、ドナーマウスあたり体重のグラムあたり0.15 mgの5-FUを注入します。 注：起動し、調整するために、1つの受信者ごとに1ドナーマウスを使用しています細胞収量に応じてドナーマウスの数。骨髄前駆細胞の濃縮および単離のための5-FUの治療の代替方法は、ビレらに記載のように系統陽性細胞の負の選択です。 </li></ol> 5.骨髄抽出手順（0日目） <ol><li>骨の単離のために解剖ハサミとピンセットを取得します。メディアを準備50mlコニカルチューブ内の骨を収集するために（HBSSは5％FCS（体積/体積）を補いました）。氷上に培地を含有する50ミリリットルの円錐形をしてください。死を確認するために頸椎脱臼に続いてCO 2吸入によりマウスを安楽死させます。全く反射が検出されない保証するために、足をピンチ。 </li><li>エタノールまたはメタノールで手術部位や手術器具を滅菌します。最初に切断することにより骨盤ガードルの下に慎重に大腿骨、脛骨、上腕骨、および骨盤ガードルを削除します。バックダウン脛骨大腿骨に沿ってカットします。きれいな骨を得るために、ハサミやピンセットを使用して、すべての周囲の組織を削除します。キープHBSS + 5％（体積/体積）FBS中で水和骨。 </li><li>両者がそれぞれの骨をオフに終了カットすることを確認して、関節で切断することにより骨を区切ります。 HBSS + 5％（体積/体積）FBSを含む10 mlの注射器に取り付けた25ゲージの針を挿入します。圧力を適用し、50ミリリットルの円錐で70μmのストレーナ休憩を介してすべての骨髄をフラッシュします。 </li><li>定期的に、1ミリリットルまたは3ミリリットルシリンジからプランジャーを使用して、70ミクロンのフィルターを通して骨髄を押してください。 HBSS + 5％（体積/体積）FBSでストレーナーを洗浄します。これは、骨片と組織のない単一細胞懸濁液を確実にします。無菌フードの手順を実行することにより、無菌細胞を保管してください。 </li><li> 4℃で10分間、300×gで遠心分離した骨髄細胞。 </li></ol> 6.骨髄文化（0日目） <ol><li>デカントまたは培地を吸引し、50mlコニカルチューブ当たり1ミリリットル塩化アンモニウムベースの赤血球溶解バッファー（またはRBC溶解バッファー相当）で再懸濁細胞ペレット。室温で1分間インキュベートした後温度は、完全DMEM 10mlの20％（容量/容量）FBSを添加することにより、赤血球溶解緩衝液をクエンチしました。 </li><li> 4℃で10分間、300×gで遠心分離細胞。 </li><li>デカントまたは5ミリリットル完全DMEM 20％（体積/体積）FBSで吸引上清および再懸濁骨髄。ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞を数えます。 注：一般的な収率は約5であるべきである-マウスあたり10×10 6細胞;しかし、収量は、マウスの異なる系統間で異なることができます。 </li><li> IL-3（20gのミリリットル-1）を補充した完全DMEM 30ml中の150 mmのプレートあたり4×10 7細胞を、20％（体積/体積）の濃度でプレート骨髄細胞FBS、IL-6（50 Gミリリットル-1）およびSCF（50gのミリリットル-1）。 注：解凍したての-等分しサイトカインを使用してください。 2週間以上4℃で凍結させ、複数回解凍または保たれてきたサイトカインを使用しないでください。 </li><li> 5％CO 2で37℃で一晩骨髄（約24時間）インキュベートします。 </li></ol><ol><li> 18ミリリットルで150 mmのプレートあたりプレート3×10 6レトロウイルス産生細胞を完全DMEM 20％（体積/体積）FBS。 </li><li> 37℃で一晩レトロウイルスプロデューサー細胞をインキュベートします。 （ - 3ドナーマウスの約2）1500万骨髄細胞のための1つの150 mmのプレートを見込んでいます。 </li></ol> 8.レトロウイルス上清（1日目） <ol><li>翌日（約24時間後）、10-mlの注射器およびフィルタは0.45を使用して150 mmのプレートのから直接レトロウイルス上清を描画することにより（ステップ7で設定）プロデューサープレートからのレトロウイルス上清を収穫-μmシリンジフィルター。 </li><li>慎重に新鮮な完全DMEM 20％（体積/体積）FBSの18ミリリットルで削除されたレトロウイルス上清を交換してください。 </li><li> 、（G ml -1の20）IL-6（50グラムミリリットル-1）、MSCF（50グラムミリリットル-1）、ヘキサジメトリンブロミド（ポリブレン）（6＆をIL-3で濾過レトロウイルス上清を補完＃956; Gミリリットル-1）。 注：臭化ヘキサジメトリンは、レトロウイルス形質導入の有効性の低下を回避するために、2ヶ月ごとに新鮮されるべきです。 </li></ol> 9.骨髄収穫（1日目） <ol><li>ステップ8.3が完了した後、ステップ6.4から骨髄細胞を採取し、無菌の50ml試験管に、非付着細胞を含有する培地を移します。 </li><li>勢いよく10ミリリットルのPBSでプレートを洗浄し、ステップ9.1から50ミリリットルの円錐に集めます。必要に応じて、洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>遠心し、4℃で10分間、300×gで細胞、上清をデカント、小容量で再懸濁細胞（1〜3ミリリットル）完全DMEM 20％（体積/体積）FBS、およびカウントされます。サイトカインおよびヘキサジメトリンブロマイドを含むレトロウイルス上清の1ミリリットル当たり1×10 6個の細胞で、0日目に再懸濁し、骨髄から75％回復- 50を期待しています。 </li></ol> 10.骨髄形質導入（1日目） <ol><li>レトロウイルス上清/骨ミリアンペアのプレート6ウェル組織培養プレート中にウェルあたり3 mlの容量でrrow混合物。ステップ10.2での遠心分離中のガス交換を最小限にするためにラップでプレートを包みます。 </li><li> 60分、37℃、1000×gで包まれた6ウェルプレートスピン。 </li><li>スピンが完了した後、ラップを除去し、24時間、37℃のCO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol> 11.レトロウイルス上清および形質導入（2日目） <ol><li> 24時間後、ウイル​​スプロデューサー細胞株からの新鮮なウイルス上清を収集します。 10-mlシリンジおよび0.45μmのシリンジフィルターを使用してレトロウイルス上清をフィルタリングします。 IL-3（20 gでミリリットル-1）、IL-6（50 gでミリリットル-1）およびSCF（50 gでミリリットル-1）および臭化ヘキサジメトリン（6グラムミリリットル-1）でろ過レトロウイルス上清を補います。 </li><li>次に、注意深くピペットで除去または骨髄細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルからのメディアのトップ2ミリリットル吸引。 注：作業は慎重に、通常、ウェルの中央に集中している骨髄を、吸引しません。あるいは、上清を除去したが、任意の失われた骨髄細胞を回収するためにスピンダウンすることができます。 </li><li>骨髄6ウェルプレートの各に十分にはサイトカインおよびヘキサジメトリンブロマイドを含む新鮮なウイルス上清の3ミリリットルを追加します。プラスチックでプレートを包み、60分、37℃、1000×gでスピン伝達を繰り返します。プレートをアンラップし、37℃、5％CO 2で一晩（約24時間）で細胞をインキュベートします。 </li></ol>フレッシュ補充したDMEM（3日目）の12追加<ol><li> 24時間後、工程11.2と同様に、骨髄細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルからのメディアのトップ2ミリリットル取り除きます。 （グラムml -1の50）、IL-3の最終濃度で補充し、新鮮なDMEM 20％（体積/体積）FBSを（20グラムミリリットル-1）を削除したメディアを交換して、IL-6（50グラムミリリットル-1）とSCF 。 </li><li>骨髄をインキュベートさらに24時間、37℃のCO 2インキュベーターでプレート。 </li></ol> 13.収穫形質導入骨髄（4日目） <ol><li> 24時間後、6ウェルプレートからの骨髄細胞を収集します。すべての非接着細胞を除去するためにPBSと激しくプレートを洗ってください。 <ol><li> 4℃で10分間、300×gで細胞を遠心分離し、上清をデカントします。 </li><li> PBS + 0.5％（体積/体積）の少量（1ml）中の骨髄熱不活性化FBSを再懸濁します。細胞を氷上に保管してください。 </li></ol></li><li>各骨髄条件の10μlのサンプルを取り、ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 1と仮定すると-受信者ごとに2ドナーを、収率がレシピエントマウスあたり少なくとも4×10 6個の細胞を転送するのに十分であろう。マウスあたり300μlの - 200を注入するために、PBS + 0.5％（容量/容量）熱不活性化FBSのに十分な量で骨髄を再懸濁します。 <ol><li>形質導入効率で、少なくとも2×10 6個の細胞を注入し25％の静脈内投与マウスあたり（8×10 6個の細胞まで注入することができます）。 注：私たちは日常的に骨髄細胞の2つの6ウェルプレートあたり5レシピエントマウスを注入します。収率は実質的に低い場合には、十分な骨髄数が得られるまで、より多くのドナーマウスを使用すべきです。最適な再構成を達成するために、少なくとも5×10 5の形質導入（蛍光陽性）各受信者に注入されるべきです。 </li></ol></li><li>マイクロピペットを用いて、各骨髄条件の10μlのサンプルを採取し、蛍光マーカー（ 図1A）11の発現に基づいて、フローサイトメトリーにより形質導入効率を分析します。 注意：一般的に、蛍光陽性細胞のパーセンテージは、構築物およびレトロウイルスの力価に応じて、25％と70％の間です。サブ致死的照射マウスは形質導入効率に応じて変えることができる再構成するために必要な形質導入骨髄細胞の数。 TRAN下逆にsduction効率、必要以上の骨髄細胞と、骨髄形質導入効率が高い、再構成のために必要な細胞数が少ないです。 25％以下の導入効率は準最適であり、不十分な再構成および生存をもたらすことができます。最適な骨髄の回復及び形質導入効率を確保するために、新たに調製した組織培養培地およびサイトカインを使用します。 retrogenicシステムを活用した新たなTCRを発現させる場合、 生体内でのそのTCRの選択は不明です。各個々のTCRの親和性に依存して、胸腺および末梢T細胞発現におけるTCRの選択17を変化します。 </li></ol> 14.マウスの照射、骨髄注入とケア<ol><li>骨髄注入（ステップ13と同じ日）の前日、マウスを照射します。 scidマウス、300ラド）; - / -マウス、500ラドRAG1 C57BL / 6マウス（および他の野生型株）、900ラド：以下の用量を使用してください。 <ol><li>アモキシシリンに置きレシピエントマウス（50mg / kg /日）または照射前の別の抗生物質、水処理、および骨髄注射の後の最初の2週間は抗生物質を続けます。 注：最適な照射量は、経験的に決定されなければなりません。 </li></ol></li><li>注射のために、すぐに注射する前に、ブラント針を使用して、1-mlの注射器にステップ13.1から細胞をロードし、その後、空気塞栓症を避けるために、任意の空気を追い出す、注射のために27ゲージに針を変更します。熱マウス加熱ランプ下で静脈内にマウス当たり骨髄の0.2ミリリットルを注入。 注：細胞は、時間の任意の長さのために、注射器に座ってさせてはいけないか、細胞が沈降します。 </li><li>彼らは健康を維持することを確実にするために、毎週マウスを監視します。 </li><li> 5の後- 6週間、GFP + /アメトリン+とTCRの共発現（ 図1B）11に基づいて再構成をチェックするために、マウスを出血。 </li></ol>

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利害の衝突が宣言されていません。

最適な骨髄健康、導入効率および再構成を確保するためのプロトコルでは、我々の詳細のいくつかの重要なステップ。最初の重要なステップが発生し、GP + E86ウイルス産生細胞の適切なメンテナンスです。使用初期継代のプロデューサー細胞株、使用前に80％の密集度以下に維持します。 48時間 - 新鮮GP + E86ウイルスプロデューサー細胞を作製すると、293T細胞は、継代早期および24のために文?...

ヒトおよびマウスのT細胞受容体（TCR）のレパートリーは、1×10 8および2×10 6個のユニークなTCRをそれぞれ1,2と推定されています。この大きな多様性は、T細胞が自己ペプチドから、ならびに抗原提示細胞（APC）上の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）により提示される病原体由来の抗原エピトープの広大な配列を認識することができます。ユニークなペプチド - MHC複合体とTCRの相互作用の微妙な違いは、T細胞がアポトーシス、アネルギー、活性化、分化、サイトカイン産生や細胞毒性を受けるかどうかを決定します。しかし、大規模なTCRレパートリーに、特定のTCRは、特定の抗原に反応するかの分析は、単一のTCRのシステムを使用する必要があります。 様々なTCRトランスジェニックマウスは、in vivoモデル3-9で単一のTCRの機能を研究するために生成されています。しかし、を含むトランスジェニックマウスをTCRする注意点がありますコスト、単一のトランスジェニックマウスおよび生殖細胞系列DNA 10にランダムな導入遺伝子挿入のいわゆる創始者効果を生成するための時間の長さ。そのため、比較的少数のTCRトランスジェニックマウスは、任意の所与の抗原に対して生成されており、同じエピトープのための高および低TCRの親和性の機能的な意味はほとんど対処されていません。画面への迅速なアプローチの必要性に対処し、個別にまたは組み合わせて、複数のTCRを研究するために、retrogenic（レトロウイルスから「レトロ」およびトランスジェニックから「ジェニック」）マウスは、トランスジェニックマウス11-13を TCRするための代替として利用されてきました。 いくつかのウイルスの中に見つかった2Aペプチドのコンセンサスモチーフは、切断は2Aのグリシンおよび2Bのプロリンとの間で発生する、2A-ASP-ヴァル/イルGLUT-X-ASN-プロのGly-2B-プロで構成されシス -acting加水分解酵素活性から、翻訳10,14-16間にリボソームスキップが生じます。 Cを描いた詳細図については様々な2Aペプチド（F2A、E2A、T2AとP2A）のleavage参照10を参照してください - このように12、2シストロン（TCRαおよびTCRベータ）は、単一のベクター中の化学量論的な翻訳結果としてリンクすることができます。このアプローチを利用して、我々が発現し、in vivoで直接複数の抗原特異的TCRを比較することができます。

<table><tbody><tr><td>DMEM, high glucose + glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Dulbecco&#039;s Modification of Eagle&#039;s Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &amp;amp; sodium pyruvate</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;#181;m syringe filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>Sterile Filtered in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracil (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM nonessential Amino Acids</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm tissue culture dishes</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Tisue culture-treated 6-well flat plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;#181;m nylon cell strainers</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;PHC0063</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stem Cell Factor</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

retroviral transduction of bone marrow progenitor cells to generate t-cell receptor retrogenic mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

骨髄代表骨髄伝達図（ 図1A）で尾静脈を静脈内に注入される前に、骨髄の形質導入効率を収穫骨髄の約10μLの100-μlに添加し、プロトコルのステップ13.3において確認されますPBSおよびアメトリン発現について分析しました。一般に、蛍光陽性細胞のパーセンテージは、構築物およびレトロウイルスの力価に応じて、25％と70％の間です。 6週間後、骨髄注射?...

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Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K ビュー.  Baylor College of Medicine. We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

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Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

骨髄増殖性腫瘍の形質導入 - 移植マウスモデル

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

がん研究

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

免疫・感染学

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B細胞の組換えレトロウイルスの生産と感染症

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

生物学

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide further insight on cell function. B-1a cells are a unique B cell subset in mice that produce protective natural IgM antibodies against oxidation-specific epitopes that arise during health and disease. B-1a cell IgM production differs depending on B-1a cell location, and therefore it becomes useful from a therapeutic standpoint to target B-1a localization to niches supportive of high antibody production. Here we describe a method to target B-1a cell migration to the bone marrow by retroviral-mediated overexpression of the C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4). Gene induction in primary murine B cells can be challenging and typically yields low transfection efficiencies of 10-20% depending on technique. Here we demonstrate that retroviral transduction of primary murine B-1a cells results in 30-40% transduction efficiency. This method utilizes adoptive cell transfer of transduced B-1a cells into B cell-deficient recipient mice so that donor B-1a cell migration and localization can be visualized. This protocol can be modified for other retroviral constructs and can be used in diverse functional assays post-adoptive transfer, including analysis of donor cell or host cell phenotype and function, or analysis of soluble factors secreted post B-1a cell transfer. The use of distinct donor and recipient mice differentiated by CD45.1 and CD45.2 allotype and the presence of a GFP reporter within the retroviral plasmid could also enable detection of donor cells in other, immune-sufficient mouse models containing endogenous B cell populations.

Here we describe a method for retroviral overexpression and adoptive transfer of murine B-1a cells to examine in vivo B-1a cell migration and localization. This protocol can be extended for diverse downstream functional assays including quantification of donor B-1a cell localization or analysis of donor cell-derived secreted factors post-adoptive transfer.

マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...