저자는 피츠버그, 건강 상 K01 AR062598의 국립 연구소 및 보조금 P30의 DE030740 대학의 치과 의학의 학교의 재정 지원을 인정합니다. 저자는 ImageJ에 매크로 ImageJ에 마이클 대화방을 개발하기위한 ICUE1 플라스미드 박사 진 장, 웨인 Rasband 감사합니다.

The authors have no conflicts to declare.

이 작품은 FRET 영상이 3D 하이드로 겔에서 세포 신호를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이전 연구 하이드로 겔 (38)와 세포 상호 작용의, 하이드로 겔 기판 35-37에 씨앗을 품고 세포의 FRET 영상을 시연하고, 하이드로 겔 39-41에 갇혀 분자 있지만,이 안에 포함 된 세포의 FRET 영상 기반 세포 분석을 서술 한 최초의 출판물입니다 3D 하이드로 겔. 2D에서 3D로 FRET 영상을 변환 할 때 작업은 몇 가지 구현 문제를 해결합니다. 먼저, 높은 개구 목적은 충분한 발광 신호를 수집 FRET 촬상 필요하지만, 필드의 깊이를 제한한다. 여기에서 세포는 다소이를 보상하기 위해, 유리 근처 초점면에서 세포의 수를 증가 통해 원심 침강된다. 둘째, 3 차원 하이드로 겔 지지체는 분석을 복잡 촬상시 시야에 걸쳐 드리프트 할 수있다. 하이드로 겔은 여기 COV 결합한erslip 그들은 실험을하는 동안 고정 된 상태를 유지하도록. 하이드로 겔은 세포의 가시화를 방해 할 수 있기 때문에 3 차원 FRET 적합한 하이드로 겔 조성물 셋째, 선택은 필수적이다. PC-젤 TR-겔 여기에 투명 하이드로 겔이 사용된다. 그러나, 커버 슬립 가까운 초점면 원심 분리로 세포를 수집은 하이드로 겔 diffraction.The 선택은 하이드로 겔 (42)의 리뷰에서 찾을 수 시뮬레이션해야 미세 환경 조건에 따라 그 이상 하이드로 겔의 이미지 셀에 사용될 수있다 . 넷째, 다른 계산은 단일 쇄 ICUE1 프로브의 FRET 비율 (즉, E QE = QE / CAEM)는 분석에 필요한 화상 채널의 수를 최소화함으로써, 광표백을 최소화하기 위해 여기에 사용된다. 셀당 평균 FRET 비율은 실제 FRET 비가 과소 평가를 최소화하기 위해 셀 내의 화소 당 비율의 평균으로 산출된다. 마지막으로, 선형 비율 적 분석 수단단일 쇄 이진 프로브의 활성 분획을 계산하는 것이 기재되어있다. 위드 현미경을 사용하여 성공적 FRET 실험을 수행하는 여러 가지 중요한 측면이있다. 하드웨어와 관련하여, 카메라는 새로운 과학 CMOS 카메라 및 CCD를 종래보다 더 적합한 전자 승산 CCD를두고 작은 신호 변화를 해결하기에 충분히 민감해야한다. 가장 FRET 비의 공간 분포를 분석하기 위해, 카메라는 최소 두 배의 대물 (나이 퀴 스트 기준)의 점 확산 함수의 공간 해상도를 가지고 있어야. 이 작업에 듀얼 뷰 시스템은 덜 적합하다. 더 중요한 형광 물질의 광표백을 최소화하기 위해 주어진 FRET 쌍 적절한 노광 및 이미지 획득 율을 선택한다. 감소 수집 속도는 실험 기간이 증가할수록 좋습니다. 빠른 필터 휠의 사용은 포착 율 분석하면서 피 용 영상 범위의 개수를 늘려듀얼 뷰와 터렛 필터 큐브와 이미지 등록 문제를 보내고. 불균일 조명 필드는 샘플 자기 형광 카메라 시스템 잡음에서 발생 배경 형광에 대한 정정을 복잡하게한다. 일부 히드로 겔은 특히 콜라겐 단백질을 함유하는 것을 43,44 매우 autofluorescent이다. 프렛 비율은 배경 보정없이 과소 평가한다. 여기에서는 주로 영상 (도 3b의 단계 7.2)의 중심 위에 에피 형광 조명으로 구성 할 수있는 비교적 평탄한 조명 필드에 의존하는 단순 배경의 보정 방법을 사용한다. 이 방법은 따라서이 조명 분야 내에서 그 관심의 세포를 제한합니다. 여기에 설명 된 배경 보정은 바이너리 프로브 읽기 파장 세포자가 형광을 고려하지 않습니다. 이러한 경우에, 표지 된 세포 (NO 프로브 형질) 감산 같은 조건으로 배경에서 묘화한다. m표지 및 표지 된 세포의 IX가 사용될 수 있고, 비 표지 세포 백그라운드 ROI 선택. 전체 이미지 필드 위에 세포 분석을 제공하는 다른 방법이 세포가없는 음영 마스크의 사용, 여러 배경 로아, 또는 동일한 샘플을 포함하는 프로토콜 요청에 따라 사용할 수 있습니다. 3D FRET 촬상 특정 프로브 응답은 분석 물질 (도 6)에 하이드로 겔 투과성에 매우 민감하다. 따라서 동일한 하이드로 겔 영역은 바람직 형상 대칭의 시점에서 이러한 여기에 사용 된 발판 센터 근처로, 실험적인 치료를 통해 비교된다. 다르게는, 미세 유체가 챔버 / 생물 신속하고 균일 검체 용액 (45) 하이드로 겔을 관류하는 데 사용될 수있다. 프렛 신호는 하이드로 겔의 형광도가 너무 높은 경우 (신호 대 잡음 비율이 너무 낮은 경우) 검출되지 않을 수있다; 얇은 하이드로 겔 또는 다른 프로브 (다른 형광체)를 사용한다.광 가교 하이드로 겔의 3D FRET 영상에 대해, 최소 방사선 노출과 프로브의 형광의 여기 스펙트럼 외부의 파장을 사용하는 것이 좋습니다. LAP는 또한 잠재적 인 세포 손상을 최소화 31,46 405 nm에서의 가시광 원으로 사용될 수있다. 이 프로브 표백을 최소화하기 때문에, 365 nm의 조사에 사용 LAP 권장합니다. 피크 여기에 놓여 405 내지 365 nm 인 반면는 CFP 공여체 여기 스펙트럼의 말미에있다. 대안 적으로, 프로브 식 하루 동안 회복하도록 허용 될 수있다. 이진 프로브의 사용은 발현 수준 및 도너와 억 셉터 형광 분자 확산에 차이가 감도 문제를 최소화한다. 비 이진 프로브를 사용하지만, SE 대신 여기 및 발광 스펙트럼 스펙트럼 블리드 스루에 대한 QE 이미징 및 추가 수정과 (아래 참조) 할 수있다. 또한, 저 상용화와 FRET 프로브 설계 복잡성방해가 될 수있다. 성공적인 실험에서 가장 중요한 요소는 형광 신호를 적절히 보정 분석 남아있다. 프렛 비율 대체 계산 광표백 최소화 외에 여러 추가적인 이유로 이용된다. 이진 단일 체인 프로브의 경우, 일반적으로보고 된 비율은 기증자 여기 (급냉 방출, QE), 즉 아래 기증자 방출에 기증자 여기 (증감 방출, SE)에서 수용체 방출은, 비 = SE / QE 25,47,48를 FRET. SE / QE는 FRET 효율 21,22,47의 변화에 비선형 상대적입니다. 즉, 비 프로브 (EI)의 고유 FRET 효율성 지수 함수의 비선형 관계를 갖는다 (Donius, AE, Taboas, JM 미발표 작품. (2015)), 작은 약 15 % 미만 에이 대한 비율 가장 직쇄. SE / QE는 활성화 된 프로브 (FAP, 즉, 분석을 결합 프로브의 부분)의 비율을 과소 평가합니다. Therefo다시는 SE / QE의 분석은 복잡 평형 복용량 응답 연구와 곡선 맞춤을 필요로한다. 다행히 수용체 여기에서 수용체 방출에 SE 또는 QE의 비율 (AEM)가 즉, 에이와 FAP,에 대하여 선형의 FRET 비율 SE / AEM 및 QE / AEM. SE / AEM은 종종 이진 프로브에 사용 전용 (프로브 활동 및 전체 프로브 활동에서) 엔드 - 포인트 보정이 필요하지만, 기저 세포 신호 전달이 곤란하게된다. 엔드 보정에 대한 필요성을 제거하기 위해, SE는 도너와 수용체의 여기 및 발광 스펙트럼의 스펙트럼 중첩 (스펙트럼 블리드 스루)과 결합 된 프로브의 형광과 현미경의 양자 수율 및 분광 감도 (QS)에 대해 (CSE) 보정 될 수있다 이미징 시스템. CSE에 기초하여 보정 SE FRET 비율, 즉 화상, E = SE CSE / AEM의 각 화소 내에서의 프로브 관측 FRET 효율성을 정의한다. 상업 및 자유 소프트웨어는 이러한 효과 SE를 해결하는 데 사용할 수 있으며독자는 방법 (50)에 대한 자세한 설명은 첸과 Periasamy 2006 년 작품이라고합니다. 그러나, E SE를 계산하는 시간 점 (SE, QE, AEM) 당 세 개의 영상 채널의 캡처가 필요합니다. 두 개의 영상 채널 캡처 (QE 및 AEM)가 필요합니다 QE / CAEM, - 따라서,이 연구에서 우리는 또한 다른 FRET 비율 E QE = 1을 사용합니다. 이러한 채널에서 E의 QE 계산 만 QS (CAEM = AEM은 QS를 X)에 대한 AEM 보정이 필요합니다. QS = 민주 / AEM 쉽게 민주는 수용체 표백와 기증자 여기에서 기증자 방출되는 하나의 교정 샘플에서이 이미지를 사용하여 추정된다. 임의의 순간에 FAP는 프로브의 에이 SE에 E 또는 E QE를 비교함으로써 계산 될 수있다. 결국 FRET 비 선택 (E QE = QE / CAEM 대 E SE = CSE / AEM)는 프로브 유형을 고려하여 최상의 신호 채널들에 기초한다. 모두시간이 지남에 따라 형광도의 변화를 계정에 전술 한 바와 같이 pproaches는 프레임 당 이미지의 배경 소음 보정을 포함한다. 그들은 종종 설계 현미경 필터 구성을 프로빙에 의한 경우가 민주 여기 스펙트럼으로 AEM 여기 광의 오버랩을지지 않는다. 단쇄 프로브 역시 사용할 수 있으며, 선택은, 카메라 잡음에 가장 프로브 신호 (밝기)과 SE 및 QE 채널의 배경 신호에 기초한다. ICUE1 프로브와 여기에 사용 된 실험 조건 (셀 하이드로 겔 타입)의 경우, SE는 QE보다 더 강한 신호를 가지고있다. 이중 쇄 프로브 인해 도너와 억 셉터 형광 비 등몰 분포 E SE의 사용을 필요로한다. 이러한 ICUE1으로 분석 결합에 FRET 감소 우리는 E SE = 1, 여기처럼 효율이 분석을 결합 할 때 긍정적 인 신호 변화를 제시하는 &quot;반전&quot;할 수 FRET 프로브 용 - CSE / AEM 나 E QE = QE / (AEM은 QS를 X). 일의 분석전자 FAP는 FRET 비율의 적절한 보정과 에이의 추정에 민감합니다. 그것은 QS에 사용 된 것과 같은 캘리브레이션 샘플 종래의 엔드 포인트와 FRET 추정 될 수 에이가 = 1- (QE 화상 수용체 광표백 및 민주 이미지 뒤에) 28 만, 치료가 취해 져야 (/ 민주이 QE)을 최소화하기 효율 분석 기증자의 실수로 표백. 우리는 QS 조정 AEM에 따라 민주의 추정, 치환 된 수정 된 버전을 설명 즉, 에이 = 1 - (QE /은 (AEM)는 QS X). 선택적으로, CSE = 에이 / AEM 사용할 수있다. 살아있는 세포의 에이의 평가는 모든 프로브 전체 FRET로 구동해야합니다. 이 분석 물을 결합에 FRET 감소 등 ICUE1 같은 프로브를위한 사실상 달성하기 어렵다. 세포 용 해물과 정제 분석을 사용하여 에이의 체외 기반으로 계산 최선이지만,이 작업의 범위 밖에. 여기에서 우리는 세포에서 캠프를 감소 2 &#39;, 5&#39;-Dideoxyadenosine를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 상대적으로 FAP가있다 ㄱ전자 신호의 기준 레벨로부터 유래 에이 추정을 사용하여 계산. 이러한 이유로, 연구는 대부분 작용제를 첨가하기 전에 시그널링 기준선 시그널링 포화 제 작용제를 첨가 한 후 하한 및 신호 인 엔드 보정에 기초하여 FRET 비 (여기 완료로) 또는 상대 FAP를 상부되어보고 경계. 포스 콜린 종종 된 cAMP 신호를 포화 제어 작용제로서 사용된다. 선택적으로, 캠프 유사체가 사용될 수있는 8- Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-시 클릭 모노 포스페이트 등. 실험적인 치료 사이의 신호 전달 경로의 잠재적 변화를 확인하는 연구의 완료에 사용 양성 대조군을 권장합니다. 셀 당 평균 신호 응답의 계산은 여러 가지 요인을 고려를 필요로한다. 우선, 평균 FRET 비율이 셀 내의 각 화소의 비율의 평균으로 계산한다, 즉 (Σ (QE/cAem)) / (화소 수) 대신 RA셀의 평균 QE 및 AEM, 즉, (ΣQE) / (ΣcAem)의 TIO. 배경 잡음이 낮은로 후자 조심 마스킹을 요구하지 않지만, 그것은 심각한 실제 평균 FRET 비가 과소. 그러나, 화소의 비율은 부동 소수점 계산과 ROI 영역을 정의하고 상기 셀 외부 배경 잡음으로부터 생성 된 스퓨리어스 비의 포함을 피하기 위해, 셀 영역의 바이너리 마스크주의를​​ 필요로한다. 셀 전체 영역이 셀 형상에 부세 결과를 피하기 위해 정량한다. 마스킹은 세포의 모양과 이동의 변화에​​ 따라 시간이 지남에 따라 재정의 될 필요가있다. 배타 기준이 QE 잘 세포 수준 미달 근처 배경 수준이다 AEM 신호로부터 화소 비율을 제거하도록 정의되는 경우, 또는, 상기 셀보다 큰 ROI를 사용할 수있다. 상기 된 분석 방법 세부 전문 소프트웨어 / 플러그인없이 FRET 분석을 위해 본 연구에 사용 된 기본 단계. 현미경 제조 업체 및 기타 업체는 추가 모듈 판매자동화 비율 계량을 지원하고 분석 FRET 자신의 현미경 소프트웨어에 대한의. 마찬가지로, 공개 ImageJ에 소프트웨어는 RiFRET 같은 입자와 FRET 분석을 위해 사용할 수있는 몇 가지 플러그인을 가지고 있습니다. 2 차원 화상이 사용되기 때문에 둘째, 픽셀 기반의 평균 FRET 비율은 3 차원 세포 구조의 실제 평균 비율을 과소. 2 차원 신호를 나타내고, z 축을 따라 평균. 생균의 FRET 비의 3 차원 공간 분포의 계산은 고속 3D 이미징없이 불가능하다 (예. 이용한 디스크 초점 현미경 회전). 이것은 2D 및 3D 배양 모두 문제이지만, 평면에서 존재하는 세포의 구조가 한층 더 차원에서 더 큰 효과를 갖는다. 이것은 세포막 EPAC1 프로브 PM-ICUE 같은 세포 구조에 지역화 프로브에 대한 큰 관심이다. Spiering 등의 알을 참조하십시오. 2,013에 대한 제안 비율 계산 (24)에 세포 두께 효과를 수정합니다. AEM의 분포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다프로브 조정 셀 및 이미징면의 지역에서 축적 경우 감지합니다. 이것은 또한, FRET 비의 공간 분포를 해석하는 스퓨리어스 결과를 제거하는 데 도움이 될 것 등., (낮은 AEM 영역이 낮은 프로브 농도가되며, 프로브 포화 높은 FRET 비를 나타낼 수있다 IE) 프로브 채도를 식별. 셋째, 다른 FRET 기준선 수준은, 형질 감염 효율의 차이를 나타내는 실험군 사이 발현 또는 기저 시그널링을 조사 할 수있다. &quot;상대 분석&quot;(단계 10.1.1)가 존재하는 경우 시간이 지남에 따라 FRET 비율 드리프트를 제거하는 데 도움이됩니다. 이 샘플 사이의 반응의 상대적인 크기의 비교를 용이하게하지만, 기준 샘플에 대한 응답 (제어 플롯 평면 라인)의 타임 코스에 비해을 방해. &quot;절대 분석&quot;(단계 10.1.2) 샘플 전체 응답 속도의 비교를 용이하게하지만, 각 라인은 dissim 의해 스케일링 때문에 반응의 크기를 비교하여 방해ILAR 정수입니다. 연구는 종종 시간이 지남에 따라 FRET 비율의 편차를 보정하는 기준에 선형 회귀 분석을 사용한다. 설명 된 3D FRET 방법은 제조 및 다른 프로브와 영상 방식에 적용 할 수있는 3 차원 셀 라덴 하이드로 겔의 경과 이미징을 수행하기에 유용하고 실용적인 방법이다. 전술 한 바와 같은 단일 쇄 이진 프로브 이외에 다른 FRET 시스템은 강도 계 신호의 더 복잡한 보정이 필요하다. 선택적으로, FRET (FLIM-FRET)의 형광 수명 이미징 프로브 도너의 발광 수명의 변화를 통해 FRET 효율을 계산하기 위해 사용될 수있다. 강도 기반의 FRET는 달리, FLIM-FRET은 배경 잡음 스펙트럼 블리드를 통해, 양자 효율 및 검출기 분광 감도 2에 민감하다. 그러나, FLIM 시스템은 고가의 복잡한, 그리고 드문 일이며, 하나의 지수 부패와 형광없이 FLIM 49 실행 - 오프에서 가장 잘 작동합니다. 설명 된 방법은 MO와 함께 사용될 수있다고급 현미경 플랫폼 재 (예., FRET-TIRF, 형광 이방성 및 스펙트럼 상관 FRET). 고속 공 초점 및 다 광자 현미경으로 3 차원 영상이 방법을 적용하는 시그널링 응답 서브 세포 분포의 분석을 용이하게 분석 신호의 정확성을 증가시킬 것이다. 이 3D FRET 방법은 시뮬레이션 3D 세포 미세 환경에서 고급 세포 생물학 연구를 가능하게 할 것이다. 이와 같이, 용이 약리학 및 세포 간 신호 전달 연구 및 설계 하이드로 기반 microtissues 약물 반응을 포함한 선별 재생 의료 요구에 적용 할 수있다.

셀룰러 신호는 복잡하고 약리학, 조직 공학, 재생 의학 등 다양한 분야에 대한 필연적 모두이다. 유용한 임상 도구는 세포 생물학에 대한 우리의 이해를 촉진하고 조직 재생을위한 최적의 재료를 개발하기 위해 필요하다. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 이미징 수용체 활성화 분자 형태 및 생균의 초분자 상호 작용 (예., 단백질 / DNA 착화)의 분석을 가능하게하는 중요한 도구이다. FRET는 형광 물질 (1) 사이 비 복사 에너지 전달의 유형이다. 이 도너 형광 물질 및 형광 수용체 사이의 거리의 여섯 번째 전력에 반비례 효율을 갖는다. (- 10 nm의 통상적 1) 2 따라서, 나노 미터 크기의 두 개의 다른 분자 사이 또는 한 분자의 영역에 걸쳐 공간적 거리 정보를 제공 할 수있다. 기증자 및 수용체 형광 다른 m 할 수있다olecule 타입 도너는 높은 에너지 방출 (단파장)가있는 (헤테로 FRET), 또는 같은 형태의 (호모 FRET). FRET 영상은 고정 또는 살아있는 세포에서 수행 할 수 있지만, 고속 촛점 시스템을 사용할 때 일반적으로 고정 된 세포는 높은 공간 해상도에서 분자 상호 작용의 영상화에 사용된다. 생균 등의 반응 3 시그널링 실시간 세포 등의 억제 나 고정에 의해 변경되는 상호 작용과 프로세스를 연구하기 위해 사용된다. 채용 생균 연구 때문에 간단하고 낮은 배경 (평면 세포 밖으로 방출에서 아니오)의 일부 촬상 사용을 2 차원 세포 배양 FRET. 그러나, 2 차원 배양은 생리적 및 미세 3 차원 배양 4,5- 비해 다양한 세포 과정을 변경. 예를 들어, 세포 외 기질 상호 작용에 셀과 셀 기본 셀은 크게 EAS에 이르는 2D 문화에 변경된다ILY는 세포 형태와 극성 (6)의 변화를 관찰했다. 그들은 골격 성분 7,8과 셀 형상 및 골격 구조가 강하게 공간 배양 환경 (9)에 의해 규제되는 결합 때문에 막 마이크로 도메인 (예., 카베 올래 지질 래프트) 및 수용체 신호 강하게 부분적 배양 환경에 의해 조절된다. Mechanotransduction은 3 차원 매트릭스에 의해 좌우되지만보다 복잡한 차 적재 상태로 2 차원 배양 물 (10)에 비해 3 차원 환경에서 생기게하지 않는다. 마지막으로, 3 차원 매트릭스의 투과​​성은 확산을 감소 차원 배양에 비해 신호 분자 세포의 결합을 증가와 함께, 일반적으로 배지 미만이다. 3D를 배양 한 접착제, 화학적 및 기계적 큐에 대한 생리적 더 유사한 미세 환경을 생성하고 관찰 할 수있다. 전지 셀 상호 작용을 촉진 할 수 있고, 접착 특성 w를 제어 할 수있다차원 재료 11-13의 구조 조성, 및 구조 (패터닝) 번째. 재료의 기계적 특성을 마찬가지로 조성 및 구조 (14, 15)에 의해 조정될 수있다. 하이드로 겔에서 세포를 배양 따라서 허가 그렇지 않으면 해제 차별화 것이 일차 전지 또는 기존 기술을 사용하여 표현형의 변화, 예에 대한 연구를 FRET., 관절 연골의 세포를. 따라서, 방법은 라이브 3D 배양에서 FRET 분석을 가능하게하는데 필요하다. 그들은 광학적으로 투명하게하고, 미세 제어하는​​ 셀룰러 신호를 제공하도록 맞추어 질 수 있으므로 하이드로 겔 지지체는 3D FRET 기초 연구에 적합하다. 천연 고분자로 만든 하이드로 겔은 젤라틴과 섬유소 (16)를 포함하여 수십 년을위한 세포 배양에 사용되어왔다. 세포 미세 환경을보다 컨트롤이 고분자의 화학적 변형과 합성 고분자 (17, 18)의 사용으로 달성 될 수있다. HYDR기계적 강성 ogel 투자율들은 폴리머 조성을 변화시킴으로써 제어 할 수 있고, 사이즈 (중합체 및 가교 밀도) 19, 20 메쉬. 또한, 하이드로 겔은 성장 인자 및 세포 리간드의 결합을 통해 생리 활성을 할 수있다. 때문에 이러한 가능성을, 바이오 센싱, 약물 전달 및 조직 공학 응용 프로그램에 대한 하이드로 겔의 개발 연구 (21)의 매우 활동적인 영역이다. 하이드로 겔의 3D 프린팅은 미세 조직의 제조를 위해 개발을 진행하고 15 -organs된다. 따라서, 하이드로 겔의 셀 FRET 촬상 생리적 셀룰러 동작을 근사화하는 수단으로서 유용하지만, 또한 연구 및 설계 조직 성장을 최적화하기위한 도구로써뿐만 아니라. 이진 비율 적 FRET 프로브는 셀룰러 신호를 연구하는데 유용하며, 하이드로 겔 배양에 활용 될 수있다. 게시 된 형광의 일부 목록 및 프로브를 FRET, 셀 마이그레이션 컨소시엄 웹 사이트를 참조하십시오 <sup&gt; 22. 가장 일반적인 프로브 타입은 인식 요소 (들) (피검 감광 영역)에 의해 연결된 또는 연결되어있는 두 개의 서로 다른 형광 물질을 포함한다. 이들 영역은 형광 따라서 FRET 크기 (높거나 낮은) 사이의 거리를 변경한다 (이온 또는 분자의 영역의 효소 분해의 결합 예). 분석 물질의 검출시에 형태 적 변화를 연결 또는 연결 해제를 거쳐 23. 덜 일반적인 아직 유용 프로브 유형은 FRET의 크기를 변경하는 두 형광의 스펙트럼 중첩의 분석 민감한 변화에 의존한다. &quot;단일 쇄&quot;비율 적 프로브는 단일 분자에 연결된 형광 쌍을 이용한다. &quot;이중 쇄&quot;프로브는 개별 분자에 형광 쌍을 이용하지만, 그 표현은 동일한 발현 카세트 (24) 아래에 연결될 수있다. 단일 형광 식 연구 (예., 형광 융합 단백질), 연구 비율 적으로 달리FRET 프로브는 형질 전환 효율 또는 세포 생존에 대한 제어 이중 형질 전환이 필요하지 않습니다. 최소 임계 값 (문자를 구분 농도) (23, 25) 위의 표현하면 비례 FRET 프로브는 형질 전환 효율이 상대적으로 문자를 구분하지 않는다. 그들은 여기 소스 변동 및 기타 세포 내 환경 요인 (예., 산도, 이온) 너무 오래 두 형광 유사하게 반응하는로에 민감하다. 형광체 및 발광 생물 프로모터 리포터 (26, 27)를 구성 달리 또한, 이들 반응은 전사 지연을받지 않는다. 비례 FRET 프로브는 쉽게 자주 위드 종래의 표면 형광 현미경 시스템에 사용된다. 위드 현미경 때문에 시스템 비용, 형광 표백, 충분한 시간 해상도와 신호 변경의 캡처에 대한 우려의 라이브 세포 이미징을위한 라인 스캔 공 촛점 시스템에 비해 바람직하다. 또한, 단일 세포 항문세포의 큰 인구 이상이 Analysis보기의 여러 분야에 걸쳐 전동 무대 및 이미지 캡처 가능합니다. 위드 현미경은 이종 FRET 프로브 신호의 강도를 기반으로 분석을 필요로한다. 강도의 분석은 FRET 다른 방법과 같은 복잡한 하드웨어를 필요로하지 않지만,보다 취득 후 작업은 형광 현미경 동작 및 / 영상 시스템 구성 (28)의 영향을 보정하기 위해 필요하다. 형광의 촬상 발광 강도의 여기 에너지의 함수, 형광 양자 수율 및 결합 필터 및 카메라 / 검출기 분광 감도 및 선형성이있다. 이러한 도너 및 수용체에 대한 이종 수 있고, 정량 분석​​을 위해 교정을 필요로한다. 또한, 억 셉터 발광 이미징 (도너 여기 광에 의해 수용체의 여기 및 블리드 스루 도너 발광을 수용체에 발광 스펙트럼)을 형광체의 스펙트럼 오버랩에 의해 영향이.4, 단일 체인 이중 체인 &quot;프로브 셀 25, 28을 통해 다른 화학 양론에 존재할 수있는 경우의 형광.&quot; &quot;프로브의 형광이있는 동안, 자신의 형광체는 나노 스케일에서 몰 있기 때문에 내부적으로 정규화&quot;단일 체인 &quot; 프로브는 유사한 밝기 (흡광 계수 및 양자 수율의 작용), 비선형 검출기 감도의 효과는 배경 형광 (23)을 필요로하는 접속의 양자 수율 / 검출기 감도 작은만을 보정이다의이다. 따라서, &quot;단일 쇄&quot; 비율 계량 FRET 프로브는 쉽게 위드 현미경 (24)에서 구현됩니다. 본 논문은 기존의 위드의 epifluorescent 현미경을 사용하여 3D 하이드로 겔 문화의 살아있는 세포의 FRET 이미징을 수행 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 쉽게 이미 2D에서 FRET 실험뿐만 아니라 간에 관심이 실험실을 수행하는 실험실에 의해 채택 될 수있다microtissues에서 세포 신호. 여기서 우리는 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 광 가교 내의 실제 연골 세포의 레벨 (PC 겔, 폴리에틸렌 글리콜 디 메타 크릴 레이트)와 thermoresponsive (TR-겔, 마트 리겔) 하이드로 겔의 FRET 촬상 계와 측정 방법을 보여준다. 율 비교 FRET 프로브는 포스 콜린, 캠프 ATP의 전환을 촉매 아데 닐 레이트 사이 클라 제에 대한 화학 작용제에 대한 응답의 cAMP 수준을 검출 EPAC1 (ICUE1)에 기초하여 이용된다. 캠프는 G 단백질 결합 수용체의 신호 전달을 매개하는 주요한 두 번째 메신저 중 하나이며 직접 캠프 (EPAC를)에 의해 활성화 하류 교환 단백질 등 다양한 요소를 활성화합니다. 형광 캠프는 FRET의 감소의 결과로 EPAC 도메인에 바인딩에 떨어져 이동합니다. 3D 하이드로 겔의 셀의 하이드로 겔 물질의 제조 상기 ICUE1 프로브가 세포 형질 전환 및 매립은 여기에서 설명한다. 차원 FRET 실험 절차 및 필요한 이미지 분석셀 당 프로브 활동이 설명되어 평가한다. 우리는 또한 위드 현미경을 사용하여 2D 및 3D에서 FRET 분석의 본질적인 한계에 대해 설명합니다. 그것보다 생리적 환경에서 분석을 가능하게 적은 화상 보정 및 교정을 필요로하기 때문에 여기에 제시된 기술은 기존의 2D 방식에 비해 개선 된 것이다. 그레이트 유틸리티 셀 형질 환경이 유지 될 수 있지만 많은 투명 재료가 이용 될 수 있다는 사실에있다.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td><td>Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td><td>NC0162601</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM)</td><td>Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>3-glycidoxypropyltrimethoxysilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440167</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Dimethyl Phenylphosphonite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC244280100</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2-Butanone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Lithium Bromide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Sigmacote (siliconizing reagent)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Toluene&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3025601</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent)</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Cellstripper (cell dissociation solution)</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Pipette Tips (10,200,1,000 &amp;mu;l)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Powder Free Examination Gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Biopsy punch (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Precoated glass coverslips (epoxysilane)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Sterile vials (15 ml, 50 ml conical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Cell culture dish (6-well)</td><td>Falcon</td><td>351146</td><td>Disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Epifluorescent Microscope with motorized stage</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Adjustable Specimen Holder for XY Stage</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source &amp;amp; wheel, Lambda emission filter system)</td><td>Nikon (Sutter Instrument reseller)</td><td>77016231, 77016088</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>CYF/YFP filter set</td><td>Nikon (Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Camera (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu reseller)</td><td>77054076</td><td>Non-disposable lab-equipment</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 microscope software)</td><td>Nikon</td><td>MQS31100&amp;nbsp;</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Prism (spreadsheet and graphing software)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Version 6</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (&amp;lambda; = 365 or 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Pipette Aid&amp;nbsp;</td><td>Drummond Scientific Co.&amp;nbsp;</td><td>DP-100</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Vacuum desiccator chamber/degasser&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Chemical Fume Hood&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Any</td><td></td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Any</td><td></td><td>Non-disposable lab equipment</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Large/non-disposable lab equipment</td></tr></tbody></table>

fret imaging in three-dimensional hydrogels

포스터 공명 에너지 전달 (FRET)의 영상은 실시간으로 세포 생물학을 검사하기위한 강력한 도구이다. FRET을 이용한 연구는 일반적으로 3 차원 (3D) 세포 미세 환경을 모방하지 않고 2 차원 배양을 사용한다. 차원 겔 환경 내 세포의 위드 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 켄칭 발광 FRET 이미징을 수행하는 방법이 제공된다. 여기서 프로브 활성화 범위 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석 방법을 설명한다. 세포 내 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 수준의 측정은 EPAC1 활성화 (ICUE1)과 하이드로 겔 재료의 종류, 본원 광 가교 하이드로 겔 (PC - 겔법에 따라 시그널링 된 cAMP의 차이를 검출 할 수있는 능력에 대한 프로브를 사용하여 포스 콜린 자극 하에서 연골 세포에서 증명되고 폴리에틸렌 글리콜 디 메타 크릴 레이트)와 thermoresponsive 하이드로 겔 (TR-GEL). 2D FRET 방법과 비교하여,이 방법은 약간의 추가 작업이 필요합니다. 이미 2d에 FRET 영상을 이용하여 실험실 쉽게 3 차원 미세 셀에 대한 연구를 수행하기 위해이 방법을 채택 할 수있다. 이것은 더 설계 차원 microtissues 높은 처리량 약품 스크리닝에 적용될 수있다. 또한, 이러한 이방성 측정 및 형광 수명 이미징 (FLIM)과 같은 고급 공 초점 현미경을 사용하여 플랫폼 펄스 또는 변조 된 조명 FRET 촬상 다른 형태와 호환 가능하다.

모든 하이드로 겔 전구체 세포, 주조 주형은 전술 된 바와 같이 제조 하였다. 셀 라덴 전구체 용액이 PDMS 몰드에 캐스팅 한 후 커버 슬립 근처 세포를 고정 및 FRET 분석을 촬상 (도 1)을 용이하게하기 위해 광 가교 / 겔화 전에 원심 분리 하였다. 부착 된 커버와 함께 하이드로 겔은 현미경 영상 (그림 2)에 대한 준비 PDMS 영상 우물 안에 넣었다. 도 3a에 도시 된 바와 같은 광학 구성 및 화상 획득 파라미터는 설정 하였다. 비 바이너리 프로브 필요로 CFP-YFP의 형광 쌍에 대한 네 FRET 관련 이미지 채널 캡처 (아래 참조 &quot;광 컨퍼런스.&quot;그림 3) 증명된다. 그러나이 연구에서 두 이미지는 하나의 체인 진 ICUE1 프로브, QE = &quot;CFP CFP&quot;및 AEM = &quot;YFP YFP&quot;(여기 방출)이 필요합니다. 여러 영상 범위 (XY 위치들)은 여러 세포가 균일 한 조명 영역 (그림 3B) 내에 거주하는 선정되었다. 시간 경과 취득 후, 프로브에 대한 신호 데이터를 반출 하였다. 로아 채널 신호의 백그라운드 보정 및 세포 분석은 실험 (도 4)의 개시로부터 역치 AEM 이미지를 사용하여 지정 하였다. 세포를 발현하는 것과 셀 풀 중에서 선택되며 충분한 (너무 어둡되지 않음)하지만, 너무 높게하지 (지나치게 밝은) 프로브 (도 4b). 각각의 획득에서 화소 당 QE 및 SE FRET 비율은 배경 화상 감산 채널 부동 소수점 나눗셈을 이용하여 계산 하였다. 셀당 평균 FRET 비율 (즉, ROI마다) 계산 된 자극에 앞서 기준 신호에 대한 정규화 된 (즉, 모든 시간 포인트로부터 감산 기준선에 회귀)과의 표준 오차로서 오차 막대 플롯 의미 (SEM). 양적 완화와 CSE 기반의 FRET 비율 드 두포스 콜린 자극 (100 nm의, 그림 5)에서 연골 세포의 증가 캠프 활동을 TECT. QE 신호 때문에 하이드로 겔 내에 포함 된 연골 세포에서의 cAMP 활성의 낮은 기저 수준으로 낮았다 때문에 QE FRET 비율은 CSE FRET 비율보다 배경 보정에 더 민감했다. 두 유형의 하이드로 겔 (TR 겔 및 ​​PC-겔) 포스 콜린의 첨가로 증가 된 cAMP 신호 응답을 나타내는 시간 경과 FRET 비율의 증가 (도 6)를 보였다. 양적 완화 FRET 비율로 나타낸 바와 같이, PC-겔 히드로 겔의 연골 세포는 캠프에 큰 변화 (도시) 및 캠프 (E QE의 높은 기저 수준을 보여 = E QE = TR-젤 0.09 대 PC-젤 0.19, ) 기본 공제 도시하지 않음. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> 그림 1 : 광 가교 하이드로 겔 (PC - 겔)에서 셀 배포 </강한&gt; A : 셀 라덴 하이드로 겔 전구체는 커버 슬립에 가까운 초점면에서 세포의 수를 최대화하기 위해 원심 분리 하였다. B :이 FOV에서 세포의 수를 증가시키고 평면 세포 밖에서 배경 신호를 최소화한다. (스케일 바 = 200 μm의)는 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> 그림 2 : PDMS 접시에 히드로 겔 하이드로 겔은 현미경 이미징 및 분석 자극에 대한 커버 슬립베이스와 높이 PDMS 잘 (하이드로 겔의 10 배 부피) 내부에 배치했다. 그들은 상기 분석 내내 그대로 유지되도록 PC 하이드로 겔은 투명 커버 슬립 결합된다. PDMS의 잘에서 외에 넓은 생검 펀치를 사용하여 하이드로 겔 부피보다 10 배 이상의 매체를 포함하고 크게 할 수있다hicker PDMS 시트. (스케일 바 = 2mm)는 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> 그림 3 : FRET 이미지에 대한 수집 구성 A : 인수는 여러 위치에서 이미지 캡처 매 7 초 구성되었습니다. QE FRET 비율 계산, 두 영상 채널은 아래 여기서 사용 ICUE1 프로브 (이진 단일 쇄 프로브), QE는 = &quot;CFP CFP&quot;및 AEM = &quot;YFP YFP&quot;(여기 발광)에 필요한 &quot;광 논문집.&quot; 현미경 소프트웨어의 λ 탭에서 열입니다. B : 영상 범위 ( &quot;XY&quot;위치는) 여러 세포가 균일 한 조명 영역 내에 거주하는 선정되었다. 이미지 아래 그래프는 청색 따라 조도 라인을가는 화살표 도시즉 FOV의 중심을 통과. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> 그림 4 : FRET 영상 분석을위한 로아의 선택 A : 셀의 자유 ROI (region of interest)를 각 채널에 대한 배경 신호를 수정하기 위해 선택되었다. 무 세포 겔의 이미지 대신에 세포 밀도 나 마이그레이션이 높은 경우, 또는 세포가 균일 한 조명 필드 내에 있지 않은 경우에 차광 마스크를 사용하지 않는 경우에 배경 차감을 위해 사용될 수있다. B : 셀 로아가 이미지 임계 값 및 AEM 채널의 이진 마스크​​를 사용하여 선택 하였다. 때문에 배경 N에서 생성 된 세포 외 비의 포함에 악영향 셀 당 평균 FRET 비율의 계산에 영향을 미칠 세포보다 큰 투자 수익 (ROI)을 선택OISE. 이 비율을 과소 평가로 셀 당 각 채널의 평균을 사용하여 휴대 FRET 비율의 계산은하지 않는 것이 좋습니다. (스케일 바 = 50 μm의)는 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> 그림 5 : Thermoresponsive 히드로 겔 (TR-겔)에서 FRET 비율의 비교 QE 및 SE 기반의 FRET 비율 모두 포스 콜린 자극에서 연골 세포에서 증가 캠프 활동을 감지합니다. 포스 콜린 캠프 생산을 유도 아데 닐 레이트 사이 클라 제 작동 제이다. ICUE1 프로브는 캠프를 결합 할 때 FRET가 감소하고, 따라서 QE FRET 비율 (E QE = SQE / (SAEM은 QS를 X)) 증가한다. 반대로, SE FRET 비율은 감소하고, 따라서 E SE = 1로 플롯 - CSE / SAEM. 하이드로 겔 포함 된 연골 세포에서, QE FRET 비율이 낮기 때문에 기저 캠프 액티비티 SE FRET 비율보다 배경에 정사 QE 신호가 낮기 때문에 더 민감하다. 오류 바 = SEM, N = 25 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> 그림 6 : 다른 히드로 겔의 FRET 비율의 비교 모두 하이드로 겔 타입의 연골 세포는 시간이 지남에 따라 증가 된 QE FRET 비율에 의해 입증 된 바와 같이 cAMP를 활성의 증가 포스 콜린 자극에 반응. 하이드로 겔 형태의 영향 포스 콜린 및 기저 세포의 cAMP 활성 투과성의 차이 등 여러 가지 효과를 통해 세포 반응 (E QE = E QE 대 PC 겔 0.19 = 0.09 TR 겔에서 도시 생략). 오류 바 = SEM, n은 TR-젤= 25, n은 PC-젤 = (15)는 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.0K 조회수.  University of Pittsburgh.  포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다. 

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

연구

생체공학

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

발생학

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, function, and fate in general. Although increasingly more adherent cell types&#39; responses to matrix stiffness have been characterized, how adherent cells&#39; susceptibility to bacterial infection depends on matrix stiffness is largely unknown, as is the effect of bacterial infection on the biomechanics of host cells. We hypothesize that the susceptibility of host endothelial cells to a bacterial infection depends on the stiffness of the matrix on which these cells reside, and that the infection of the host cells with bacteria will change their biomechanics. To test these two hypotheses, endothelial cells were used as model hosts and Listeria monocytogenes as a model pathogen. By developing a novel multi-well format assay, we show that the effect of matrix stiffness on infection of endothelial cells by L. monocytogenes can be quantitatively assessed through flow cytometry and immunostaining followed by microscopy. In addition, using traction force microscopy, the effect of L. monocytogenes infection on host endothelial cell biomechanics can be studied. The proposed method allows for the analysis of the effect of tissue-relevant mechanics on bacterial infection of adherent cells, which is a critical step towards understanding the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria. This method is also applicable to a wide variety of other types of studies on cell biomechanics and response to substrate stiffness where it is important to be able to perform many replicates in parallel in each experiment.

We have developed a multi-well format polyacrylamide-based assay for probing the effect of extracellular matrix stiffness on bacterial infection of adherent cells. This assay is compatible with flow cytometry, immunostaining, and traction force microscopy, allowing for quantitative measurements of the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

면역학 및 감염병학

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...