Yazarlar Pittsburgh, Sağlık ödülü K01 AR062598 National Institutes ve hibe P30 DE030740 Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi mali destek kabul. Yazarlar ayrıca ImageJ makro ImageJ ve Michael Cammer geliştirmek için ICUE1 plazmid Dr. Jin Zhang, Wayne Rasband teşekkür ederim.

The authors have no conflicts to declare.

Bu çalışma FRET görüntüleme 3D hidrojeller hücresel sinyalizasyon analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Önceki çalışmalar hidrojeller 38 ile hücre dışı etkileşim, hidrojel yüzeylerde 35-37 numaralı seribaşı hücrelerin FRET görüntüleme gösterdi ve hidrojeller 39-41 sıkışıp moleküllerin iken, bu içinde gömülü hücrelerin FRET görüntüleme bazlı hücre içi analiz tanımlamak için ilk yayındır 3D hidrojeller. 3D 2D FRET görüntüleme çeviri yaparken iş birkaç uygulama sorunları çözer. İlk olarak, yüksek sayısal açıklık hedefleri yeterli emisyon sinyalini toplamak için FRET görüntüleme için gerekli, ama onlar alan derinliği sınırlamak vardır. Burada hücreler biraz bunu telafi etmek için cam yakınındaki bir odak düzlemi hücre sayısını arttırmak için santrifüjleme ile yerleşmeye izin verilir. İkinci olarak, 3D hidrojel iskeleleri analizi komplike görüntüleme sırasında görüş alanı boyunca kayabilir. hidrojeller Burada CoV bağlandıklarıerslip bu deney boyunca sabit olarak kalacak şekilde. hidrojeller hücre görselleştirme engelleyebilir çünkü 3D FRET için uygun hidrojel bileşimlerinin Üçüncüsü, seçim esastır. PC-jel ve TR-jel burada şeffaf hidrojeller kullanılmaktadır. Bununla birlikte, lamel civarındaki bir odak düzlemine santrifüj ile hücreler toplama hidrojel diffraction.The seçimi hidrojeller 42 üzerinde bir inceleme bulunabilir simüle edilmelidir mikro-koşullara bağlıdır daha yüksek olan hidrojeller görüntü hücreleri için kullanılabilir . Dördüncü olarak, alternatif bir hesaplama tek zincirli ICUE1 prob FRET oranı (yani, D QE = QE / cAem) analiz için gerekli resim kanal sayısını en aza indirmek için ve böylelikle photobleaching en aza indirmek için kullanılır. Hücre başına ortalama FRET oranı gerçek FRET oranının küçümsenmesi en aza indirmek için bir hücre içinde piksel başına oranlarının ortalaması olarak hesaplanır. Son olarak, bir lineer oranlı metrik analiz ve araçlartek zincirli bir ikili probları aktif fraksiyonu hesaplamak için tarif edilmektedir. Widefield mikroskopi kullanılarak başarılı FRET deneyler yürüten birçok kritik yönleri vardır. donanım açısından, kamera yeni bilimsel CMOS kamera ve geleneksel CCD daha uygundur elektron çarparak CCD bırakarak, küçük sinyal değişiklikleri gidermek için yeterli duyarlı olmalıdır. en iyi FRET oranı mekansal dağılımını analiz etmek için, kamera en az iki kez objektif (Nyquist kriteri) noktası yayıldı fonksiyonu uzaysal çözünürlüğü sahip olması gerekir. Bu göreve çift görüntüleme sistemleri daha az uygun hale getirir. Daha önemli fluorophores photobleaching en aza indirecek şekilde verilen FRET çifti için uygun bir pozlama ve görüntü elde etme oranını seçmektir. Bir azalmış alım hızı deneme süresi arttıkça tavsiye edilir. Hızlı filtre çarklarını kullanılması edinme oranı ve analiz ederken kaçının için FOVs sayısını artırırÇift görünümü ve taret filtre küpleri ile görüntü kaydı sorunlarını ing. Homojen olmayan aydınlatma alanı örnek otofloresansı ve kamera sistemi gürültü doğar eşiğe için düzeltme zorlaştırmaktadır. Bazı hidrojeller özellikle kollajen proteinleri ihtiva eden 43,44 derece otofloresan bulunmaktadır. FRET oranları arka plan düzeltme olmadan ihmal edilir. Burada sık sık görüntü (Şekil 3B, Adım 7.2) merkezi üzerinde epi-floresan aydınlatma ile konfigüre edilebilir nispeten düz aydınlatma alanında dayanan basit bir arka plan düzeltme yöntemi kullanır. Bu yöntem, bu nedenle bu aydınlatma alanında kişilerce ilgi hücreleri kısıtlar. Burada anlatılan arka plan düzeltme ikili sonda okumak dalga boylarında hücresel otofloresans için hesaba katmaz. Böyle bir durumda, etiketlenmemiş hücreleri (prob transfeksiyon) çıkartılır, aynı koşullar ve arka plan altında görüntülü olmalıdır. A metiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücrelerden IX kullanılabilir ve etiketlenmemiş hücreleri arka plan ROI için seçildi. tüm görüntü alanı üzerinde hücre analizi sağlamak Alternatif yöntemler hücreleri olmadan bir gölgeleme maskesi kullanımı, birden fazla arka plan ROI&#39;leri, ya da aynı örneklerini ve bir protokol istek üzerine mevcuttur. 3D FRET görüntülemeye özgü prob yanıt analit (Şekil 6) hidrojel geçirgenliği son derece duyarlıdır. Bu nedenle, aynı hidrojel bölgeleri tercihen geometrisi simetri noktasında Burada kullanılan şekilde iskele merkezi olarak, deneysel tedavi boyunca karşılaştırılır. Seçenek olarak ise, mikro-akışkan odalar / biyoreaktörler hızlı ve homojen bir analit çözelti 45 ile hidrojel perfüze edilmesi için kullanılabilir. Bir FRET sinyal hidrojelin otofloresans çok yüksek olduğunda (sinyal gürültü oranı çok düşük olduğu) tespit edilemeyebilir; Daha ince bir hidrojel veya farklı prob (farklı flüorofor) kullanılmalıdır.photocrosslinked hidrojellerin 3D FRET görüntüleme ile ilgili olarak, asgari ışınlama maruz kalma ve sonda fluorophores uyarma spektrumları dışında dalga boylarının kullanılması tavsiye edilir. LAP başka potansiyel hücresel hasara 31,46 en aza indirmek için 405 nm&#39;de bir görülebilir ışık kaynağı ile birlikte kullanılabilir. Bu sonda beyazlatma minimize Ancak, 365 nm radyasyon ile kullanarak LAP tavsiye edilir. zirve uyarma yatıyor nm 405 ise 365 nm, CFP donör uyarma spektrumunun kuyruk sonunda yatıyor. Seçenek olarak ise, prob sentezleme bir gün kurtarmak için izin verilebilir. İkili sondaların kullanılmasıyla ifade seviyeleri ve verici ve alıcı florofor moleküler difüzyon farklılık- larına karşı duyarlılığın sorunlarını en aza indirir. İkili-olmayan problar kullanılır, ancak SE yerine eksitasyon ve emisyon spektrumları spektral akmalarını için QE görüntüleme ve ek düzeltme ile (aşağı bakınız) olabilir. Ayrıca, düşük ticari kullanılabilirlik ve FRET probları tasarımı karmaşıklığıbir engel olabilir. Başarılı deneyler için en kritik faktör floresan sinyalleri doğru düzeltme ve analiz kalır. FRET oranı Alternatif bir hesaplama ışıkla ağartma minimize yanında birkaç ek nedenlerle kullanılır. Ikili tek zincirli probları için, sık bildirilen oran donör uyarma (söndürüldü emisyon, QE), yani altında donör emisyonuna donör uyarma (duyarlı emisyon, SE) altında alıcı emisyonu, oranı = SE / QE 25,47,48 FRET. SE / QE FRET verimliliği 21,22,47 değişikliklere doğrusal olmayan görecelidir. Yani oran probu (Ei) doğasında FRET verimliliği katlanarak doğrusal olmayan bir ilişki vardır (Donius, AE, Táboas, JM yayınlanmamış çalışma. (2015)), daha az yaklaşık% 15 oranında daha Ei oran en lineer. SE / QE da aktive sondalar (FAP, yani analit bağlayıcı prob fraksiyonu) fraksiyonu hafife. therefoyeniden, SE / QE analizi hantal bir denge doz tepkisi çalışması ve eğri fit gerektirir. Neyse ki, alıcı uyarma altında alıcı emisyon SE veya QE oranları (AEM) yani Ei ve FAP, açısından doğrusal, FRET oranları SE / AEM ve QE / AEM. SE / AEM genellikle ikili problar için kullanılan ve yalnızca (prob aktivitesi ve tam prob aktivitesi) uç nokta kalibrasyon gerektirir, ancak bazal hücresel sinyal bu zor yapar. Son nokta kalibrasyon ihtiyacını ortadan kaldırmak için, SE donör ve alıcı uyarma ve emisyon spektrumları spektral örtüşme (spektral boşaltma yoluyla) ve kombine prob fluorophores ve mikroskop kuantum verimi ve spektral duyarlılık (QS) için (CSE) düzeltilebilir görüntüleme sistemi. CSE dayalı düzeltilmiş SE FRET oranı, yani bir görüntü, E SE = CSE / AEM her pikselin içinde prob gözlenen FRET verimliliği tanımlar. Ticari ve özgür yazılım bu etkilerin SE düzeltmek için kullanılabilir veokuyucu yöntemleri 50 ayrıntılı bir açıklama için Chen ve Periasamy 2006 çalışmaları denir. Ancak, E SE hesaplanması zaman noktası (SE, QE, AEM) başına üç resim kanallarının yakalama gerektirir. Sadece iki görüntü kanallarının yakalama (QE ve AEM) gerektirir QE / cAem, - Bu nedenle, bu çalışmada biz de alternatif bir FRET oranı E QE = 1 kullanır. Bu kanallardan E QE hesaplanması sadece QS (cAem = AEM QS x) için AEM düzeltme gerektirir. QS = Dem / AEM kolayca Dem alıcı ağartılmış ile donör uyarma altında donör emisyonu bir kalibrasyon numunesi, iki görüntüleri kullanarak tahmin edilmektedir. Herhangi bir anda FAP prob Ei E SE veya E QE karşılaştırılarak hesaplanabilir. Sonuçta, FRET oranı seçimi (E QE = QE / cAem vs E SE = CSE / AEM) prob Çeşidi değerlendirilmesi ve en iyi sinyal ile kanallarda dayanmalıdır. İkisizamanla otofloresansı değişikliklerin hesaba yukarıda tarif edildiği gibi yaklaşırsa kare başına görüntü arka plan gürültü düzeltme bulunmaktadır. Bunlar genellikle tasarım ve mikroskop filtre yapılandırmasını soruşturma nedeniyle durum Dem uyarma spektrumu içine AEM uyarma ışık hiçbir örtüşme varsayalım. Tek zincirli probları birini kullanabilirsiniz ve seçim kamera gürültü en iyi sonda sinyali (parlaklık) ve SE ve QE kanallarda arka plan sinyali dayanır. ICUE1 prob ve burada kullanılan deneysel koşullar (hücre ve hidrojel tipleri) için, SE QE daha güçlü bir sinyal var. Çift zincirli Probes dolayı verici ve alıcı florofor arasında eşit olmayan moleküler dağılımına e se kullanımını gerektirir. Gibi ICUE1 olarak analit bağlanması üzerine FRET azalma biz E SE = 1, burada olduğu gibi verim analit bağlanması üzerine olumlu bir sinyal değişikliği sunmak &quot;ters&quot; olabilir FRET problar için - CSE / AEM veya E QE = QE / (AEM QS x). th analizie FAP FRET oranlarının uygun bir düzeltme ve Ei tahmin duyarlıdır. Bu QS için kullanılan aynı kalibrasyon numunesi ve geleneksel bir bitiş noktası ile FRET tahmin edilebilir Ei = 1- (QE görüntü alıcı photobleaching ve Dem görüntü ardından) 28, ama dikkat edilmelidir (/ Dem QE) en aza indirmek için verim deneyi verici kazara ağartma. QS arındırılmış AEM göre Dem tahmini, ikame edilmiş bir modifiye edilmiş versiyonu tarif yani Ei = 1 - (QE / (AEM) qS x). Alternatif olarak, Ei = CSE / AEM kullanılabilir. canlı hücrelerde Ei Tahmini tüm sondalar tam FRET tahrik olmasını gerektirir. Bu analit bağlanması üzerine FRET azalma gibi ICUE1 olarak problar için pratikte elde etmek zordur. Hücre lizatları ve saflaştırılmış analit ile Ei bir in vitro bazlı hesaplama iyi olmakla birlikte, bu işin kapsamı dışındadır. Burada hücrelerde cAMP azaltmak için 2 &#39;, 5&#39;-dideoksiadenozin kullanmanızı öneririz. Ancak, göreceli FAP b olabilirE sinyalizasyon taban seviyesinden türetilmiş bir Ei tahmini kullanılarak hesaplanmıştır. Bu nedenlerle, çalışmalar en sık agonist eklemeden önce sinyal temel sinyalini doyurur ikinci agonist ekledikten sonra alt sınır ve sinyal olan uç nokta kalibrasyon dayalı FRET oranını (burada yapıldığı gibi) ya da bir akraba FAP üst olduğunu rapor bağlı. Forskolin genellikle cAMP sinyali doyurulması için bir kontrol agonist olarak kullanılır. Alternatif olarak, cAMP analogu kullanılabilir örneğin 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-siklik monofosfat olarak. deneysel tedaviler arasında sinyal yolundaki potansiyel değişiklikleri belirlemek için çalışmaların bitiminde kullanılan pozitif kontroller tavsiye edilir. hücre başına ortalama sinyal yanıtı hesaplanması çeşitli faktörlere göz önüne alınmasını gerektirir. İlk olarak, ortalama FRET oranı, bir hücre içinde, her pikselin oranlarının ortalaması olarak hesaplanmalıdır, yani, (Σ (QE/cAem)) / (piksel sayısı) yerine RABir hücrenin ortalama QE ve AEM, yani, (ΣQE) / (ΣcAem) arasında bölüm. arka plan gürültü düşük olduğu için ikinci dikkatli maskeleme gerektirmez rağmen, ciddi, gerçek ortalama FRET oranını göz ardı ediyor. Ancak, piksel oranları kayan nokta hesaplama ve İB&#39;leri tanımlamak ve hücre dışına arka plan gürültü üretilen sahte oranları dahil önlemek için hücre alanının dikkatli ikili maskeleme gerektirir. Tüm hücre alanı hücre şekline öngerilme sonuçları önlemek için ölçülebilir olmalıdır. maskeleme hücre şekli ve göç değişikliklere bağlı olarak zamanla yeniden gerekebilir. dışlama kriterleri QE ve hücresel seviyelerinin altına düşmesi ve yakın plan düzeyleri AEM sinyallerden piksel oranlarını kaldırmak için tanımlanan Alternatif olarak, hücrenin daha ROI büyük kullanılabilir. açıklanan analiz yöntemleri ayrıntılı özel yazılım / eklentileri olmadan FRET analizi için bu çalışmada kullanılan temel adımlar. Mikroskop üreticileri ve diğer satıcılar add-on modülü satmakOtomatik oranlı metrik destekleyen ve analiz FRET onların mikroskop yazılımı için s. Aynı şekilde, kamu malı ImageJ yazılım gibi RiFRET olarak parçacık ve FRET analizi için kullanılabilecek birkaç eklentileri vardır. Bir 2D görüntü kullanıldığı için İkincisi, piksel tabanlı ortalama FRET oranı 3D hücresel yapının gerçek ortalama oranını göz ardı ediyor. 2D sinyalleri temsil eden ve Z ekseni boyunca ortalama. Canlı hücrelerde FRET oranlarının 3D mekansal dağılımı hesaplanması yüksek hızlı 3D görüntüleme olmadan mümkün değildir (örn., Kullanarak disk konfokal mikroskopi iplik). Bu 2D ve 3D kültürleri hem de bir sorun, ancak uçağın dışında var olan hücresel yapının daha fazlası gibi 3D büyük bir etkiye sahiptir. Bu tür plazma zarı EPAC1 prob PM-ICUE gibi hücresel yapılar, lokalize problar için büyük bir endişe kaynağıdır. Spiering et al. 2013 önerileri oranı hesaplamaları 24 hücre kalınlığı etkileri düzeltmek için. AEM dağılımının analizi için kullanılabilirSonda ayarlanmış hücre ve görüntüleme uçağın bölgelerinde birikir algılamak. Bu aynı zamanda, FRET oranlarının dağılımını yorumlamak ve sahte sonuçlarını ortadan kaldırmak için yardımcı olacaktır, örneğin., (Düşük AEM bölge düşük prob konsantrasyonuna sahip olacak ve prob doygunluk ve yüksek FRET oranını gösterebilir yani) prob doygunluğu belirlenmesi. Üçüncü olarak, farklı bir FRET bazal seviyeleri, Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık gösterir Deney grupları arasında ifade veya bazal sinyal prob olabilir. &quot;Bağıl Analizi&quot; (Adım 10.1.1) varsa zamanla FRET oranında sürüklenme temizlenmesine yardımcı olur. Bu örnekler arasındaki tepkilerin nispi büyüklük karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ancak referans numunesi için tepki (kontrol arsa düz bir çizgidir) zaman-ders karşılaştırma engellemektedir. &quot;Mutlak Analizi&quot; (Adım 10.1.2) örneklerin arasında yanıtın oranı karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ama her satırı bir dissim tarafından ölçekli çünkü yanıtın büyüklüğü karşılaştırılmasını engellemektedirIlar sabiti. Çalışmalar genellikle zaman içinde FRET oranında sürüklenme düzeltmek için başlangıçtaki bir lineer regresyon kullanın. tarif 3D FRET yöntemi imal ve diğer prob ve görüntüleme yöntemleri uygulanabilir hücre yüklü 3D hidrojeller, zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için yararlı ve pratik yoludur. yukarıda tartışıldığı gibi tek zincirli ikili sondalar yanında diğer FRET sistemi, yoğunluk tabanlı sinyallerin daha karmaşık düzeltme yapılması gerekir. Alternatif olarak, FRET (FLIM-FRET) floresans süresi görüntüleme sensörü verici emisyon ömrü bir değişiklik ile FRET verimliliği hesaplamak için kullanılabilir. Yoğunluk tabanlı FRET aksine, Flim-FRET arka plan gürültüsü, spektral kanaması-through, kuantum verimliliği ve dedektör spektral duyarlılık 2 duyarsız. Ancak, Flim sistemler, pahalı, karmaşık ve nadir olan ve tek üs çürüme ile fluorophores ve hiçbir Flim 49 run-off ile iyi çalışır. tarif edilen yöntem aynı zamanda mo ile kullanılabilecektirgelişmiş mikroskop platformları yeniden (örn., FRET TIRF, floresan anizotropi ve spektral korelasyon FRET). yüksek hızlı konfokal ve multiphoton mikroskobu ile 3D görüntüleme için bu yöntemi uygulamak sinyal yanıt alt hücresel dağılımı analizi kolaylaştırmak ve analiz sinyal doğruluğunu artıracaktır. Bu 3D FRET yöntemi simüle 3D hücresel mikroçevrelerde gelişmiş hücre biyolojisi çalışmaları sağlayacaktır. Bu nedenle, hali hazırda, farmakoloji ve hücreler arası sinyal okuyan ve lamine hidrojel bazlı microtissues ilaç tepkisi tarama içeren rejeneratif tıp ihtiyaçlarına uygulanabilir.

Hücresel sinyal karmaşık ve farmakoloji, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp gibi bir çok alana ilişkin netice hem de. Faydalı araştırma araçları hücre biyolojisi anlayışımızı ilerletmek için ve doku rejenerasyonu için optimal malzemeler geliştirmek için gereklidir. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme reseptör aktivasyonu, moleküler yapısındaki ve canlı hücrelerde supramoleküler etkileşimler (örneğin., Protein / DNA kompleksi oluşması) analizi sağlayan önemli bir araçtır. FRET floroforlar 1 ila radyatif olmayan enerji transferi türüdür. Bir verici florofor ve alıcı florofor arasındaki mesafenin altıncı gücüne ters orantılı olan bir verimliliğe sahiptir. (- 10 nm tipik olarak 1) 2 Bu nedenle, nanometre ölçeğinde iki farklı moleküller arasındaki ya da bir molekülün bölgeler arasında mekansal mesafe hakkında bilgi verebilir. donör ve alıcı fluorophores farklı m olabilirolecule türleri donör yüksek enerji emisyonu (kısa dalga boyu) sahip olduğu (hetero-FRET), ya da aynı tip (homo-FRET). FRET Görüntüleme sabit veya canlı hücreler üzerinde yapılabilir, ancak yüksek hızlı konfokal sistemleri kullanılamaz olduğunda genel olarak sabit hücreler yüksek uzaysal çözünürlükte moleküler etkileşimlerin görüntüleme için kullanılır. Canlı hücreler tepki 3 sinyalizasyon gerçek zamanlı hücre içi olarak inhibe veya fiksasyon değişmiş etkileşimleri ve süreçleri incelemek için kullanılır. istihdam Canlı hücre çalışmaları nedeniyle sadelik ve alt arka plan (düzlem hücre dışına hiçbir emisyon) bir parçası görüntüleme kullanacağım iki boyutlu (2D) hücresel kültürleri FRET. Bununla birlikte, 2B kültürleri de fizyolojik mikro ve üç boyutlu (3D) kültür 4,5 kıyasla birçok hücresel prosesleri değiştirebilir. Örneğin, hücre dışı matris etkileşimlerine hücre ve hücre yerli hücre ölçüde EAS giden 2B kültür içinde değiştirilirily hücre morfolojisi ve polarite 6 değişiklikleri gözlemledi. Bu iskelet parçaları 7,8 ve hücre şekli ve hücre iskeleti yapısı güçlü mekansal kültür ortamında 9 düzenlenir bağlamak için membran mikro (örn., Kaveolanın ve lipid sallar) ve reseptör sinyal kuvvetli kısmen kültür ortamı tarafından düzenlenir. Mechanotransduction sadece 3D matriks tarafından etkilenmiş, ancak daha karmaşık ikincil yükleme koşulları 2D kültürleri 10 oranla 3D ortamlarda doğurduğu değildir. Son olarak, 3D matrislerin geçirgenliği difüzyon azalmış ve 2B kültürlerine kıyasla sinyal molekülleri hücrenin artan bağlama ile, genel olarak, kültür ortamı daha azdır. 3D kültürlerle bir yapıştırıcı, kimyasal ve mekanik ipuçları ile ilgili fizyolojik daha benzer bir mikro oluşturmak ve gözlemlemek mümkün değildir. Hücre etkileşimleri hücre teşvik edilebilir ve yapışkan özellikleri W kontrol edilebilir3D malzemenin 11-13 yapısı, kompozisyonu ve mimari (desenleme) i. Malzemenin mekanik özellikleri de aynı şekilde, bileşim ve yapı 14,15 ile ayarlanabilir. Hidrojeller hücreleri Kültürleme bu nedenle izin aksi de-ayırt etme olur birincil hücre veya konvansiyonel teknikler kullanılarak fenotip değişim, örneğin üzerine çalışmalar FRET., Eklem kıkırdağının hücreleri. Bu durumda, bir yöntem olup, canlı 3D kültürlerde FRET tahlilleri sağlamak için gereklidir. Onlar optik şeffaf ve mikro kontrol etmek ve hücresel ipuçları sağlamak için uygun olabilir çünkü hidrojel iskeleleri 3D FRET tabanlı çalışmalar için idealdir. Doğal polimerlerden yapılan Hidrojeller jelatin ve fibrin 16 de dahil olmak üzere on, hücre kültürü kullanılmıştır. Hücresel mikro üzerinde daha fazla kontrole Bu polimerlerin kimyasal değişiklik ile ve sentetik polimerler 17,18 kullanımı ile elde edilebilir. hydrMekanik sertliği Ögel ve geçirgenlik polimerik bileşiminin değiştirilmesi ile kontrol edilebilir ve boyut (polimer ve çapraz bağlama yoğunluğunu) 19,20 örgü. Bundan başka, hidrojeller, büyüme faktörleri ve hücre ligandlann eklenmesi vasıtasıyla biyoaktif yapılabilir. Çünkü bu olasılıklar, biosensörleme, ilaç dağıtım ve doku mühendisliği uygulamaları için hidrojellerin geliştirme araştırma 21 çok aktif bir alandır. Hidrojellerin 3D baskı da mikro-dokuların imalatı için geliştirme çalışmaları ve 15 -organs edilir. Bu nedenle, hidrojeller hücrelerin FRET görüntüleme fizyolojik hücre davranışını tahmin etmek için bir araç olarak yararlı, aynı zamanda çalışma ve mühendislik doku büyümesini optimize etmek için, bir araç olarak değil sadece. İkili rasyometrik FRET probları sinyal iletimine eğitim çok yararlıdır ve hidrojel kültürlerde kullanılabilir. yayınlanan floresan kısmi listesi ve sondalar FRET, Hücre Göç Consortium web sitesine bakın <sup&gt; 22. En yaygın prob tipi bir tanıma eleman (lar) (analit hassas bölge) ile ilişkili veya bağlantılı iki farklı flüorofor içerir. Bu bölgeler fluorophores ve bu nedenle FRET büyüklük (ya daha yüksek ya da daha düşük) arasındaki mesafeyi değiştirir (bir iyon veya molekül bölgenin enzimatik bölünme bağlanması, örn.) Analitin saptanması üzerine bir yapısal değişim, ilişkiyi, ve ayrılmayı geçmesi 23. Daha az yaygın ama kullanışlı prob tipi FRET büyüklüğünü değiştirir iki fluorophores spektral örtüşme, bir analit duyarlı değişim dayanır. &quot;Tek zincirli&quot; rasyometrik problar tek bir molekül üzerinde bağlanmış bir flüorofor çifti kullanmaktadır. &quot;Çift zincirli&quot; Problar farklı moleküller üzerinde florofor çiftleri kullanan, ancak sentezleme aynı ekspresyon kaseti 24&#39;e bağlanabilir. Tek fluorofor ifade ile çalışmalar (örn., Floresan füzyon proteinleri), çalışmalar oranlı metrik aksineFRET Probes transfeksiyon verimliliği ya da hücre canlılığında kontrol etmek için, çift transfeksiyon gerektirmez. Asgari eşik (hassas konsantrasyon) 23,25 üzerinde sentezlendiğinde oranlı metrik FRET probları transfeksiyon verimi nispeten duyarsızdır. Onlar uyarım kaynağı dalgalanmaları ve diğer hücre içi çevre faktörleri (örn., PH, iyonlar) çok uzun hem fluorophores benzer duyarlı olarak duyarsızdır. Floresan ve biyolüminesens promotör-muhabir 26,27 yapıları aksine ek olarak, tepki, transkripsiyonel gecikmeye tabi değildir. Oranlı metrik FRET probları kolay ve sık sık geleneksel widefield Epifloresans mikroskop sistemleri kullanılmaktadır. Widefield mikroskoplar çünkü sistem maliyeti, fluorofor ağartma ve yeterli zamansal çözünürlüğe sahip sinyal değişikliklerinin yakalanması ilişkin endişelerin canlı hücre görüntüleme için çizgi tarama konfokal sistemleri tercih edilir. Buna ek olarak, tek bir hücre Analhücrelerin büyük bir nüfus üzerinde Salman kararı görünümünün birden alanlar üzerinde bir motorlu sahne ve görüntü yakalama ile mümkündür. Widefield mikroskopi hetero-FRET prob sinyallerinin yoğunluğu bazlı analizini gerektirir. Yoğunluk analizi diğer FRET yöntemler gibi karmaşık donanım gerektirmez rağmen, daha alım sonrası çalışma fluorofor davranışları ve mikroskop / görüntüleme sistemi konfigürasyonları 28 etkilerini düzeltmek için gereklidir. Bir florofor yakalanan emisyon yoğunluğu uyarım enerji fonksiyonu floroforu kuantum verimi ve kombine filtre ve kamera / detektör spektral duyarlılık ve doğrusallık 2&#39;dir. Bu verici ve alıcı için farklı olabilir ve kantitatif analiz için kalibrasyon gerektirir. Buna ek olarak, alıcı emisyonu görüntüleme (donör ikaz ışığı ile alıcısı uyarma ve kanama-through donör emisyonunun akseptör emisyon spektrumları içine) fluorophores spektral örtüşme etkilenir 2.4 Tek zincirli çift zincirli &quot;prob bir hücre 25,28 boyunca farklı stoichiometries var olabilir ise flüoroforların.&quot; &quot;Probları flüoroforlar ise, kendi flüoroforlar nano ekimolar, çünkü iç normalleştirilir&quot; tek zincir &quot; problar içindeki parlaklık (ekstinksiyon katsayısı ve kuantum verimi fonksiyonu), doğrusal olmayan, detektörün hassasiyetindeki etkileri eşiğe ve 23 gereklidir bağlanmış kuantum verimi / detektör duyarlılığı için küçük ve sadece düzeltilmesidir vardır. Bu nedenle &quot;tek zincirli&quot; oranlı metrik FRET probları en kolay widefield mikroskopi 24 uygulanmaktadır. Bu kağıt, geleneksel geniş açılı epifluorescent mikroskop kullanarak 3D hidrojel kültürlerde canlı hücrelerin FRET görüntüleme gerçekleştirmek için basit bir yöntem açıklanır. Kolayca zaten 2D FRET deneyler, hem de Inter ile ilgilenen laboratuarlar yürüten laboratuarları tarafından kabul edilebilirmicrotissues hücresel sinyal. Burada siklik adenozin monofosfat (cAMP) foto-çapraz içinde canlı kondrositlerde seviyeleri (PC-jel, polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive (TR-jel, Matrigel) hidrojellerinin arasında FRET görüntüleme göre ölçüm yöntemini göstermektedir. Bir rasyometrik FRET prob forskolin, cAMP ATP dönüşümünü katalize adenilat siklaz için bir kimyasal agonist yanıt olarak cAMP seviyelerini tespit etmek için EPAC1 (ICUE1) göre kullanılmaktadır. cAMP G-protein kenetli reseptör sinyalini aracılık başlıca ikinci haberciler biridir ve doğrudan cAMP (EPACs) tarafından aktive aşağı değişim proteinleri dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin, aktive eder. flüoroforlar cAMP FRET bir azalma ile sonuçlanan EPAC alanına bağlanması üzerine birbirinden ayrılır. 3D hidrojeller hücre hidrojel malzemelerin hazırlanması, ICUE1 probuyla birlikte hücre transfeksiyon ve gömme burada açıklanmıştır. 3D FRET Deney prosedürü ve gerekli görüntü analizihücre başına sonda etkinliği açıklanmıştır değerlendirmek. Biz de widefield mikroskopi kullanılarak 2D ve 3D FRET analizi doğasında sınırlamaları tartışmak. Bir daha fizyolojik bağlamda analiz sağlar ve daha az görüntü düzeltme ve kalibrasyon gerektirmeyen beri burada sunulan teknik mevcut 2D yöntemleri üzerinde bir gelişmedir. Büyük yardımcı hücresi ve transfeksiyon tercihleri ​​korunabilir ise birçok şeffaf malzemeler kullanılabilir gerçeğinde yatar.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td><td>Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td><td>NC0162601</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td><td>Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440167</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Dimethyl Phenylphosphonite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC244280100</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2-Butanone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Lithium Bromide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Sigmacote (siliconizing reagent)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Toluene&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3025601</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Cellstripper (cell dissociation solution)</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Pipette Tips (10,200,1,000 &amp;mu;l)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Powder Free Examination Gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Biopsy punch (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Sterile vials (15 ml, 50 ml conical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Cell culture dish (6-well)</td><td>Falcon</td><td>351146</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Epifluorescent Microscope with motorized stage</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &amp;amp; wheel, Lambda emission filter system)</td><td>Nikon (Sutter Instrument reseller)</td><td>77016231, 77016088</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>CYF/YFP filter set</td><td>Nikon (Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu reseller)</td><td>77054076</td><td>Non-disposable lab-equipment</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td><td>Nikon</td><td>MQS31100&amp;nbsp;</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Prism (spreadsheet and graphing software)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Version 6</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&amp;lambda; = 365 or 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Pipette Aid&amp;nbsp;</td><td>Drummond Scientific Co.&amp;nbsp;</td><td>DP-100</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Vacuum desiccator chamber/degasser&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Chemical Fume Hood&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Any</td><td></td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Any</td><td></td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr></tbody></table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücre biyolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. FRET kullanan Çalışmalar genellikle üç boyutlu (3D) hücresel mikro taklit değil iki boyutlu (2D) kültür, istihdam. 3D hidrojel ortamında hücrelerin geleneksel widefield Epifloresans mikroskopi kullanılarak söndürüldü emisyon FRET görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmuştur. Burada sonda aktivasyon aralığında lineer oranlarını verir rasyometrik FRET prob için bir analiz yöntemi tarif edilmektedir. intraselüler siklik adenosin monofosfat (cAMP) seviyesi ölçümü, EPAC1 aktivasyonu (ICUE1) ve hidrojel malzeme tipi, bu tarifnamede, bir foto-çapraz hidrojel (PC jel bağımlı sinyal cAMP farklılıkları tespit etme yeteneği için bir sonda kullanılarak forskolin stimülasyon altında kondrositlerde gösterilmiştir polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive hidrojel (TR-jel). 2D FRET yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Bu yöntem çok az ek çalışma gerektirir. Zaten 2D FRET görüntüleme kullanan laboratuvarlar kolayca 3D mikro-hücresel çalışmalar yapmak için bu yöntemi kabul edebilirsiniz. Bundan başka, işlenmiş 3D microtissues yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama uygulanabilir. Buna ek olarak, bu tür anizotropi ölçümü ve floresans ömrü görüntüleme (FLIM) gibi ileri mikroskopi konfokal kullanarak platformlar, darbeli ya da modüle edilmiş aydınlatma ile FRET görüntülemenin diğer formları, uyumludur.

Tüm hidrojel ön hücreler, döküm kalıpları yukarıda tarif edildiği gibi hazırlandı. Hücre yüklü habercisi çözümleri PDMS kalıplara döküm ve sonra lamel yakın hücreleri hareketsiz ve üzülmek görüntüleme analizi (Şekil 1) kolaylaştırmak için foto-/ jelleşme önce santrifüj edildi. Ekli lamelleri ile hidrojellerin mikroskopik görüntüleme (Şekil 2) için hazırlanan PDMS görüntüleme kuyuları içinde yerleştirildi. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi optik konfigürasyonlar ve görüntü elde parametreler belirlenmiştir. İkili-olmayan problar için gerekli olduğu gibi CFP YFP fluorofor çiftleri için dört FRET ilgili görüntü kanallarının Yakalama, altında (bakınız &quot;Optik Conf.&quot; Şekil 3&#39;te) gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada sadece iki resim tek zincirli ikili ICUE1 prob, QE = &quot;CFP CFP&quot; ve AEM = &quot;YFP YFP&quot; (uyarma emisyon) için gereklidir. Çoklu FOVs (xy konumus) birçok hücre homojen aydınlatma alanı (Şekil 3B) içindeki ikamet ettiği seçilmiştir. zaman atlamalı kazanılmasından sonra, prob için sinyal veri ihraç edildi. ROI kanallı sinyallerin arka plan düzeltmesi ve hücre analizi için deney (Şekil 4) başlangıcından eşiklenir AEM görüntüleri kullanılarak tayin edildi. Hücreler ifade gibi hücre havuzu arasından seçildi yeterli (çok loş değil), ama çok yüksek değil (aşırı parlak) prob (Şekil 4B). Her edinilmesine piksel başına QE ve SE FRET oranları arka plan çıkarılır görüntü kanallarının floating-point bölümü kullanılarak hesaplandı. Hücre başına ortalama FRET oranı (yani, ROI başına) hesaplandı uyarım öncesinde bazal sinyaline normalize (yani, her zaman noktalarında çıkarılır bazal bir regresyon) ve standart hata olarak hata barları ile çizilen ortalama (SEM). QE ve CSE tabanlı FRET oranları de her ikisi deforskolin uyarılması (100 nM, Şekil 5) altındaki kondrositlerde artan cAMP aktivitesi korunmalıdır. QE sinyali nedeniyle hidrojellerin içinde gömülü kondrosit cAMP aktivitesi düşük bazal seviyeye düşük olduğundan QE FRET oranı CSE FRET oranından daha arka plan düzeltme daha duyarlı idi. Hem hidrojel türleri (TR-jel ve PC-jel) forskolin ilave bir artış, cAMP sinyal yanıtını gösteren zaman FRET oranında bir artış (Şekil 6), gösterdi. QE FRET oranı ile gösterildiği gibi, PC-jel hidrojeller kondrositlerin cAMP daha büyük bir değişiklik (gösterilmemiştir) ve cAMP (E QE daha yüksek bir taban seviyesini gösterir = E QE = TR-jel içinde 0.09 vs PC-jel içinde 0.19, ) temel çıkarılan resimde gösterildiği değil. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Şekil 1: Photocrosslinked Hidrojel (PC-jel) Hücre Dağılımı </strong&gt; A: Hücre yüklü hidrojel habercisi lamel yakın bir odak düzleminde hücrelerin sayısını arttırmak için santrifüj edildi. B: Bu FOV hücrelerin sayısını artırır ve düzlem hücrelerin üzerinden arka plan sinyalinin en aza indirir. (Ölçek çubuğu = 200 mikron) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Şekil 2: PDMS Bulaşık Hidrojel Hidrojel mikroskopik görüntülemesi ve analit uyarılması için bir lamel baz ile yüksek bir PDMS de (hidrojelin 10x hacim) içine yerleştirilmiştir. bu deneyde boyunca yerinde kalması için PC jel hidrojellerin şeffaf ve lamel bağlanmaktadır. PDMS ayrıca en ek olarak daha geniş bir biyopsi zımba kullanılarak hidrojel hacmi 10 kat daha fazla orta içeren daha büyük yapılabilmektedirhicker PDMS levha. (Ölçek çubuğu = 2 mm) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Şekil 3: FRET Görüntüleme için Edinme Yapılandırma A: iktisap birden çok yerde görüntü yakalamak için her 7 saniyede yapılandırıldı. QE FRET oranı hesaplamasına sadece iki görüntü kanalları altında burada kullanılan ICUE1 probu (ikili tek zincirli prob), QE = &quot;OBP OBP&quot; ve AEM = &quot;YFP YFP&quot; (uyarma emisyon) için gerekli olan &quot;Optik Conf.&quot; mikroskop yazılım λ sekmesinde sütun. B: FOVs ( &quot;XY&quot; pozisyonlar) birçok hücre homojen aydınlatma alanı içinde ikamet ettiği seçilmiştir. Resmin altındaki arsa mavi boyunca aydınlatma yoğunluğu hattını oklu gösterirBu FOV merkezi aracılığıyla erişir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Şekil 4: FRET Görüntüleme Analizi ROI Seçimi A: Hücrelerin serbest faiz (ROI) bir bölge her kanalda arka plan sinyali düzeltmek için seçildi. hücresiz hidrojel yerine bir resim hücre yoğunluğu veya geçiş yüksekse, ya da hücrelerin homojen bir aydınlatma alanı içinde yer olmadığında gölgelendirme maskesi kullanılmazsa geri çıkarma için de kullanılabilir. B: Hücre ROI görüntü eşikleme ve AEM kanalının ikili maskeleme kullanılarak seçildi. nedeniyle arka plan n üretilen hücre dışı oranlarının eklenmesi nedeniyle olumsuz hücre başına ortalama FRET oranının hesaplanmasını etkileyecek hücrelerden daha büyük bir ROI seçmeoise. Bu oran hafife olarak, hücre başına her kanalın ortalama kullanarak selüler FRET oranının hesaplanması önerilmemektedir. (Ölçek çubuğu = 50 um) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Şekil 5: Thermoresponsive Hidrojel (TR-jel) içinde FRET Oranlarının Karşılaştırılması QE ve SE tabanlı FRET oranları Hem forskolin stimülasyon altında kondrositte artan cAMP aktivitesini algılar. Forskolin cAMP üretimini indükleyen bir adenil siklaz agonistidir. ICUE1 prob cAMP&#39;yi bağlandığında FRET azalır ve böylece QE FRET oranı (E QE = SQE / (SAEM QS x)) artar. Tersine, SE FRET oranı azalır ve böylece E SE = 1 olarak çizilir - CSE / SAEM. hidrojel gömülü kondrositlerde, QE FRET oranı düşüklüğü nedeniyle bazal cAMP etkinliği SE FRET oranından daha arka plan düzeltme QE sinyali düşük olduğundan daha duyarlıdır. Hata çubukları = SEM, n = 25 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Şekil 6: Farklı Hidrojeller içinde FRET Oranının Karşılaştırılması Her iki hidrojel tipler kondrositler zaman içinde artış QE FRET oranı gösterdiği gibi, cAMP aktivitesi bir artış ile forskolin uyarılmaya yanıt verdi. Hidrojel tipi etkiler forskolin ve bazal hücre cAMP aktivitesi geçirgenlik farklılıkları dahil olmak üzere çeşitli etkileri vasıtasıyla hücresel yanıtı (E QE = E QE vs PC-jel içinde 0.19 = 0.09, TR-jel içinde, gösterilmemiştir). Hata çubukları = SEM, n TR-jel= 25, n PC-jel = 15. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels at JoVE.com

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı hücre biyolojisi çalışmaları için güçlü bir araçtır. Burada alışılmış epifloresans mikroskopi kullanılarak fizyolojik üç boyutlu (3D) bir hidrojel mikro çevrelerinde FRET görüntüleme hücreleri için bir yöntem sunulmaktadır. Aktivasyon aralığında doğrusal oranlarını verir oranlı metrik FRET probları için bir analiz anlatılmıştır.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

fret-imaging-in-three-dimensional-hydrogels

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.0K Görüntüleme.  University of Pittsburgh.  Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı hücre biyolojisi çalışmaları için güçlü bir araçtır. Burada alışılmış epifloresans mikroskopi kullanılarak fizyolojik üç boyutlu (3D) bir hidrojel mikro çevrelerinde FRET görüntüleme hücreleri için bir yöntem sunulmaktadır. Aktivasyon aralığında doğrusal oranlarını verir oranlı metrik FRET probları için bir analiz anlatılmıştır. 

Video: FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Biyomühendislik

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Gelişim Biyolojisi

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, function, and fate in general. Although increasingly more adherent cell types&#39; responses to matrix stiffness have been characterized, how adherent cells&#39; susceptibility to bacterial infection depends on matrix stiffness is largely unknown, as is the effect of bacterial infection on the biomechanics of host cells. We hypothesize that the susceptibility of host endothelial cells to a bacterial infection depends on the stiffness of the matrix on which these cells reside, and that the infection of the host cells with bacteria will change their biomechanics. To test these two hypotheses, endothelial cells were used as model hosts and Listeria monocytogenes as a model pathogen. By developing a novel multi-well format assay, we show that the effect of matrix stiffness on infection of endothelial cells by L. monocytogenes can be quantitatively assessed through flow cytometry and immunostaining followed by microscopy. In addition, using traction force microscopy, the effect of L. monocytogenes infection on host endothelial cell biomechanics can be studied. The proposed method allows for the analysis of the effect of tissue-relevant mechanics on bacterial infection of adherent cells, which is a critical step towards understanding the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria. This method is also applicable to a wide variety of other types of studies on cell biomechanics and response to substrate stiffness where it is important to be able to perform many replicates in parallel in each experiment.

We have developed a multi-well format polyacrylamide-based assay for probing the effect of extracellular matrix stiffness on bacterial infection of adherent cells. This assay is compatible with flow cytometry, immunostaining, and traction force microscopy, allowing for quantitative measurements of the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...